Sintesis peptida pada fase padat, yang paling sering disebut dengan SPPS (solid-phase peptide synthesis), adalah metode kimia untuk membangun peptida dari asam amino satu demi satu, sedangkan ujung rantai yang terbentuk tetap terikat secara kimiawi dengan media non-larut.
Alih-alih mengisolasi peptida yang terbentuk setelah setiap reaksi, para ahli kimia menyimpannya dalam fase padat, memasukkan dan mengeluarkan pelarut cair yang berbeda satu demi satu. Siklus yang berulang memungkinkan untuk menemukan kelompok amino yang reaktif, menempelkan asam amino berikutnya, dan menghilangkan komponen yang larut yang tidak lagi diperlukan. Setelah membangun rangkaian asam amino yang direncanakan, peptida dapat dilepas dari media pelarutnya dan kemudian diproses lebih lanjut serta dianalisis.
Organisasi proses seperti ini adalah salah satu alasan utama mengapa SPPS menjadi metode yang sangat penting dalam kimia peptida. Fase tetap mempermudah pelaksanaan banyak operasi kimia yang berulang-ulang dan memungkinkan otomatisasi sintesis.
Namun, kenyamanan sintesis pada fase konstan tidak menjamin keunggulan secara kimiawi.
Penambahan peptida yang sedang terbentuk ke dalam media tidak menjamin bahwa setiap rantai akan menerima semua asam amino yang telah direncanakan. Hal ini juga tidak berarti bahwa materi yang terlepas pada akhir proses akan bersifat kimiawi bersih atau memiliki struktur yang benar.
Pembuatan rantai, pencabutan dan pemulihan produk, pembersihan, verifikasi identitas, dan karakteristik struktural akhir adalah bagian-bagian terpisah dari seluruh proses tersebut.
Publikasi metodologis modern menunjukkan baik kegunaan SPPS maupun perlunya modifikasi metode standar dalam kasus urutan yang sulit. Dalam salah satu metode yang dipublikasikan yang menggunakan strategi Fmoc, misalnya dijelaskan sintesis rutin, tetapi juga pendekatan dimodifikasi terhadap urutan peptida yang rentan terhadap agregasi. [1]
Untuk memahami SPPS, Anda memerlukan lebih dari sekadar mengingat langkah-langkah kimia berikutnya. Anda juga perlu mengetahui tujuan dari setiap langkah tersebut, apa yang dapat salah selama proses tersebut, dan pertanyaan-pertanyaan analitis apa yang masih perlu dijawab setelah proses tersebut selesai.
Apa itu sintesis peptida pada fase padat?
Peptida yang terbentuk tetap terikat, sedangkan larutan berubah.
Dalam SPPS konvensional, peptida secara kimiawi diikat pada partikel kecil yang tidak larut, yang biasa disebut sebagai butiran resin, dengan menggunakan pengikat kimia yang sesuai.
Butiran tetap berada dalam sistem reaksi, sedangkan cairan reagen dan larutan yang mengalir selanjutnya dimasukkan dan dikeluarkan.
Ini sangat memudahkan sintesis yang berulang-ulang.
Dalam sintesis klasik bertahap, isolasi dan pembersihan peptida yang sedang berkembang setelah setiap penambahan asam amino dapat menjadi merepotkan. Dalam SPPS, rantai yang terbentuk tetap terikat pada fase yang tidak larut. Dengan demikian, kelebihan zat pereduksi yang larut dan banyak produk sampingan dapat dihilangkan melalui pembersihan, sedangkan peptida yang terikat dengan resin tetap berada di tempatnya.
Namun, penggunaan istilah „fase konstan” dapat menyebabkan kesalahpahaman.
Hal ini tidak berarti bahwa pembentukan ikatan peptida terjadi tanpa adanya cairan atau pelarut.
Karet biasanya dikelilingi oleh lingkungan reaktan cair, dan interaksinya dengan pelarut dapat sangat mempengaruhi proses sintesis. Reagen masih harus bergerak dalam atau di sekitar lingkungan polimer dan mencapai tempat-tempat reaktif dari peptida yang sedang berkembang.
Penyerapan peptida ke dalam pembawa biasanya bersifat kovalen. Ini berarti bahwa molekul yang terbentuk terikat pada pembawa melalui ikatan kimia.
Peptida tidaklah hanya terperangkap di antara partikel, terhalang oleh filter atau terendapkan secara longgar di permukaan.
Kombinasi kimia ini secara sengaja dirancang sedemikian rupa sehingga rantai yang terbentuk tetap terikat selama reaksi dan tahap pembersihan berikutnya, dan kemudian dapat dilepaskan dalam kondisi yang tepat.
Sintesis konvensional berlangsung dari ujung C ke ujung N.
Strategi liniar klasik SPPS biasanya dimulai dengan asam amino yang akan menjadi ujung C-nya dalam peptida yang sudah jadi.
Sisanya akan dimasukkan ke dalam media tersebut.
Setelah kelompok amino reaktif yang sesuai terdeteksi, asam amino yang terproteksi berikutnya dimasukkan dan secara kimiawi terikat pada rantai yang terbentuk. Proses ini berulang secara bertahap sehingga peptida tersebut memanjang menuju ujung N-nya.
Perlu ditekankan bahwa arah ini berbeda dari sintesis protein biologis melalui ribosom.
Sintesis ribosomal memperpanjang polipeptida dari ujung N ke ujung C. Tahap SPPS konvensional biasanya membangun rangkaian dalam arah yang berlawanan.
Namun, urutan asam amino akhir mungkin sama. Namun, cara pembentukannya berbeda.
Yang penting di sini adalah istilah „konvensional”, karena kimia peptida juga mencakup strategi-strategi khusus yang memanfaatkan tempat-tempat ikatan alternatif, pengikatan fragmen, reaksi ligasi, dan solusi-solusi nonstandar lainnya.
Deskripsi arah dari ujung C ke ujung N mengacu pada proses SPPS yang khas, bukan pada semua metode kimia peptida yang memungkinkan yang menggunakan fase tetap.
SPPS hanyalah salah satu komponen dalam produksi peptida.
Sintesis pada fase konstan bukanlah satu-satunya cara untuk mendapatkan peptida.
Peptida juga dapat diperoleh melalui sintesis kimia dalam larutan, sistem ekspresi biologis, transformasi enzimatik, ligasi fragmen, atau kombinasi dari berbagai metode.
SPPS sangat berguna ketika diperlukan pengiriman sekunder yang terkontrol serta penggunaan blok bangunan asam amino yang aman, dimodifikasi, atau secara khusus dirancang.
Bahkan dalam satu proyek yang berkaitan dengan satu peptida tertentu, tidak selalu perlu menggunakan metode yang sama dari awal sampai akhir.
