A szilárd fázisú peptid-szintézis (SPPS), amelyet leggyakrabban SPPS rövidítéssel emlegetnek, az aminosav-aminosav kapcsolatok összetett sorozatát jelenti, miközben az összetett lánc egyik végén a kémiailag kötött, nem oldódó hordozó marad.
Ahelyett, hogy minden reakció után izolálnák a keletkező peptidet, a kémikusok a folyamat végén a folyamatosan folyó folyadékokhoz csatlakoztatva hagyják azt, és a következő folyékony reagenseket és oldatokat távolítják el. A visszatérő ciklusok lehetővé teszik az aktív amincsoport feltárását, egy újabb aminosav csatolását és a már nem szükséges oldható összetevők eltávolítását. Az aminosav-szekvencia tervezett sorrendjének megvalósítását követően a peptidet leválaszthatjuk a hordozótól, majd további feldolgozásra és analízisre bocsátjuk át.
Ez a folyamat-szervezés az egyik fő oka annak, hogy az SPPS olyan fontos módszerévé vált a peptidkémia területén. Az állandó fázis egyszerűsíti a számos ismétlődő kémiai művelet elvégzését és lehetővé teszi a szintetizálás automatizálását.
A folyamatos fázisban végzett szintézis kényelme azonban nem jelent a kimagasló kémiai eredmények garanciáját.
A keletkező peptid kötőanyaghoz való kapcsolódása nem garantálja, hogy minden lánc megkapja az előre megtervezett aminosavakat. Emellett nem jelenti azt sem, hogy a folyamat végén kibocsátott anyag kémiailag tiszta vagy megfelelő szerkezettel rendelkezik.
A lánc összerakása, a termék eltávolítása és visszanyerése, a tisztítás, az azonosítás és a végső strukturális jellemzés mind egy-egy részét képezi az egész folyamatnak.
A modern módszertani publikációk egyaránt mutatják a SPPS előnyét és annak szükségességét, hogy a szabványos módszereket módosítani kell a nehéz szekvenciák esetén. Egy közzétett módszerben, amely az Fmoc stratégiát alkalmazza, például leírták a rutin szintetizálást, de egyben módosított megközelítést is mutatnak a aggregációra hajlamos peptid-szekvenciákra. [1]
Az SPPS megértése tehát többet igényel, mint a kémiai lépések megjegyezése. Meg kell tudni is, hogy melyik lépésnek melyik célja van, hogy mi történhet meg benne hiba, és hogy milyen analitikai kérdésekre továbbra is válaszolni kell az utána következő lépések során.
Mi az állandó fázisú peptid-szintézis?
A keletkező peptid kötődik a receptorhoz, a oldatok pedig változnak.
A hagyományos SPPS-ben a peptid kémiailag egy kis, nem oldódó részecskékhez van kötve, amelyeket általában a gyantacsíkoknak neveznek, egy megfelelő kémiai kötőanyag segítségével.
A szemcsék a reakciós rendszerben maradnak, miközben újabb folyékony reagensek és oldatok kerülnek bevezetésre és eltávolításra.
Ez jelentősen egyszerűsíti a visszatérő szintézist.
A klasszikus, szakaszos szintézisben, az izolálás és a növekvő peptid tisztítása minden egyes aminosav kötődés után lehet zavaró. Az SPPS-ben a keletkező lánc az oldhatatlan fázissal kötődik. Ennek köszönhetően a oldható túlzsúfolt reakcióanyagokat és számos mellékterméket lehet eltávolítani a tisztítással, miközben a gyógyszerszintet tartalmazó peptid helyben marad.
A „konstans fázis” kifejezés azonban félreértésekhez vezethet.
Ez nem jelenti azt, hogy a peptidkötések képződése folyadék vagy oldószer nélkül is megtörténik.
A polimer a rendszeres körülmények között folyékony reakcióközeget körülveszi, és a oldószerrel való kölcsönhatása jelentősen befolyásolhatja a szintézis folyamatát. Az oldószerek továbbra is a polimeres környezetben vagy annak körül kell hogy mozognak, és el kell érniük a növekvő peptid reakciózó helyeit.
A peptid kötőanyaghoz történő kötése általában kovariencia jellegű. Ez azt jelenti, hogy a keletkező molekula a kötőanyaggal egy kémiai kötődés révén kapcsolódik össze.
A peptid tehát nem egyszerűen a részecskék között van elzárva, egy szűrőben van elzárva vagy a felületen lazaan elhelyezkedve.
Ez a kémiai összetétel szándékosan úgy van kialakítva, hogy a keletkező lánc a következő reakciók és a mosási lépések során is kötődjön, majd megfelelő körülmények között felszabadulhasson.
A hagyományos szintézis a C-végtől az N-vég felé halad.
A klasszikus lineáris SPPS stratégia általában egy aminosavval kezdődik, amely a kész peptidben a C-végét jelentheti.
Ez a többi összekapcsolódik a tárolóval.
A megfelelő reaktiváló aminosav csoport felfedése után egy újabb védett aminosavat helyeznek be, és kémiailag csatolják a keletkező lánchoz. Ezen folyamat ismétlése fokozatosan meghosszabbítja a peptidet az N-vég felé.
Fontos hangsúlyozni ezt a irányt, mivel eltér a riboszomok által végzett biológiai fehérje-szintézistől.
A riboszómás szintézis meghosszabbítja a polipeptid N-végétől a C-végig. A hagyományos, lépcsőzetes SPPS rendszer általában az ellenkező irányban hozza létre a szekvenciát.
A végső aminosavszekvencia azonban hasonló lehet. A felépítésének módja különbözik.
Fontos megjegyezni a „konvencionális” kifejezést, mivel a peptidkémia magában foglalja a speciális stratégiákat is, amelyek alternatív kötőpontokat, fragmentumok összekapcsolását, ligáz reakciókat és egyéb egyedi megoldásokat alkalmaznak.
A C-től N-ig tartó irány elnevezés tehát a tipikus, lépcsőzetes SPPS folyamatot jelenti, és nem az összes lehetséges, állandó fázisú peptidkémiai módszert.
Az SPPS csak egy a peptidok előállításának lépései közül.
A folyamatos fázisú szintézis nem az egyetlen módja a peptidek előállításának.
A peptidákat szintetikus módon is kaphatjuk vegyileg, biológiai expressziós rendszerekben, enzimatikus átalakulások során, fragmentok ligációjával vagy különböző módszerek kombinációjával.
Az SPPS különösen hasznos akkor, amikor szükség van a folyamatok szabályozott végrehajtására és a védett, módosított vagy más módon speciális aminosav-alapú összetevőkből álló blokkok használatára.
Sőt, egy adott peptidre vonatkozó egyetlen projekt keretében sem kell mindig azonos módszert alkalmazni kezdettől fogva végig.
A peptid egyes részeit például gyanta segítségével lehet szintetizálni, külön-külön tisztítani, majd más kémiai módszerrel összekapcsolni. Más molekulák esetében előfordulhat, hogy ezeket először kell összehajtani, oxidálni, ciklikálni vagy további strukturális átalakításokat kell végrehajtani már az eredeti lineáris szekvenciát kapás után.
A megfelelő út kiválasztása tehát attól függ, hogy a célmolekula milyen összetett szerkezettel rendelkezik, valamint a projekt analitikai és minőségi követelményei szerint.
Az eljárást érdemes egy sor további kérdésként szemlélni.
A hordozóhoz való csatlakoztatás meghatározza a kiindulási pontot és befolyásolja a termék kioldódásának későbbi kémiai folyamatát. Mindazonáltal továbbra is meg kell határozni, hogy a csatlakozás helyes volt-e és hogy fennmaradt-e a stereokémiai integritás.
A lánc összetétele annak érdekében történik, hogy az aminosavak a tervezett sorrendben kötődjenek össze. Ezután azonban meg kell vizsgálni, hogy minden lánc megfelelően reagált-e, és hogy nem keletkeztek-e olyan szekvenciák, amelyekben hiányzó aminosavak, rövidített vagy módosított termékek voltak jelen.
A csoportok eltávolítása és eltávolítása meg kell, hogy engedje el a peptideket és eltávolítsa a meghatározott kémiai védőanyagokat. Azonban a termék tényleges felszabadulása nem jelenti azt, hogy milyen egyéb anyagok találhatóak a nyersanyagban.
A tisztítás célja, hogy a kívánt anyagot elválasztja a nem kívánt összetevőktől, de még a megtisztított frakció is megerősítésre és minőségi értékelésre van szüksége.
A végső strukturális és analitikai jellemzőknek azonban válaszul kell lenniük arra a kérdésre, hogy az elkülönített anyag rendelkezik-e az adott peptidre várható kémiai tulajdonságokkal, valamint hogy a használt analitikai módszerek megfelelnek-e a tervezett alkalmazásnak.
Ezek koncepciós lépések, nem laboratóriumi utasítások. A konkrét reagensek, eszközök és reakciófeltételek az előírt peptidtől függenek, és ehhez megfelelően kidolgozott és validált módszert igényelnek.
A gyanta felvételével és a lánc összerakásával
A gyanta, a kötőanyag és a kötődésfok különböző funkciókat látnak el
Az SPPS-vel kapcsolatos vitákban gyakran előfordulnak három kifejezés: a gyanta, a kötőanyag és a betöltési arány, vagyis a loading.
Ezek a tulajdonságok összefüggőek, de különbözők.
A gyanta egy nem oldódó anyag, amely a hordozóanyagot alkotja.
A kötőmolekula kémiai kapcsolatot biztosít ezen anyag és a peptid vagy az első aminosav-rész között. Kémiai tulajdonságai befolyásolhatják mind a peptid kötődésének módját, mind a későbbi felszabadulását.
A Loading pedig a reakciós csatlakozási helyek számát jelöli a tároló mennyiségével kapcsolatban.
Ezek a fogalmak nem szinonimák.
Két polimer fizikailag nagyon hasonló lehet, ugyanakkor eltérő funkcionális csoportokkal, kötőanyagokkal vagy kötődésfokokkal is rendelkezhet. Ezek a különbségek befolyásolhatják a reaktív helyek rendelkezésre állását a lánc építése során, a polimer összetapadását, valamint a végleges peptid kémiai formáját a leválás után.
Egy másik fontos elem a tervezett csoport a C-végén.
A különböző hordozó-láncrendszerek kiválasztása például úgy is lehetséges, hogy egy karboksválaszt vagy amidot tartalmazó peptid kapható.
Ez egy lényeges kémiai különbség.
A terminális csoport megváltoztatása magában foglalja a molekula sajátosságainak megváltoztatását, nem pedig csak annak csomagolási vagy leírási módját.
A tömörítés befolyásolja a csatlakoztatott láncokhoz való hozzáférést
A SPPS-ben alkalmazott számos vegyület felveszi a vegyesanyagot, és felgyülemlik az adott folyékony környezettel való érintkezés során.
Ez megváltoztatja a polimeres környezetet, és növelheti vagy csökkentheti azt a térkört, amelyen keresztül a oldott reagenseknek el kell mozogniuk ahhoz, hogy eljussonak a kapcsolt gyantás peptidláncokra.
A tömörödés tehát nem csak egy fizikai érdekességgel jár együtt.
Ez befolyásolhatja a reakcióképes csoportok rendelkezésre állását a szintézis során.
A polisztirol és a PEG alapú hordozók rendszeres vizsgálata azt mutatta, hogy az összekötő szer típusai és a gyanta feloldódási fokozata jelentősen befolyásolta a megmunkáltságot a vizsgált, környezetbarátabb oldószerekben. Emellett megállapították, hogy a megmunkáltság változhat a védő csoportok eltávolításakor és a peptidlánc hosszabbodásával is. [2]
Ez azt mutatja, hogy a gyantás tulajdonságokat nem mindig lehet állandó tulajdonságoknak tekinteni.
A gyakorlatban ez a gyanta, a oldószer, a kötőanyag, a csatlakozó peptid és a jelenlegi szintű szintézis együttműködésétől függ.