Bagian-bagian peptida tertentu, misalnya, dapat disintesis pada polimer, dipisahkan secara terpisah, dan kemudian dihubungkan dengan metode kimia lainnya. Bagian-bagian lain mungkin memerlukan pengelasan, oksidasi, siklasi, atau perubahan struktural tambahan setelah mendapatkan rangkaian linear awal.
Pilihan jalur yang tepat bergantung pada molekul target, kompleksitas strukturalnya, serta persyaratan analitik dan kualitatif dari proyek tersebut.
Proses ini patut dipandang sebagai serangkaian pertanyaan berikutnya.
Penambahan ke media menentukan titik awal dan mempengaruhi kimia pelepasan produk di kemudian hari. Namun, masih harus ditentukan apakah penambahan tersebut terjadi dengan benar dan apakah integritas stereokimia tetap terjaga.
Penghimpunan rantai harus mengarah pada pengikatan asam amino sesuai urutan yang telah direncanakan. Namun, selanjutnya perlu diperiksa apakah semua rantai bereaksi dengan benar dan apakah tidak ada rangkaian yang terbentuk yang tidak mengandung asam amino yang hilang, produk yang dipangkas atau dimodifikasi.
Pemisahan dan penghapusan kelompok pelindung bertujuan untuk melepaskan peptida dan menghilangkan perlindungan kimia tertentu. Namun, efektivitas pemisahan produk tersebut tidak menentukan zat-zat lain yang terdapat dalam bahan baku tersebut.
Pengolahan bertujuan untuk memisahkan bahan yang diinginkan dari bahan-bahan yang tidak diinginkan, tetapi bahkan fraksi yang sudah bersih masih memerlukan verifikasi identitas dan penilaian kualitas.
Sementara itu, karakteristik struktural dan analitik akhir memiliki tujuan untuk menjawab pertanyaan apakah bahan yang terisolasi memiliki sifat kimia yang diharapkan untuk peptida target dan apakah metode analisis yang digunakan sesuai dengan kegunaan yang dimaksudkan.
Ini adalah langkah-langkah konseptual, bukan instruksi laboratorium. Bahan reagen, peralatan, dan kondisi reaksi yang spesifik tergantung pada peptida yang ditargetkan dan memerlukan metode yang dirancang dan divalidasi secara tepat.
Menempel pada resin dan menyusun rantai
Lem, pengikat, dan tingkat pengelasan memiliki fungsi yang berbeda-beda
Dalam diskusi mengenai SPPS, sering muncul tiga istilah: resin, pengikat, dan tingkat pengisian, atau loading.
Mereka menggambarkan sifat-sifat yang terkait namun berbeda.
Karet adalah bahan yang tidak larut yang berfungsi sebagai media.
Ligase menyediakan ikatan kimiawi antara pembawa tersebut dan peptida atau residu asam amino pertama. Kimia ligase dapat mempengaruhi baik cara pengikatan peptida maupun pembebasannya di kemudian hari.
Loading menguraikan jumlah tempat sambungan yang aktif berdasarkan jumlah media yang dihubungkan.
Kedua istilah tersebut bukanlah sinonim.
Kedua resin tersebut dapat terlihat secara fisik sangat mirip, namun pada saat yang sama memiliki grup fungsional, ikatan, atau derajat pengikatan yang berbeda. Perbedaan-perbedaan ini dapat mempengaruhi ketersediaan tempat-tempat reaktif saat rantai dipasangkan, penebalan resin, dan bentuk kimiawi dari peptida akhir setelah dipisahkan.
Elemen penting lainnya adalah grup yang direncanakan di ujung C.
Sistem pengangkutan-pengikatan yang berbeda dapat dipilih, misalnya dengan cara untuk mendapatkan peptida yang berakhir dengan gugus karboksil atau amid.
Ini adalah perbedaan kimia yang penting.
Perubahan grup terminal mengacu pada perubahan pada molekul itu sendiri, bukan hanya pada cara molekul itu dikemas atau digambarkan.
Kerusakan mempengaruhi akses ke rantai yang terhubung
Bahan pelarut yang digunakan dalam SPPS menyerap pelarut dan mengembang setelah bersentuhan dengan media cair yang sesuai.
Hal ini mengubah lingkungan polimer dan dapat meningkatkan atau mengurangi ruang yang harus dilewati oleh zat-zat reagen terlarut agar dapat mencapai rantai peptida yang terkait dengan zat pengikatnya.
Jadi, pembengkakan bukanlah hanya sekadar fenomena fisik yang menarik.
Ini dapat mempengaruhi ketersediaan kelompok reaktif selama sintesis.
Penelitian sistematis terhadap media berbasis polistirena dan PEG menunjukkan bahwa sifat-sifat seperti jenis pengikat dan tingkat pengikatan resin secara signifikan mempengaruhi penebalan dalam larutan yang lebih ramah lingkungan yang diteliti. Selain itu, ditemukan bahwa penebalan dapat berubah saat pengikatan kelompok pelindung dihapus dan seiring dengan pengetatan rantai peptida. [2]
Hal ini menunjukkan bahwa perilaku resin tidak selalu dapat dianggap sebagai sifat yang tetap.
Dalam praktiknya, hal ini tergantung pada interaksi antara resin, pelarut, pengikat, peptida yang terhubung, dan tahap sintesis yang sedang berlangsung.
Penyebaran yang baik atau hasil reaksi yang menguntungkan untuk satu kombinasi resin, pelarut, dan peptida tidak berarti bahwa kombinasi lain akan bereaksi dengan cara yang sama.
Tahap penyambungan sendiri juga memerlukan kontrol kualitas.
Tahap pertama penyesuaian mungkin tampak sederhana, karena rantai peptida baru saja mulai terbentuk.
Namun, kesalahan yang dibuat pada tahap ini dapat tetap ada selama sintesis selanjutnya.
Jika sisa pertama tidak terhubung dengan benar atau selama proses tersebut konfigurasi stereochemicanya berubah, penambahan semua sisa yang berikutnya tidak harus memperbaiki masalah awal.
Dalam penelitian tahun 1992, metode analitik yang dirancang khusus untuk mengukur racemisasi yang terjadi saat pengikatan asam amino yang telah diamati dengan baik ke media konstan telah dikembangkan.[3]
Makna dari pekerjaan ini melampaui metode analitik yang digunakan saja.
Hal ini menunjukkan bahwa kualitas stereokimia mungkin memerlukan kontrol sebelum memulai siklus pengulangan pengulangan rantai.
Jumlah materi yang awalnya ditambahkan ke media juga memerlukan interpretasi yang tepat.