A jó oldhatóság vagy a reakció kedvező alakulása egyetlen gyanta-, oldószer- és peptidkombináció esetében nem jelenti azt, hogy egy másik kombináció ugyanolyan eredményt produkálna.
A csatlakozási szakasz önmagában is minőségellenőrzést igényel
Az első csatlakozási szakasz egyszerűnek tűnhet, mivel a peptidlánc még csak most kezd kialakulni.
A jelenlegi szinten bekövetkezett hiba azonban továbbra is fennállhat a későbbi szintézis során.
Ha az első maradékot helytelenül csatlakoztatják, vagy ezen a folyamat során megváltozik a stereokémiai konfigurációja, az összes következő maradék megfelelő csatlakoztatása nem szükséges ahhoz, hogy a kezdeti problémát helyreállítsák.
A 1992-es vizsgálatban egy analitikai módszert dolgoztak ki, amelyet kifejezetten a biztonságosított aminosavak állandó tárolóanyagokkal való összekapcsolódása során fellépő racemizáció mérésére szántak. [3]
Ez a munka jelentősége túlmutat az alkalmazott analitikai módszerre.
Ez azt mutatja, hogy a stereokémiai minőség ellenőrzését még a lánc hosszabbítására szolgáló ismétlődő ciklusok megkezdése előtt is el kell végezni.
A tárolóhoz eredetileg csatlakoztatott anyagmennyiség is megfelelő értelmezést igényel.
A gyantakötés tényleges fokszáma, az experimentálisan mért feltöltés, a leválasztás után visszanyert nyersanyag mennyisége és az elkülönített és tisztított peptid végső hatékonysága különböző mértékűek.
Nem szabad őket a szintézis sikerének alternatív mutatóinak tekinteni.
A hosszabb láncok egyre nehezebben hozzáférhetők lehetnek
A peptidlánc hosszabbodásával a magában foglalt molekula önmagában is befolyásolja a saját kémiai környezetét.
A szomszédos láncok hidrogénkötések, hidrofób hatások és egyéb molekuláris erőket alkalmazva hatással lehetnek egymásra. Egyes szekvenciák különösen erős tendenciát mutatnak ezen hatások kialakulására.
Ez korlátozhatja a reaktív csoportokhoz való hozzáférést.
Ebben az esetben egy újabb aminosav hozzáadása nehezebbé teheti a folyamatot, még akkor is, ha a rendszerbe látszólag elegendő mennyiségű kötőanyagot juttattak be.
Egy összetett, aggregálódó szekvenciákat tartalmazó vizsgálatban különböző összekapcsolási módszereket hasonlítottak össze, és a kapott nyers termékeket elemezték. Az eredmények alátámasztják azt az elvet, hogy a folyamatot a konkrét szekvenciára kell igazítani, ahelyett, hogy egyetlen, mindig a legjobb stratégiát jelentő összekapcsolási stratégiát feltételeznénk. [4]
Ez is magyarázza azt is, hogy miért nem oldja meg automatikusan minden problémát a gyantakészítmények vagy a reagens mennyiségének önmagában történő növelése.
Ha az alapvető probléma a reaktív helyekhez való korlátozott hozzáférés, annál fontosabb kérdés, mint a hozzáadott reagensek mennyisége, hogy tényleg elérték-e a megfelelő helyeket, és hatékonyan zajlott-e a reakció anélkül, hogy elfogadhatatlan mennyiségű mellékterméket képeztek volna.
Biztosítás, csoportok törlése és összekapcsolása
A védőcsapatok ellenőrzik a reakció helyét
Az aminosavak olyan kémiai csoportokat tartalmaznak, amelyek képesek különböző reakciókban részt venni.
A kontrollos peptid-kivonatolás során a kémikusok általában azt szeretnék elérni, hogy egy adott aminosavcsoport reagáljon egy konkrét karboksválasztós csoportot tartalmazó blokkhoz, miközben a többi potenciálisan reakcióba léphető pont ideiglenesen inaktív marad.
Pontosan erre szolgálnak a védőcsapatok.
Időlegesen blokkolják a kiválasztott reakciópontokat, lehetővé téve más helynek, hogy részt vegyen a tervezett reakcióban.
Az Fmoc-alapuló SPPS általánosan alkalmazott stratégiájában a növekvő lánc végső aminosz csoportja a kapcsolódási lépések között megőrzi védelmét. Amikor a következő aminosavat kell hozzáadni, a védelem eltávolításra kerül, és a csoportot lepleződik le.
A reaktiváló mellékláncok külön védőcsoportokat is tartalmazhatnak, amelyeket úgy terveztek meg, hogy a fő lánc építésének ismétlődő ciklusai során továbbra is fennmaradjanak.
A cél a kontrollált selekció.
A megfelelő karbokszilációs blokk kötődik az megfelelő aminoszációs csoporthoz, ahelyett, hogy irányíthatatlan szétválasztódást vagy más versenyképes reakciókat eredményezne.
Az ortogonitás azt jelenti, hogy a biztonsági rétegek kiválasztott módon eltávolíthatók.
Az ortogonális csoportvédelmi stratégia lehetővé teszi egy csoport védelmének eltávolítását olyan körülmények között, amikor a többi szükséges biztosíték továbbra is elégséges mértékben megőrződik.
Ez lehetővé teszi a kémikus számára, hogy a különböző reakcióhelyeket szabályozott módon feltárja a szintézis egyes szakaszain.
Az Fmoc és a Boc jól ismert meghatározások a peptidkémia területén, de nem jelentenek különböző peptidkötések típusait vagy a peptid végleges struktúráit.
Ez olyan védőcsoportokról szól, amelyek különböző szintézistermékek előállítására és azok eltávolítására szolgáló módszerekkel rendelkeznek.
Ezért a peptid felépítésének során alkalmazott ideiglenes kémiai útvonalat el kell különíteni annak végleges szerkezetétől.
A biztonsági intézkedések sem biztosítanak teljes védelmet minden lehetséges mellékhatás ellen.
A vizsgálatok az aspartimid képződéséről például azt mutatják, hogy a biztonsági stratégiák, a szomszédos aminosav-tartományok és a védőcsoportok eltávolításának körülményei akár jól ismert SPPS módszerek esetén is befolyásolhatják a szennyeződések képződését. [5] [6]
A csoportvédelmi stratégia tehát korlátozza a bizonyos nem kívánt reakciókat, de nem szünteti meg az eljárás ellenőrzésének szükségességét vagy a végső analitikai jellemzők meghatározását.
A kötődés további amid-kötések létrehozását eredményezi a peptid szerkezetében.
A kötődéses reakció az peptid keretében egy új amid kötést eredményez.
Az aminosav blokk, amely karbokszilációs csoportot tartalmaz, általában kémiailag aktiválva működik, hogy hatékonyan reagáljon a növekvő proteint tartalmazó, szerves vegyülettel kötött amincsoporttal.
A kötődés befejezése után a felhasznált anyag maradékát vízzel le lehet mosni.
A most csatlakozott aminosav ekkor a növekvő lánc végső maradékává válik. Ezután le lehet fedezni annak aminosav csoportját, és el lehet kezdeni a következő kötődésciklust.
Elméletileg ez a folyamat lehetővé teszi az aminosavak sorrendjének szabályozását az építőkövek bevezetésének sorrendjének szabályozásával.
A gyakorlatban azonban nagyon fontos megjegyzés van:
A tervezett kémiai reakció valóban minden ciklusban helyesen kell végbemennie.
Ha egy összekapcsolás nem teljes, a lánc egy része nem kapja meg a tervezett részét.
Ha ezek a polimerből való összetevők kötődnek a polimerhez és megfelelően reagálnak a következő ciklusban, akkor delekciós szekvenciák keletkezhetnek, azaz olyan peptidcsoportok, amelyek egy vagy több előre meghatározott aminosavat nem tartalmaznak.
Más láncok esetleg rövidebbek maradnak.
A tisztítás eltávolítja a oldható reagenseket és melléktermékeket, de nem eliminálja szelektíven az összes hibásan felépített láncot, amelyek továbbra is kovalenciásan kötődnek a hordozóhoz.
Kis veszteségek sok ciklusban felhalmozódhatnak
Az SPPS ismétlődő jellege jelentős matematikai problémát eredményez.
Egyetlen szakasz kis hibája lehet jelentéktelennek tűnhet, de sok megismétlést követően ezek hatásai összeadódhatnak.
Vegyünk egy egyszerű matematikai példát.
Ha a peptidek szintézisének 50 összekapcsolódási lépése szükséges volna, és mindegyiknek önállóan 99% esélye lenne arra, hogy sikeresen végigjuthasson az összes 50 lépésen, akkor a pontosan minden lépést végigjáró molekula aránya körülbelül 60,5% lenne.
Ez csak egy illusztráció.
Előfeltételezi, hogy minden lépés azonos és független módon viselkedik. Nem veszi figyelembe a védő csoportok eltávolításával kapcsolatos problémákat, a mellékhatásokat, a szétválasztás és tisztítás során keletkező veszteségeket, az aggregációt vagy számos egyéb valós tényezőt.
Ezért nem szabad ezt az eredményt a termelés valós teljesítményének előrejelzésének tekinteni.
Az példa csak azt mutatja be, hogy még a különálló lépések rendkívül magas hatékonysága sem garantálja a több tucat ismétlést követően kémiailag egyszerű alapanyagot.
Ezért a szintézis nyomon követése és a szennyeződések ellenőrzése fontosak a peptiddá történő átalakulás teljes folyamata során, és nem csak az utolsó aminosav hozzáadását követően.
Az automatizálás, a fűtés és más technológiai megoldások felgyorsíthatják a folyamatot, de a folyamat sebességét mindig a termék minőségével együtt kell mérni.
A mikrofal-segített SPPS vizsgálat a maradék racemizációt és az aspartimid képződését a típusfüggő módon elemezte, ezzel igazolva, hogy a reakció körülményeit továbbra is a konkrét szelekciós sorozat tulajdonságaihoz kell igazítani. [7]
A nyers termék kivonása és visszanyerése
A szétválasztás elvezeti a terméket a hordozótól.
A tervezett peptid-lánc elkészítése után általában kémiailag el kell különíteni a hordozótól.
Ez a lépés cleavage néven ismert, vagyis elválasztásnak nevezzük.
A szétválasztás megszakítja a peptiddal a hordozó között kialakított, szándékosan tervezett kémiai kötést.
A bekezelési stratégia függvényében a mellékcső védőrétegének egy részének vagy egészének eltávolítása egyidejűleg következhet be. Egyéb folyamatokban a peptid vagy annak egy részlete feloldódhat bizonyos biztosítékok fenntartása mellett, ha további kémiai átalakításokat terveznek.
A megfelelő felszabadulási kémia a kötőanyagtól és a célmolekulától függ.
Azok a körülmények, amelyek hatékonyan felszabadítják az egyik peptidet, károsíthatják a másik kémiailag érzékeny csoportját.
Ezért a cleavage a kémiai célra utal, és nem egy univerzális készletet vagy minden peptidhez megfelelő körülményeket jelöl.
Ugyanígy, a peptid szerkezetének megfelelő felépítése nem bizonyítja, hogy az összes védő csoportot később hatékonyan eltávolították.
A lánc összerakása és a végső biztonsági intézkedések eltávolítása számos kémiai kérdésre ad választ, és különleges értékelést igényelnek.
A kiürítési körülmények befolyásolhatják a szennyezőanyag-profilt
A szétválasztás nem kell hogy kémiailag semleges lépés legyen.
A védő csoportok eltávolítása és a peptid és a hordozó közötti kötés megszakítása olyan reakciókhoz vezethet, amelyek a peptid vagy a keverék egyéb összetevőit módosíthatják.
Ezért a kidolgozott módszerekben alkalmazhatók az úgynevezett scavengery-k, amelyek olyan vegyületeket használnak, amelyek azonosított nem kívánt reaktív termékeket felszívnak és befolyásolják a melléktermékek képződését.