Nilai nominal penyerapan resin, loading yang diukur secara eksperimental, jumlah bahan baku yang didaur ulang setelah pemisahan, dan produktivitas akhir dari peptida yang terisolasi dan didaur ulang adalah ukuran yang berbeda-beda.
Mereka tidak boleh dianggap sebagai indikator pengganti keberhasilan sintesis.
Rantai yang lebih panjang mungkin menjadi lebih sulit didapatkan
Seiring dengan perpanjangan rantai peptida, molekul yang terhubung sendiri mulai mempengaruhi lingkungan kimianya sendiri.
Rantai-rantai yang berdekatan dapat saling berinteraksi melalui ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, dan kekuatan antarmolekul lainnya. Beberapa urutan dapat menunjukkan kecenderungan yang sangat kuat terhadap interaksi tersebut.
Ini dapat membatasi akses ke grup-grup yang aktif.
Dalam situasi seperti itu, penambahan asam amino lainnya dapat menjadi lebih sulit, bahkan jika jumlah pengikat yang cukup telah dimasukkan ke dalam sistem.
Dalam penelitian mengenai urutan yang sulit dan rentan terhadap agregasi, berbagai metode penggabungan dibandingkan dan produk-produk mentah yang dihasilkan dianalisis. Hasilnya mendukung prinsip bahwa proses harus disesuaikan dengan urutan tertentu, bukannya mengasumsikan adanya satu strategi penggabungan yang selalu terbaik. [4]
Hal ini juga menjelaskan mengapa peningkatan tingkat pengikatan resin atau jumlah perantaraan tidak secara otomatis menyelesaikan semua masalah.
Jika masalah utamanya adalah akses yang terbatas ke tempat-tempat reaktif, hal yang lebih penting daripada pertanyaan tentang jumlah reagen yang ditambahkan menjadi pertanyaan apakah sebenarnya reagen tersebut telah mencapai tempat-tempat yang tepat dan apakah reaksi tersebut berlangsung efisien tanpa terbentuknya jumlah produk sampingan yang tidak dapat diterima.
Pengamanan, penghapusan grup perlindungan, dan penggabungan
Tim pengamanan mengontrol lokasi terjadinya reaksi tersebut.
Asam amino mengandung kelompok-kelompok kimia yang mampu berpartisipasi dalam berbagai reaksi.
Saat melakukan sintesis peptida secara terkontrol, para ahli kimia biasanya ingin agar suatu kelompok amino tertentu bereaksi dengan blok tertentu yang mengandung gugus karboksil, sedangkan tempat-tempat berpotensi bereaksi kembali lainnya tetap tidak aktif untuk sementara waktu.
Itulah yang dilakukan oleh kelompok-kelompok pengawal.
Secara sementara mereka memblokir tempat-tempat reaksi yang dipilih, sehingga tempat lain dapat berpartisipasi dalam reaksi yang telah direncanakan.
Dalam strategi SPPS yang umum digunakan yang didasarkan pada Fmoc, kelompok amino akhir dari rantai yang sedang berkembang tetap terlindungi di antara tahap-tahap selanjutnya dari ikatan. Ketika asam amino berikutnya akan ditambahkan, perlindungan sementara tersebut dihapus, sehingga kelompok amino tersebut terlihat.
Rantai samping yang reaktif dapat memiliki kelompok pelindung terpisah yang dirancang agar tetap utuh selama siklus pembentukan rantai utama yang berulang.
Tujuannya adalah selektivitas yang terkontrol.
Blok yang sesuai yang mengandung kelompok karboksilat harus berikatan dengan kelompok amino yang sesuai, alih-alih menyebabkan pembelahan yang tidak terkontrol atau reaksi kompetitif lainnya.
Ortogonalitas berarti kemampuan untuk membuang proteksi secara selektif.
Strategi kelompok perlindungan ortogonal memungkinkan satu kelompok perlindungan dihapus dalam kondisi di mana perlindungan yang diperlukan lainnya tetap cukup tidak terganggu.
Hal ini memberikan kesempatan bagi seorang ahli kimia untuk mengontrol penemuan berbagai tempat reaktif pada tahap-tahap tertentu dari sintesis.
Fmoc dan Boc adalah istilah yang sudah sangat dikenal dalam kimia peptida, tetapi keduanya tidak mengacu pada berbagai jenis ikatan peptida maupun struktur peptida yang berbeda.
Ini adalah kelompok perlindungan yang terkait dengan berbagai strategi sintesis dan berbagai metode untuk menghilangkannya.
Oleh karena itu, jalan kimia sementara yang digunakan selama pembentukan peptida harus dibedakan dari strukturnya yang akhir.
Pengamanan juga tidak memberikan perlindungan penuh terhadap semua reaksi sampingan yang mungkin terjadi.
Penelitian tentang pembentukan aspartimid, misalnya, menunjukkan bahwa strategi pengamanan, residu asam amino tetangga, dan kondisi pembersihan kelompok pelindung dapat mempengaruhi pembentukan kontaminan bahkan dalam metode SPPS yang sudah sangat dikenal. [5] [6]
Strategi grup perlindungan dengan demikian membatasi reaksi yang tidak diinginkan tertentu, tetapi tidak menghilangkan kebutuhan akan kontrol proses maupun karakteristik analitik akhir.
Pengikatan membentuk ikatan amidat baru pada struktur peptida.
Reaksi pengikatan menghasilkan pembentukan ikatan amid lain dalam struktur peptida.
Blok asam amino yang mengandung gugus karboksil biasanya diaktifkan secara kimia untuk dapat bereaksi secara efektif dengan gugus amino yang terdedah pada peptida yang sedang tumbuh yang terkait dengan substrat.
Setelah pengikatan selesai, kelebihan bahan yang larut dapat dihilangkan dengan penyiraman.
Asam amino yang baru ditambahkan kemudian menjadi bagian akhir dari rantai yang sedang berkembang. Selanjutnya, kelompok aminnya dapat diungkap dan siklus pengikatan berikutnya dapat dimulai.
Secara teoritis, pengulangan rangkaian ini memungkinkan kita untuk mengontrol urutan asam amino dengan mengontrol urutan pengenalan blok bangunan.
Namun, dalam praktiknya ada sebuah penekanan yang sangat penting:
Reaksi kimia yang direncanakan harus benar-benar berjalan dengan baik dalam setiap siklus.
Jika satu pasangan tidak lengkap, sebagian rantai mungkin tidak menerima sisa yang telah direncanakan.
Jika mereka tetap terikat pada polimer dan bereaksi dengan benar dalam siklus berikutnya, maka dapat terbentuk sekvens delekian, yaitu molekul peptida yang tidak mengandung satu atau beberapa asam amino yang telah direncanakan.