A 2019-es vizsgálatban különböző scavengereket elemeztek az exenatid peptidegyenemből való kivonásakor, és bebizonyosodott, hogy ezek a választásuk befolyásolta a nyers termék minőségét és a megfigyelt szennyezőanyag-profilt. [8]
Ennek alapján nem lehet egy univerzális eltávolítási receptet kidolgozni.
A vizsgálat azonban azt mutatja, hogy ezen szakasz körülményei befolyásolhatják a termék minőségét, ezért az egyes peptidek és a használt védőcsoportrendszerek vonatkozásában értékelni kell őket.
A megfelelő eltávolítási folyamatnak tehát több dimenziója van.
A peptid megfelelő módon kell leválasztani, a szükséges védő csoportokat el kell távolítani, a célanyagot vissza kell nyerni, és a nem kívánt kémiai átalakulásokat ellenőrizni kell.
A nyers termék visszanyerése nem jelenti a végleges tisztítást
Az elválasztás után elvégezhető egy olyan eljárás, amely lehetővé teszi a peptidet tartalmazó anyag és a folyamatban lévő reakcióban részt vevő többi összetevő elkülönítését.
Ebben az esetben kihasználhatóak a feloldhatóság, a folyékonyan oldódás és más kémiai tulajdonságok közötti különbségek.
A látható szennyeződés vagy peptideket tartalmazó frakció visszanyerése azonban nem bizonyítja, hogy az anyag kizárólag a tervezett termékről áll.
Ebben a szakaszban általában a kemény peptidről beszélnek.
Lehet, hogy célmolekulát tartalmaz a deleciós szekvenciákkal, rövidített láncokkal, kémiailag módosított peptidekkel, nem teljesen lezárult struktúrákkal, reakcióanyagokból származó anyagokkal és egyéb szennyeződésekkel együtt.
A különféle szennyezőanyagok jelentősége a szekvenciától, a szintézis körülményektől és a tervezett alkalmazástól függ.
Egy vizsgálat során a kromatográfiás eljárást tömörített masszamentimikriával kombinálták annak érdekében, hogy a SPPS nyers termékeket jellemzők legyenek és a különböző kromatográfiás mintákat meghatározott peptidekhez rendeljék. [9]
Ez azt mutatja, hogy miért egészül ki egymást a szétválasztó és a strukturális módszerek által nyert információ.
A kromatográfia számos összetevő jelenlétét képes kimutatni, a tömegspektrometriás mérések azonban további információkat szolgáltathatnak arról, hogy ezek közül melyek lehetnek.
A tisztítás és az azonosítás különböző kérdésekre ad választ.
A tisztítás célja, hogy a célciklust más összetevők közül kiválasszák vagy elszigeteljék.
Az azonosítás viszont arra a kérdésre válaszol, hogy az elkülönített anyag valóban rendelkezik-e a várt kémiai tulajdonságokkal.
Ezek a kérdések részben egyeznek egymással, de nem egyformák.
A jól elosztott kromatográfiás pik nem automatikusan jelentős bizonyítékot a molekula szerkezetére.
Ugyanígy, a várt tömeg elérésének önmagában nem jelentése a tisztaság vagy a strukturális pontosság teljes mértékű értékelése.
A szekvenciák, a sztereoiszomerek vagy kémiailag módosított formák közel kapcsolódó variációi nehézkes lehetnek megkülönböztetni vagy megkülönböztetni.
Ezért a tisztítási módot az adott szintézis során létrejött valós keverék alapján kell értékelni, és nem azért kell elfogadni, csak mert más peptid esetében működött jól.
Ha a végtermékhez diszárszti karbonsavak, ciszilizáció vagy egyéb átalakítások is szükségesek a lánc összetételének befejezése után, további analitikai kérdések merülnek fel a kapcsolódások helyességével, a struktúrális egyenértékűséggel és azzal kapcsolatban, hogy valóban az előírt érett formát kapta-e a molekula.
Az előnyök, a korlátozások és a szennyeződések forrásai
Miért van az, hogy az SPPS olyan széles körben alkalmazott?
Az SPPS egyik legfontosabb előnye az, hogy a keletkező peptideket a hordozóban lehet megőrizni a folyékony reakcióanyagok többszöri cseréje közben.
Ez egyszerűsíti a visszatérő kémiai folyamatokat és lehetővé teszi az automatizálást.
A kémikusok tervezett aminokivonat blokkok sorozatát hozhatják létre, és ha a folyamat kémiai megközelítése lehetővé teszi, akkor egyes nem szabványos aminosavak és egyéb módosítások is.
A modern automatizálási rendszerek azt mutatják, hogy milyen messzire lehet elvinni ezt a koncepciót.
A 2020-as automatizált folyékony szintézissel kapcsolatos tanulmányban leírták, hogy akár 164 aminosav-tartalmú fehérjeláncokat is kapnak. A későbbi tisztítás és fázásos eljárások során funkcionális anyagokat sikerült előállítani. [10]
Ez egy lenyűgöző példa a technikai lehetőségekre.
Ez azonban nem jelenti azt, hogy minden 164 tömegszámú szekvenciát – vagy bármely hosszú peptideket vagy fehérjéket – ugyanolyan könnyen lehet előállítani.
Ez nem jelenti azt sem, hogy a tisztítás és a strukturális jellemzők feleslegessé válnának.
A vizsgálat inkább azt mutatja, hogy milyen eredményeket lehet elérni egy alaposan kidolgozott rendszernek a megfelelően kiválasztott molekulák révén.
Az automatizálás ellenőrzi a folyamat végrehajtását.
Nem képes azonban az nem megfelelő kémia megfelelővé változtatni.
Ezért a készülék teljesítményét, a peptid-lánc sorozatát és a molekula magának a megőrzését együttesen kell elemezni.
Hogyan keletkeznek a tipikus szennyezőanyagok?
Az SPPS során több különböző útvonal léphet fel a szennyeződések keletkezéséhez. Az ezeknek a folyamatoknak a megértése segíti a végleges analitikai vizsgálatok szükségességének magyarázatát.
A deleciói folyamat vagy a rövidített termék akkor keletkezhet, ha a tervezett aminosav-helyezés nem sikerül, vagy ha a lánc növekedése megáll. Mivel a hibás lánc továbbra is kapcsolódhat a zsiradékhoz, a későbbi tisztítás nem szükséges annak eltávolítására.