Rantai lainnya mungkin akan tetap dipangkas.
Pembersihan menghilangkan zat reagen yang larut dan produk-produk sampingan, tetapi tidak secara selektif menghilangkan semua rantai yang tidak terstruktur dengan baik yang masih terkait secara kovalen dengan pembawa.
Kekurangan sedikit dapat bertambah dalam banyak siklus.
Karakter yang berulang dari SPPS menyebabkan masalah matematika yang signifikan.
Kecacatan kecil pada satu tahap saja mungkin tampak tidak penting, tetapi setelah banyak ulangan, dampaknya dapat bertambah besar.
Mari kita pertimbangkan contoh matematika sederhana.
Jika sintesis peptida memerlukan 50 tahapan pengikatan, dan masing-masingnya memiliki kemungkinan 99% untuk berakhir dengan benar secara independen, rasio teoretis dari molekul yang berhasil melewati semua 50 tahapan tersebut adalah sekitar 60,5%.
Ini hanyalah ilustrasi.
Ini mengasumsikan bahwa semua tahapan tersebut berperilaku secara identik dan independen. Ini tidak memperhitungkan masalah-masalah terkait pembersihan kelompok pelindung, reaksi sampingan, kehilangan saat pengangkatan dan pembersihan, agregasi, maupun banyak faktor-faktor lain yang sebenarnya terjadi.
Oleh karena itu, hasil tersebut tidak boleh diartikan sebagai prediksi dari kinerja produksi yang sebenarnya.
Contoh ini hanya menunjukkan mengapa bahkan kinerja yang sangat tinggi dari tahapan-tahap individual tidak menjamin produk baku yang bersifat kimiawi secara sederhana setelah beberapa puluh kali ulangan.
Oleh karena itu, pemantauan sintesis dan kontrol terhadap polutan sangat penting selama seluruh proses pengkristalan peptida, bukan hanya setelah penambahan asam amino terakhir.
Automasi, pemanasan, dan solusi teknologi lainnya dapat mempercepat sintesis, tetapi kecepatan proses harus selalu dinilai bersama dengan kualitas produk.
Penelitian tentang SPPS yang didukung oleh mikrofale menganalisis rasemisasi yang tergantung pada jenisnya serta pembentukan aspartimid, menunjukkan mengapa kondisi reaksi tetap harus disesuaikan dengan sifat dari rangkaian tertentu. [7]
Pemisahan dan pemulihan produk mentah
Pembersihan menghilangkan produk dari media
Setelah membangun rangkaian peptida yang direncanakan, biasanya peptida tersebut harus dipisahkan secara kimia dari pembawa.
Tahap ini disebut sebagai cleavage, yang berarti pemotongan.
Penghilangan selubung mengganggu hubungan kimia yang telah dirancang secara sengaja antara peptida dan pembawa.
Bergantung pada strategi yang digunakan, deaspartifikasi dapat terjadi secara bersamaan dengan penghapusan sebagian atau seluruh kelompok pelindung rantai sisi. Dalam proses lain, peptida atau fragmennya dapat dilepaskan sambil mempertahankan beberapa perlindungan jika perubahan kimia selanjutnya direncanakan.
Kimia pelepasan yang tepat tergantung pada pengikat dan molekul target.
Kondisi yang secara efektif membebaskan satu peptida dapat merusak kelompok yang rentan secara kimiawi pada kelompok lain.
Oleh karena itu, deaspartylation menggambarkan tujuan kimiawi, bukan satu set reagen atau kondisi universal yang sesuai untuk semua peptida.
Demikian juga, pembentukan rangka peptida yang benar tidak membuktikan bahwa semua kelompok proteksi tersebut kemudian benar-benar terhapus.
Pembuatan rantai dan penghapusan pengaman akhir memenuhi berbagai pertanyaan kimia dan memerlukan penilaian yang terpisah.
Syarat-syarat pembersihan dapat mempengaruhi profil polusi
Pembersihan tidak harus menjadi proses yang tidak memengaruhi secara kimiawi.
Penghapusan kelompok pelindung dan pemutusan ikatan peptida dengan pembawa dapat menyebabkan terbentuknya bentuk-bentuk kimia yang reaktif yang mampu memodifikasi peptida atau komponen-komponen lain dari campuran tersebut.
Oleh karena itu, dalam metode yang dikembangkan dapat digunakan teknik yang disebut scavengery, yaitu senyawa yang menangkap produk-produk reaktif yang tidak diinginkan dan mempengaruhi pembentukan produk-produk sampingan.
Dalam penelitian tahun 2019, berbagai scavenger dianalisis selama pemisahan exenatide dari resin peptida dan ditemukan bahwa pilihan mereka mempengaruhi kualitas produk baku serta profil polutan yang diamati. [8]
Tidak boleh berdasarkan hal ini untuk membuat resep detoksifikasi yang universal.
Namun, penelitian menunjukkan bahwa kondisi pada tahap ini dapat mempengaruhi kualitas produk, dan oleh karena itu harus dinilai secara spesifik untuk setiap peptida dan sistem kelompok pelindung yang digunakan.
Proses dekomposisi yang benar memiliki beberapa dimensi.
Peptida harus dipisahkan dengan benar, kelompok-kelompok pelindung yang diperlukan harus dihapus, bahan target harus dipulihkan, dan perubahan kimia yang tidak diinginkan harus dikontrol.
Pengembalian produk mentah bukanlah proses pembersihan yang final.
Setelah pelarutan, dilakukan proses yang memungkinkan pemisahan bahan yang mengandung peptida dari resin yang tetap, serta bagian-bagian dari komponen-komponen lain dari campuran reaktan.
Dalam hal ini, perbedaan dalam kelarutan, volatilitas, atau sifat-sifat kimia lainnya dapat dimanfaatkan.
Namun, penemuan endapan yang terlihat atau fraksi yang mengandung peptida tidak membuktikan bahwa bahan tersebut hanya terdiri dari produk yang dimaksudkan.
Pada tahap ini, biasanya disebut dengan peptida kasar.
Ini dapat mengandung molekul target bersama dengan rantai-rantai yang diurai, peptida yang dimodifikasi secara kimiawi, struktur yang belum sepenuhnya terdeoksigenasi, bahan yang berasal dari agen pengoksidasi, dan kontaminan lainnya.
Signifikansi dari masing-masing polutan tergantung pada urutan, kondisi sintesis, dan aplikasi yang dimaksudkan.
Dalam salah satu penelitian, bagian kromatografi digabungkan dengan spektrometri massa untuk mengkarakterisasi produk SPPS mentah dan mengaitkan pik kromatografi yang berbeda dengan peptida yang ditentukan. [9]
Ini menunjukkan mengapa informasi yang diperoleh melalui metode pemisahan dan struktural saling melengkapi satu sama lain.