Az epimerizáció az adott központ stereokémiai konfigurációjának megváltoztatását jelenti. Ez analitikai szempontból különösen fontos, mivel az epimernek ugyanaz a névleges molekulasúly lehet, mint a megfelelő peptidnek, ugyanakkor térbeli konfigurációja eltérhet.
Az aszpartimmal kapcsolatos termékek az aszparagin-hidroklorid többi részét magában foglaló reakciók sorozatából származó melléktermékek útján keletkezhetnek. A kémiai folyamatnak megfelelően több mint egy ilyen termék is előfordulhat.
A védőcsoportok hiányos eltávolodása akkor fordul elő, amikor a csoport, amelynek eltávolításra kellene kerülnie, kötődik a molekulához. A peptid így elvileg várható lánc hosszával rendelkezhet, de továbbra is hibás kémiai szerkezettel rendelkezik.
A szétválasztással kapcsolatos módosítások a peptid végső felszabadulása vagy a védőcsoportok eltávolítása során jelentkezhetnek. Ezért a lánc megfelelő felépítése nem garantálja, hogy a peptid a változtatások nélkül eléri a szétválasztási fázist.
A aggregációval kapcsolatos hiányos reakciók azonban akkor jelentkezhetnek, amikor a keletkező láncok korlátozzák a reakcióhelyekhez való hozzáférést. A reakcióedénybe elegendő mennyiségű reagens bevezetése nem garantálja, hogy minden reakcióhely fizikailag elérhető és megfelelő reakciót mutat.
Ez az egyik lehetséges útvonal a szennyeződések keletkezésének.
Ez nem jelenti azt, hogy az SPPS módszerrel kapott minden választási jelentkezésnek tartalmaznia kell az említett hibatípusokat.
A konkrét összetételüket az eljárással kapcsolatos ismeretek, az analitikai vizsgálatok és a megfelelő minőségellenőrzés alapján határozzák meg.
A természetes peptidjeihez több kell, mint a szekvencia reprodukálására.
Egyes peptidek strukturálisan sokkal összetettebbek, mint az aminosavok lineáris sorozatából következik.
Jó példa az epidermisz.
Az epidermisz szerkezeti jellemzői számos széntartalmú gyűrű jelenlétét mutatták, valamint nem szokványos maradékanyagokat is. [11]
Csak az aminosavok lineáris sorrendjének visszaállítása nem lenne elégséges bizonyítékként arra, hogy valódi érett epidermint kaptunk.
Ez a megkülönböztetés fontos az epidermin állandó fázisban történő szintézisével kapcsolatos publikációk vagy kutatások értelmezése során.
A publikáció lehet egy lineáris előanyagot, egy fragmentumot, egy analógot vagy egy másodlagos struktúrát leírni, és nem egy megerősített teljes szintézist egy teljes érett molekula részéről.
A [11] című struktúrális publikáció maga az epidermisz jellemzőit írja le; ez nem egy SPPS módszerrel végzett teljes szintézisre vonatkozó jelentés.
A teljes szintézisre vonatkozó állításokat tehát a molekula tényleges célstruktúrája alapján kell értékelni, nem pedig kizárólag az aminosav-láncainak lineáris sorrendje alapján.
A teljesítményt, a tisztaságot és az identitást külön kell bemutatni.
A peptid-szintézissel kapcsolatos viták során gyakran összetévesztik a három fogalmat: hatékonyságot, tisztaságot és identitást.
A visszanyert termék nagy tömege nem jelenti szükségszerűen azt, hogy az anyag többsége a kívánt peptideket tartalmazza. A nyersanyag jelentős mennyiségű szennyeződést is tartalmazhat.
Hasonlóan, a magas tisztaságú kromatográfia nem bizonyítja automatikusan a struktúrális identitás minden aspektusát.
Még az olyan peptid is, amelynek kémiai szerkezetét pontosan jellemzőzték, nem eredményezi automatikusan a biológiai, terápiás vagy klinikai alkalmazás igazolását.
Ezek különálló kérdések.
A szintézis megbízható leírása tehát azt kellene jelölnie, hogy milyen célzott molekula volt a cél, milyen fázisban mértek a hatékonyságot, hogy a vizsgált anyag nyers vagy tisztított volt-e, valamint hogy milyen analitikai adatokat használtak a struktúrával kapcsolatos állítások megerősítésére.
Ennek köszönhetően a szintézis eredményeit megbízhatóbb módon lehet értelmezni és összehasonlítani.
Egyetlen százalékos érték vagy tömegérték nem válhat át általános megállapításra arról, hogy a peptid „magas minőségű”, anélkül, hogy tudni lehetne, hogy mit is mértek valójában.
Gyakran ismételt kérdések
1. Miért alkalmazzák a SPPS-ben a statikus fázist?
A statikus fázis megőrzi a keletkező peptidet a hordozóban, miközben a oldható reagensek, a reakció melléktermékei és a szuszpendálódó oldatok többször is behelyezhetők és eltávolíthatók. Ez jelentősen egyszerűsíti a lánc újrahasznosítását, és lehetővé teszi a peptid-szintézis automatizálását, mint például a modern automatizált folyamat-szintézisének módszerei. [10] A hordozó azonban nem garantálja, hogy minden reakció tökéletesen zajlik, és nem is választja el a hibásan épített, vegyülethez kötött láncot a helyesből. A fő előnye a folyamat hatékonyságának javítása. A kémiai szelektívség, a reakciók teljessége, a tisztaság és a struktúrális egyértelműség továbbra is külön értékelést igényel.
2. Az állandó fázisú szintézis megszünteti-e a tisztítás szükségességét?
Nem. A hibás peptidláncok a szintézis során a gyantához kapcsolódhatnak, majd a tervezett termékkel együtt felszabadulhatnak. A SPPS nyers termékeit kromatográfiával és tömegspektrometriával végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a szintézis során végzett tisztítás és a végleges tisztítás eltérő funkciókat lát el. [9] A tisztítás elsősorban a gyantát körülvevő oldható összetevőket távolítja el, a szétválasztás után végzett tisztítás pedig elválasztja a kívánt peptidet a nem kívánt peptid- és nepeptid összetevőktől. Az SPPS egyszerűsíti az intermedierek folyamatát, de nem garantálja a végső tisztaságot.