Kromatografi dapat menunjukkan adanya banyak komponen, sedangkan spektrometri massa dapat memberikan informasi tambahan yang membantu menentukan apa yang mungkin merupakan beberapa komponen tersebut.
Pembersihan dan pengesahan identitas menjawab berbagai pertanyaan
Pembersihan bertujuan untuk memperkaya atau mengisolasi molekul target dari komponen-komponen lainnya.
Identifikasi, sebaliknya, menjawab pertanyaan apakah bahan yang terisolasi benar-benar memiliki sifat kimia yang diharapkan.
Pertanyaan-pertanyaan ini sebagian sama, tetapi tidak sama.
Pikogram yang terdistribusi dengan baik tidak secara otomatis merupakan bukti lengkap dari struktur molekul.
Demikian pula, memperoleh massa molekul yang diharapkan tidak secara langsung merupakan suatu penilaian penuh terhadap kebersihan maupun validitas struktural.
Variasi-variasi sekensial yang terkait erat, stereoizomer, atau bentuk-bentuk yang dimodifikasi secara kimia dapat sulit untuk dibedakan atau dipisahkan.
Metode pemurnian haruslah dinilai berdasarkan campuran yang sebenarnya yang terbentuk selama sintesis tersebut, dan tidak boleh dianggap memadai hanya karena berhasil diterapkan pada peptida lainnya.
Jika molekul akhir juga memerlukan pembentukan jembatan disiarczik, siklasi, atau transformasi lain setelah rantai molekul terurai, muncul pertanyaan-pertanyaan analitik lainnya mengenai kelengkapan ikatan, keseragaman struktural, dan apakah benar-benar molekul tersebut telah mencapai bentuk matang yang dimaksud.
Keuntungan, Hambatan, dan Sumber Polusi
Mengapa SPPS begitu banyak digunakan?
Salah satu keunggulan utama SPPS adalah kemampuan untuk mempertahankan peptida yang terbentuk pada media saat pemakaian kembali pelarut yang banyak.
Hal ini mempermudah operasi kimia yang berulang-ulang dan memungkinkan otomatisasi.
Ahli kimia dapat memasukkan rangkaian yang telah direncanakan dari blok bangunan asam amino, dan jika memungkinkan oleh kimia proses, juga beberapa asam amino nonstandar dan modifikasi lainnya.
Sistem otomatis modern menunjukkan sejauh mana gagasan tersebut dapat dikembangkan.
Dalam penelitian tentang sintesis aliran otomatis tahun 2020, dijelaskan bahwa rantai protein yang mengandung hingga 164 residu asam amino dapat dihasilkan. Setelah pemurnian dan pemadatan selanjutnya, bahan-bahan fungsional diperoleh. [10]
Ini adalah contoh yang mengesankan dari kemungkinan teknis.
Namun, ini tidak berarti bahwa setiap rangkaian berukuran 164 residu — atau setiap peptida atau protein berukuran panjang — dapat diperoleh dengan kemudahan yang sama.
Ini juga tidak berarti bahwa pembersihan dan karakteristik struktural menjadi tidak perlu.
Penelitian ini lebih menunjukkan hasil apa yang dapat dicapai melalui sistem yang dirancang dengan cermat untuk molekul yang dipilih dengan tepat.
Automasi mengontrol kelancaran proses.
Namun, ia tidak mampu mengubah kimia yang tidak sesuai menjadi yang sesuai.
Oleh karena itu, kinerja perangkat, urutan peptida, dan struktur molekulnya sendiri harus dianalisis secara keseluruhan.
Bagaimana polusi biasa terbentuk?
Dalam SPPS dapat terjadi beberapa jalur berbeda yang mengarah pada terbentuknya polusi. Pemahaman tentangnya membantu menjelaskan mengapa analisis akhir masih diperlukan.
Serangkaian delezasi atau produk yang dipersingkat dapat terbentuk ketika penyiapan ikatan asam amino yang direncanakan tidak berhasil atau ketika pertumbuhan rantai terhenti. Karena rantai yang tidak normal dapat tetap terikat pada resin, pembersihan selanjutnya tidak perlu menghilangkan rantai tersebut.
Epimerisasi berarti perubahan konfigurasi stereokimia pusat yang bersangkutan. Hal ini sangat penting secara analitik, karena epimer dapat memiliki massa molekul nominal yang sama dengan peptida asli, namun memiliki konfigurasi ruang yang berbeda.
Produk yang mengandung aspartimid dapat terbentuk sebagai hasil dari reaksi samping yang tergantung pada urutan sekvensnya, yang mencakup residu asparagin. Tergantung pada jalannya reaksi, dapat terbentuk lebih dari satu jenis produk tersebut.
Penghapusan tidak lengkap dari kelompok-kelompok protektif terjadi ketika kelompok yang seharusnya dihilangkan tetap terikat pada molekul. Peptida dapat memiliki panjang rantai yang secara nominal diharapkan, tetapi tetap memiliki struktur kimia yang tidak normal.
Modifikasi terkait dengan deaspartylation dapat terjadi selama pelepasan peptida pada akhirnya atau saat menghilangkan kelompok pelindung. Oleh karena itu, struktur rantai yang benar tidak menjamin bahwa peptida akan melewati fase deaspartylation tanpa perubahan.
Reaksi tidak lengkap yang terkait dengan agregasi dapat terjadi ketika rantai yang terbentuk saling berinteraksi sehingga membatasi akses ke tempat-tempat reaktif. Memasukkan jumlah reaktan yang cukup ke dalam reagen dapat tidak menjamin bahwa setiap tempat reaktif secara fisik tersedia dan bereaksi secara tepat.
Ini adalah kemungkinan jalur terbentuknya polusi.
Ini tidak berarti bahwa setiap partai yang menerima SPPS harus mencakup semua jenis ketidaksesuaian yang disebutkan di atas.
Keterkaitannya dalam sintesis tertentu ditentukan berdasarkan pengetahuan tentang proses, penelitian analitik, dan kontrol kualitas yang sesuai.
Peptida alami yang disintesis memerlukan lebih dari sekadar mereplikasi urutan tersebut.
Beberapa peptida secara struktural jauh lebih kompleks daripada yang ditunjukkan oleh sekresi asam amino linear saja.
Contoh yang baik adalah epidermina.
Karakteristik struktural epidermis menunjukkan adanya banyak cincin yang mengandung sulfur serta residu yang tidak biasa. [11]
Oleh karena itu, hanya mereproduksi urutan linear asam amino saja bukanlah bukti yang memadai bahwa epidermin yang matang asli telah diperoleh.
Pengelompokan ini penting saat menafsirkan publikasi atau penelusuran yang berkaitan dengan sintesis epidermis pada fase tetap.
Publikasi tersebut dapat menggambarkan prekursor linear, fragmen, analog, atau struktur terkait lainnya, bukan sintesis keseluruhan yang terverifikasi dari molekul matang lengkap.
Publikasi struktural yang dikutip di sini sebagai [11] menggambarkan karakteristik epidermis itu sendiri; ini bukan laporan mengenai sintesis keseluruhan epidermis menggunakan metode SPPS.
Oleh karena itu, klaim mengenai sintesis total harus dinilai berdasarkan struktur target molekul yang sebenarnya, bukan hanya sekadar urutan asam amino yang linear.
Kinerja, kebersihan, dan identitas harus ditampilkan secara terpisah
Tiga konsep yang sering disalahartikan dalam diskusi tentang sintesis peptida adalah produktivitas, kebersihan, dan identitas.
Jumlah besar produk yang didaur ulang tidak berarti bahwa sebagian besar bahan tersebut merupakan peptida yang dimaksud. Bahan baku tersebut mungkin mengandung sejumlah besar kontaminan.
Sama seperti kebersihan kromatografi yang tinggi tidak secara otomatis menegaskan semua aspek identitas struktural.
Meskipun peptida yang strukturnya telah dikarakterisasi secara cermat, hal itu tidak secara otomatis menjamin penggunaannya secara biologis, terapeutik, atau klinis yang terbukti.
Ini adalah masalah yang berbeda.
Oleh karena itu, deskripsi yang akurat mengenai sintesis harus menunjukkan apa yang merupakan molekul target, pada tahap mana produktivitas diukur, apakah bahan yang dianalisis tersebut kasar atau sudah diolah, serta data analitik apa yang digunakan untuk menegaskan klaim mengenai strukturnya.
Dengan demikian, hasil sintesis dapat diinterpretasikan dan dibandingkan dengan cara yang lebih dapat diandalkan.
Nilai persentase atau massa tunggal tidak boleh disimpulkan sebagai pernyataan umum bahwa peptida tersebut „berkualitas tinggi” tanpa mengetahui apa yang sebenarnya telah diukur.
Pertanyaan yang sering diajukan
1. Mengapa fase tetap digunakan dalam SPPS?
Tahap tetap mempertahankan peptida yang terbentuk pada media, sedangkan pelarut, produk-produk sampingan reaksi, dan larutan pembersihan dapat diulang-ulang dimasukkan dan dikeluarkan. Hal ini sangat memudahkan pengulangan proses rantai dan memungkinkan otomatisasi sintesis peptida, contohnya metode sintesis peptida otomatis modern yang disebut flow-based synthesis.[10] Namun, media ini tidak menjamin bahwa setiap reaksi akan berjalan sempurna atau memisahkan rantai yang tidak terstruktur dengan benar dari rantai yang terikat dengan resin dengan benar. Kelebihannya utama adalah efisiensi dalam menjalankan proses. Keterpastian kimia, kelengkapan reaksi, kebersihan, dan identitas struktural masih memerlukan penilaian secara terpisah.
2. Apakah sintesis pada fase konstan menghilangkan kebutuhan akan proses pemurnian?
Tidak. Rantai peptida yang tidak normal dapat tetap melekat pada resin selama sintesis, dan kemudian terlepas bersama dengan produk yang dimaksudkan. Penelitian yang menganalisis produk SPPS mentah menggunakan kromatografi dan spektrometri massa menunjukkan bahwa pembersihan selama sintesis dan pembersihan akhir memiliki fungsi yang berbeda. [9] Pembersihan menghilangkan terutama komponen larut yang mengelilingi resin, sedangkan pembersihan setelah pemisahan bertujuan memisahkan peptida yang diinginkan dari komponen peptida dan nonpeptida yang tidak diinginkan. SPPS mempermudah proses menengah, tetapi tidak menjamin kemurnian akhir.
3. Apakah „fase tetap” berarti tidak menggunakan pelarut?
Tidak. Dalam SPPS konvensional, media yang tidak larut biasanya dikelilingi oleh pelarut cair dan agen pelarut. Pelarut mempengaruhi lingkungan fisik resin, antara lain tingkat penyempitan dan kemudahan bagi agen pelarut untuk mencapai rantai yang terhubung. Penelitian eksperimental menunjukkan bahwa penyempitan resin tergantung pada pelarut serta perubahan yang terkait dengan kimia ikatan, tingkat pengikatan, dan elongasi rantai. [2] Jadi, resin dan pelarut bersama-sama membentuk lingkungan reaksi.
4. Ke arah mana peptida tumbuh selama SPPS?
SPPS konvensional biasanya membangun peptida dari bagian C-terminalnya menuju ujung N-terminal. Asam amino pertama yang membentuk ujung C-terminal dari molekul siap pakai tersebut akan terikat pada pembawa, sedangkan bagian-bagian selanjutnya memperpanjang ujung amino yang terbelah tersebut. Metode yang diterbitkan berdasarkan Fmoc menunjukkan skema khas ini.[1] Namun, ada strategi khusus yang memanfaatkan fase tetap yang dapat berjalan dengan cara yang berbeda.
5. Apakah resin dan pengikat sama artinya?
Tidak. Resin adalah media yang tidak larut, sedangkan ikatan merupakan hubungan kimiawi antara media dan peptida yang sedang tumbuh. Fungsi ikatan dapat, terlepas dari polimer itu sendiri, mempengaruhi ikatan, stabilitas resin, dan pelepasan peptida di kemudian hari. Penelitian mengenai media yang digunakan dalam sintesis peptida menunjukkan bahwa penentuan jenis resin saja mungkin tidak cukup untuk menggambarkan perilaku keseluruhan sistem.[2]
6. Apakah tingkat penambahan resin yang lebih besar selalu meningkatkan produksi?
Tidak. Loading yang lebih tinggi berarti lebih banyak tempat sambungan potensial per unit media, tetapi tidak harus mengarah pada peningkatan jumlah peptida yang terstruktur dengan benar dan dapat didaur ulang. Tingkat pengikatan dapat mengubah lingkungan molekul lokal dan telah secara eksperimental ditetapkan sebagai salah satu faktor yang mempengaruhi penebalan resin. [2] Jika rantai yang terikat terlalu padat atau berinteraksi secara kuat satu sama lain, ketersediaan tempat reaksi yang aktif dapat menurun. Oleh karena itu, loading harus dianalisis bersama dengan sifat resin, perilaku rangkaian, efisiensi reaksi, dan kualitas produk akhir.