3. A „állandó fázis” azt jelenti, hogy nem alkalmaznak oldószert?
Nem. A hagyományos SPPS-ben a nem oldódó szűrőanyagot általában folyékony reakcióanyagok és oldószerek veszik körül. Az oldószerek befolyásolják a gyanta fizikai környezetét, többek között a gyanta összenyomódásának mértékét és azt, hogy a reagensek könnyen eljuthatnak a kapcsolódó láncokhoz. Kísérleti vizsgálatok kimutatták, hogy a gyanta összenyomódása a feloldós hatás függvényében változik, valamint a kötőanyag kémiai összetétele, a kötés mértéke és a lánc hosszának növekedése is befolyásolja ezeket. [2] A gyanta és az oldószer tehát egy reakciókörnyezetet alkotnak.
4. Melyik irányban nő a peptid a SPPS során?
A hagyományos lépcsőzetes SPPS rendszer általában a C-vég többi részétől a N-vég felé építi a peptideket. Az első aminosav, amely a kész molekula C-végét alkotja, hozzá van kötve a hordozóhoz, a következő maradékok pedig meghosszabbítják a kinyílt aminosavláncot. A Fmoc alapú publikált módszerek ezt a tipikus mintát mutatják be. [1] Ugyanakkor vannak speciális, állandó fázisú stratégiák is, amelyek másképp is működhetnek.
5. A gyanta és a kötőanyag ugyanazt jelenti?
Nem. A polimer egy elválaszthatatlan szilárd alátámasztó anyaga, a kötőanyag pedig a növekvő peptid és a polimer közötti kémiai kapcsolat. A kötőanyag funkciója függetlenül a polimertől is befolyásolhatja a kötődés folyamatát, a polimer tartását és a peptiddin feloldódását. A peptidkötőanyagok vizsgálata során megállapítható, hogy a polimer típusa meghatározása önmagában nem elegendő a teljes rendszer viselkedésének leírásához. [2]
6. A gyanták nagyobb koncentrációja mindig növeli a termelést?
Nem. A magasabb loading nagyobb számú potenciális kötési helyet jelent egy adott mennyiségű molekula számára, de nem biztos, hogy nagyobb mennyiségű jól kialakított és visszanyerhető peptid keletkezik. A kötési arány a molekuláris környezetet is befolyásolhatja és kísérleti alapon az egyik olyan tényezőként jelölte meg, amely befolyásolja a gyantacsapódást. [2] Ha a kötött láncok túlzottan összenyomódnak vagy erősen kölcsönhatnak egymással, a reakcióképződésre alkalmas helyek elérhetősége romolhat. Ezért a loadingot a gyanta tulajdonságainak, a sekvenciaállapotnak, a reakcióteljesítménynek és a végtermék minőségének együttes elemzésével kell megvizsgálni.
7. Miért vannak az aminosavak védve a peptid elkészítése során?
A védő csoportok ideiglenesen megakadályozzák a választott reakciók csoportjait abban, hogy részt vegyenek a reakciókban, miközben egy konkrét kötést hoznak létre. Ez lehetővé teszi a 2 lépcsős, szabályozott láncépítés elvégzését. Ugyanakkal azonban nem szűnik meg minden mellékhatásos reakció. A modellekben végzett vizsgálatok például azt mutatták, hogy a védő csoportok stratégiája és a körülvevő szekvencia befolyásolhatja az aspartimid képződését. [5] A védő csoportok tehát kémiai selekciót biztosítanak, de az egész védő és lezáró stratégiát továbbra is gondos tervezés és értékelés követelménye.
8. Mit jelent az ortogonális funkcionális csoportvédelem?
Az ortogonitás azt jelenti, hogy egy védő csoport egy részét eltávolítani lehetséges olyan körülmények között, amelyek elegendő mértékben megőrzik a többi szükséges védelmet. Ez lehetővé teszi az egyes reaktív helyek feltárását a tervezett szintézis lépéseken belül. A jól megalapozott SPPS módszerek a szabályozott védelmet és a kioldást alapozzák meg, ahelyett, hogy egyidejűleg feltárnák az összes reaktív csoportot. [1] A végrehajtott védőkészülékek valódi összhangja azonban továbbra is a cél molekulától és a reakció körülményeitől függ.
9. Az Fmoc és a Boc különböző típusú peptideket jelent-e?
Nem. Az Fmoc és a Boc védő csoportok és az ezekkel kapcsolatos szintetikus stratégiák, nem pedig a különböző peptidek struktúrája. A eltérő eltávolítási mechanizmusok a szintetizálás módját befolyásolják, de a végső célpéptid szerkezetét nem szabad összetéveszteni az eltávolítási mechanizmusokkal. A publikált Fmoc alapú módszerek egyike az általánosan alkalmazott SPPS-variáns, de ez nem jelenti azt, hogy minden peptidet ezt a módszert kell használni. [1]
10. Lehet-e a csatlakozás első szakaszában szennyeződés keletkezni?
Igen. A kötődés fázisa még a lánc többszöri meghosszabbításának megkezdése előtt befolyásolhatja a stereokémiai minőséget. Speciálisan a biztonságos aminosavak vegyületekhez való kötődés során előforduló racemizáció meghatározására szolgáló analitikai módszereket dolgoztak ki. [3] Ez nem jelenti azt, hogy minden kötődés jelentős racemizációt okoz. Csak azt mutatja, hogy a kötődés önmagában egy olyan kémiai szempontból jelentős lépés, amely során mérhető változások léphetnek fel, amelyek figyelembevétele szükséges a minőség általános értékelésében.