7. Mengapa asam amino dipertahankan saat pengikatan peptida terjadi?
Kelompok perlindungan sementara membatasi akses kelompok reaktif yang dipilih untuk berpartisipasi dalam reaksi tersebut, sementara ikatan spesifik sedang terbentuk. Hal ini memungkinkan penataan rantai secara bertahap dan terkontrol. Namun, perlindungan tidak menghilangkan semua reaksi sampingan. Penelitian pada model sistem menunjukkan bahwa strategi kelompok perlindungan serta urutan sekitarnya dapat mempengaruhi pembentukan aspartimid.[5] Kelompok perlindungan memberikan selektivitas kimia, tetapi seluruh strategi perlindungan dan deproteksi masih memerlukan perencanaan dan evaluasi yang cermat.
8. Apa arti perlindungan ortogonal terhadap grup fungsi?
Ortogonalitas berarti kemampuan untuk menghilangkan satu kelompok pelindung dalam kondisi yang membiarkan perlindungan yang diperlukan lainnya tetap utuh. Hal ini memungkinkan untuk mengekspos lokasi-lokasi reaktivasi tertentu pada tahapan sintesis yang telah direncanakan. Metode SPPS yang mapan didasarkan pada kontrol pengamanan dan pelepasan perlindungan secara bersamaan, alih-alih mengekspos semua kelompok pelindung secara bersamaan. [1] Namun, kesesuaian yang sebenarnya dari perlindungan yang diterapkan tetap tergantung pada molekul target dan kondisi reaksi.
9. Apakah Fmoc dan Boc berarti jenis peptida yang berbeda?
Tidak. Fmoc dan Boc adalah kelompok protektif dan strategi sintesis terkait dengan mereka, bukan berbagai jenis struktur peptida. Perbedaan dalam kimia eliminasi mereka memengaruhi cara sintesis dilakukan, tetapi struktur protektif sementara tidak boleh disamakan dengan struktur akhir dari peptida target. Metode yang diterbitkan berdasarkan Fmoc menunjukkan salah satu varian SPPS yang paling umum digunakan, tetapi ini tidak berarti bahwa setiap peptida harus dibuat dengan metode ini. [1]
10. Apakah tahap pertama penyambungan sudah dapat menyebabkan polusi?
Ya. Tahap pengikatan dapat mempengaruhi kualitas stereokimia sebelum rantai dipanjangkan berulang kali dimulai. Metode analisis yang dirancang khusus untuk mengidentifikasi racemisasi selama pengikatan asam amino yang terikat ke pelarut telah dikembangkan.[3] Hal ini tidak berarti bahwa setiap ikatan akan menyebabkan racemisasi secara signifikan. Namun, hal ini menunjukkan bahwa pengikatan itu sendiri merupakan tahap kimiawi yang penting di mana perubahan yang dapat diukur dapat terjadi dan memerlukan penyesuaian dalam penilaian keseluruhan kualitas.
11. Mengapa beberapa rangkaian peptida disebut sulit?
Beberapa rantai peptida yang sedang berkembang berinteraksi satu sama lain atau dengan rantai tetangga dengan cara yang membatasi akses ke tempat-tempat reaktif. Ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, dan perilaku yang menyerupai agregasi dapat mempersulit pengikatan selanjutnya. Penelitian mengenai rantai yang rentan terhadap agregasi menunjukkan bahwa perubahan dalam cara ikatan dapat mempengaruhi komposisi produk akhir. [4] Oleh karena itu, kesulitan dalam sintesis tergantung pada sifat molekul dan kondisi reaksi, bukan hanya pada panjang peptida itu sendiri.
12. Apakah sintesis yang lebih cepat selalu berarti produk yang lebih baik?
Tidak. Kecepatan sintesis dan kualitas produk adalah parameter yang terpisah. Pemanasan, bantuan mikroaliran, dan otomatisasi dapat mempersingkat waktu proses, tetapi mempercepat reaksi juga dapat mengubah keseimbangan antara reaksi yang diinginkan dan yang tidak diinginkan. Penelitian tentang sintesis yang didukung mikroaliran menunjukkan bahwa ada keterkaitan antara jenis residu dan racemization serta pembentukan aspartimid, yang menunjukkan perlunya kontrol yang tepat terhadap kondisi. [7] Waktu sintesis yang lebih singkat hanya bermanfaat jika bahan yang dihasilkan juga memenuhi kriteria kimia dan analitik yang diperlukan.
13. Apakah pengangkatan berarti hanya menghapus butiran resin?
Tidak. Desbonding adalah proses kimia yang menyebabkan putusnya ikatan yang telah direncanakan antara peptida dan pembawa. Sementara itu, menghilangkan partikel resin melalui filtrasi adalah operasi fisik yang memisahkan dan tidak secara langsung menegaskan bahwa proses kimia desbonding berjalan dengan benar. Peptida dapat dilepaskan secara bersamaan dengan hilangnya gugus pelindung dan reaksi-reaksi lainnya. Penelitian tentang scavenger yang digunakan dalam proses desbonding menunjukkan bahwa tahap ini dapat mempengaruhi profil polutan. [8]
14. Apakah produktivitas tinggi dari produk baku berarti kebersihan peptida yang tinggi?
Tidak. Produktivitas kasar menggambarkan jumlah bahan yang didaur ulang sebelum menghilangkan semua komponen yang tidak diinginkan. Bahan tersebut dapat mengandung peptida target bersama dengan sekvens delezional, struktur modifikasi, grup pelindung yang tersisa, dan kontaminan lainnya. Penelitian terhadap campuran SPPS kasar menggunakan kromatografi dan spektrometri massa menunjukkan mengapa massa yang didaur ulang, kebersihan, dan identitas molekul memerlukan interpretasi yang terpisah. [9] Oleh karena itu, produktivitas yang secara akurat dijelaskan harus menunjukkan tahapan di mana pengukuran tersebut dilakukan serta apakah bahan tersebut sudah diolah secara menyeluruh.
15. Apakah SPPS memungkinkan untuk menerima rantai peptida yang panjang?
Ya. Metode SPPS yang dirancang dengan cermat dapat memungkinkan penemuan rantai yang sangat panjang. Dalam penelitian tentang sintesis otomatis, rantai yang mengandung hingga 164 residu telah diperoleh, yang kemudian diolah untuk pemurnian dan folding sebelum evaluasi fungsionalnya. [10] Hal ini menunjukkan potensi sintesis peptida modern, tetapi tidak berarti bahwa setiap rangkaian dengan panjang yang sama dapat diperoleh dengan efisiensi yang sama. Panjang hanyalah salah satu faktor; agregasi yang terkait dengan rangkaian, reaksi sampingan, persyaratan folding, dan kesulitan pemurnian juga penting.
16. Apakah pembentukan rangkaian epidermis berarti melakukan sintesis lengkapnya?
Tidak. Epidermis yang matang mengandung unsur-unsur struktural yang tidak biasa, termasuk cincin yang mengandung sulfur yang melebihi urutan linear asam amino itu sendiri. Hal ini telah dibuktikan melalui penelitian struktural. [11] Oleh karena itu, penemuan urutan linear, prekursor, atau fragmen tidak secara otomatis berarti sintesis dari molekul yang lengkap dan matang. Penegasan tentang sintesis lengkap memerlukan data analitik yang mendukung pemulihan ikatan yang dimaksud dan elemen struktural lainnya yang penting.
17. Apakah massa molekul yang diharapkan memvalidasi kelengkapan struktur?
Tidak. Pengumpulan massa molekul yang diharapkan memberikan informasi yang berharga, tetapi massa itu sendiri tidak menegaskan semua aspek struktur peptida dan tidak menghilangkan semua kontaminan yang penting. Dua molekul dapat memiliki massa nominal yang sama namun berbeda dalam stereokimia atau struktur struktural tertentu. Penelitian yang mencakup pemisahan peptida epimerik menunjukkan mengapa perbedaan stereokimia dapat memerlukan metode analisis yang mampu membedakan struktur yang tidak dapat dibedakan hanya berdasarkan pengukuran massa. [12] Oleh karena itu, karakteristik akhir harus dirancang dengan mempertimbangkan kontaminan yang realistis dan struktur alternatif yang dapat terbentuk selama sintesis tertentu.
Ringkasan
Sintesis peptida pada fase stasioner mengubah kimia peptida, memungkinkan rantai yang sedang tumbuh untuk bertahan di media yang tidak larut selama pengulangan pengaplikasian, reaksi, dan pembersihan pelarut yang terlarut. Hal ini memudahkan pembangunan sekensial secara bertahap dan merupakan dasar praktis untuk sintesis otomatis.
Kesederhanaan yang tampak dari metode ini seharusnya tidak mengaburkan hal-hal yang terjadi pada setiap tahapnya.
Karet, pengikat, dan derajat pengikatan mempengaruhi sifat lingkungan sintesis secara signifikan. Pengikatan tergantung pada pelarut, dan pengikatan mempengaruhi akses ke rantai yang terkait dengan karet. Grup-grup protektif mengontrol kelompok-kelompok fungsional yang dapat bereaksi, sedangkan reaksi pengikatan membangun rangka peptida dari bagian ke bagian. [1] [2]
Setiap tahap tersebut juga memiliki batasan-batasan tersendiri.
Penambahan awal dapat mempengaruhi kualitas stereokimia. [3] Serangkaian reaksi yang sulit dapat mengagregasi dan membatasi akses terhadap perantara. [4] Kimia pengawetan dan hilangnya gugus-gugus proteksi dapat memfasilitasi reaksi sampingan seperti pembentukan aspartimid. [5] [6] Kondisi sintesis yang dipercepat dapat mengubah tingkat racemisasi atau profil kontaminan. [7] Kondisi pelarutan dapat memengaruhi komposisi produk akhir. [8]
Oleh karena itu, pembentukan rantai yang benar tidak sama dengan mendapatkan peptida yang bersih dan teridentifikasi dengan benar.
Pemulihan produk murni, pemurnian, dan karakterisasi struktural tetap merupakan tahapan yang terpisah. Kromatografi dapat memberikan informasi tentang komposisi dan kemurnian campuran, sedangkan spektrometri massa dan metode analitik lainnya memberikan informasi tentang identitas. Tidak ada satu hasil analisis pun yang harus mengkonfirmasi semua aspek struktur peptida. [9] [12]
Syntesis aliran yang otomatis modern menunjukkan bahwa dengan kondisi yang dirancang dengan baik, SPPS dapat diterapkan bahkan pada rantai yang sangat panjang. [10] Pada saat yang sama, peptida yang strukturnya kompleks seperti epidermin menunjukkan mengapa replikasi secara linear dari sekumpulan asam amino saja mungkin tidak cukup jika molekul yang matang mengandung cincin tambahan, residu yang tidak biasa, atau susunan ikatan tertentu. [11]
Yang terbaik untuk memahami SPPS bukanlah sebagai satu reaksi tunggal, melainkan sebagai rangkaian tahap-tahap kimia dan analitik yang terpisah.
Penambalan menentukan titik awal. Siklus pengaman, melepaskan dan menyambungkan kembali secara berulang membangun rangkaian yang direncanakan. Pemisahan membebaskan produk. Pembersihan memisahkan molekul target dari komponen yang tidak diinginkan. Karakteristik akhir kemudian memungkinkan untuk menentukan apakah bahan yang terisolasi benar-benar memiliki struktur dan kualitas yang ditetapkan untuknya.
Pembagian tahap-tahap ini memungkinkan untuk menghindari beberapa kesalahpahaman yang sering terjadi: sintesis yang berhasil tidak secara otomatis menegaskan kebersihan, kinerja yang tinggi tidak secara otomatis menegaskan identitas, dan massa partikel yang diharapkan tidak secara langsung membuktikan validitas struktural yang lengkap.
Referensi
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Sintesis peptida pada fase padat: Dari prosedur standar hingga sintesis urutan yang sulit. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K., & Willway, H. (2020). Investigasi parameter yang mempengaruhi pembengkakan resin dalam larutan hijau. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Penggunaan reagen Marfey untuk mengukur racemisasi saat mengikat asam amino ke media padat untuk sintesis peptida. Biokimia Analitik, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluasi penggunaan gabungan Oxyma dan HATU dalam mengumpulkan urutan peptida. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Masalah aspartimid di SPPS berbasis Fmoc. Bagian I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Masalah aspartimid dalam SPPS berbasis Fmoc. Bagian II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Membatasi rasemisasi dan pembentukan aspartimida dalam sintesis peptida fase padat Fmoc yang ditingkatkan dengan gelombang mikro. Jurnal Ilmu Peptida, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzenedimethanethiol (1,4-BDMT) sebagai pembersih untuk pemutusan rantai peptida yang lebih ramah lingkungan. RSC Berlanjut, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). Karakterisasi produk mentah dari sintesis peptida pada fase padat dengan spektrometri massa mu-HPLC/fast atom bombardment. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E., & Pentelute, B. L. (2020). Sintesis protein dengan teknik kimia aliran otomatis. Ilmu Pengetahuan, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: Sequencing of a heterodetic tetracyclic 21-peptide amide antibiotic. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Studi racemisasi dalam sintesis peptida melalui pemisahan peptida epimer yang terlindungi melalui kromatografi cair berkinerja tinggi dengan fase terbalik. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x