11. Miért nevezzük egyes peptidkészleteket nehéznek?
Egyes növekvő peptidláncok kölcsönhatásba lépnek egymással vagy a szomszédos láncokkal, korlátozva ezzel a reakcióhelyekhez való hozzáférést. A hidrofób kötődés, a hidrofób kölcsönhatások és az aggregációhoz hasonló viselkedés megakadályozhatja a későbbi összekapcsolódást. Az aggregációra hajlamos láncok vizsgálata azt mutatja, hogy a kötődés módjának megváltoztatása befolyásolhatja a végtermék összetételét. [4] Ezért a szintézis nehézségeinek a molekula tulajdonságaitól és a reakció körülményeitől függően kell megítélni, nem pedig kizárólag a peptid hosszától.
12. Az gyorsabb szintézis mindig jobb terméket jelent?
Nem. A szintézis sebessége és a termék minősége különálló paraméterek. A fűtés, a mikrohullámú támogatás és az automatizálás lerövidíthetik a folyamatot, de a reakciók gyorsítása megváltoztathatja a kívánt és mellékhatásos reakciók közötti egyensúlyt is. A mikrohullám-szintézis kutatásai a reszimek tömegének változását és az aspartimid képződését mutatták, ami arra utal, hogy megfelelő szabályozás szükséges. [7] A rövidebb szintézisidő csak akkor előnyös, ha az elkészített anyag megfelel a szükséges kémiai és analitikai kritériumoknak is.
13. A szétválasztás csak annyit jelent, hogy eltávolítjuk a gyantacsíkokat?
Nem. A lepkezés egy kémiai folyamat, amely a peptid és a hordozó között kialakított tervezett kötést szétrombolja. A gyanta szemcsék szűrése pedig egy fizikai eljárás, amely önmagában nem bizonyítja az elszakadási kémia megfelelő folyamatát. A peptid felszabadulása egyidejűleg történhet a védő csoportok eltávolításával és egyéb reakciókkal. A lepkezés során alkalmazott scavengerek vizsgálatai azt mutatják, hogy ez a lépés befolyásolhatja a szennyezőanyag-profilt. [8]
14. A nyerstermék magas termelékenysége azt jelenti, hogy a peptidek tisztasága magas?
Nem. A teljesítmény a visszanyert anyag mennyiségét jelöli anélkül, hogy a nem kívánt összetevőket eltávolítanák. Ez az anyag tartalmazhatja a célpeptidet, valamint a deleciós szekvenciákat, a módosított struktúrákat, a maradék védő csoportokat és egyéb szennyező anyagokat. A SPPS-es anyagok összetételének szűrése során elvégzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a visszanyert tömeg, a tisztaság és a molekulaszámosság miért igényel külön értelmezést. [9] A pontosan feltüntetett teljesítménynek ezért azt a lépést kell jelölnie, amelyen a mérés történt, valamint azt, hogy a anyag már tisztult-e.
15. Az SPPS lehetővé teszi a hosszú peptidláncok felvételét?
Igen. A jól kidolgozott SPPS-módszerek lehetővé tehetik nagyon hosszú láncok előállítását. Az automatizált folyamatos szintézistajánló vizsgálatokban akár 164 maradékot tartalmazó láncokat is nyertek, amelyeket aztán tisztításra és fázisváltásra vetettek át funkcionális értékelés előtt. [10] Ez mutatja a modern peptidszintézis lehetőségeit, de nem jelenti azt, hogy minden hasonló hosszúságú szekvenciát ugyanolyan hatékonysággal lehet előállítani. A hosszúság csak egy tényező; a szekvenciától függő aggregáció, a melléktermékek, a fázisváltási követelmények és a tisztítás nehézségei is fontosak.
16. Az epidermisz-lánc építése azt jelenti-e, hogy teljes mértékben szintézise történik?
Nem. A érett epidermis nem szokványos strukturális elemeket tartalmaz, többek között szén-dioxid tartalmú gyűrűket, amelyek meghaladják az aminosavok lineáris sorrendjét. Ez strukturális vizsgálatokban is kimutatható. [11] Az egyenes szekvencia, előfutár vagy fragment elkészítése tehát nem jelenti automatikusan a teljes érett molekula szintézisét. A teljes szintézisről szóló állításhoz analitikai adatok szükségesek, amelyek megerősítik a tervezett összekapcsolódások és egyéb lényeges strukturalis elemek reprodukálását.
17. A várt molekulasúly megerősíti-e a szerkezet teljes pontosságát?
Nem. Az elvárt molekulasúly elérésének megállapítása értékes információt nyújt, de önmagában a tömeg nem igazolja minden peptid szerkezete szempontjából releváns aspektust, és nem zárja ki minden lényeges szennyeződést. Két molekula ugyanazt a névleges tömegű lehet, ugyanakkor különböző sztereochémiai vagy specifikus szerkezeti rendszert tartalmazhatnak. A epimere peptiddel végzett vizsgálatok azt mutatják be, hogy a sztereochémiai különbségek miért igényelhetik az analitikai módszereket, amelyek képesek megkülönböztetni azokat a struktúrákat, amelyeket nem lehet kizárólag a tömegmérés alapján megkülönböztetni. [12] A végső jellemzőket ezért a reális szennyeződések és az adott szintézis során előfordulható alternatív struktúrák figyelembevételével kell megtervezni.
Összefoglaló
A folyamatos fázisban végzett peptidkémia megváltoztatta a peptiddel kapcsolatos kémiai folyamatokat, lehetővé téve a növekvő lánc tartását egy nem oldódó alapanyagban a többszöri beadás, reakció elvégzése és a oldható reagensek eltávolítása során. Ennek köszönhetően egyszerűbbé válik a folyamat lépésenkénti felépítése, és ez az automatikus szintetizálás gyakorlati alapja.
Ez a módszer látszólag egyszerűsége azonban nem szabad elhallgatni azt a kémiai folyamatot, amely minden egyes lépésnél megfigyelhető.
A polimer, a kötőanyag és a kötődés mértéke befolyásolja a szintézis környezeti tulajdonságait. A oldószerfüggő kibővülés befolyásolja a polimerhez kötött láncokhoz való hozzáférést. A védőcsoportok szabályozzák, hogy mely funkcionális csoportok reagálhatnak, míg a kötődéses reakciók építik a peptid struktúrát a maradékra. [1] [2]
Ezeknek a lépéseknek mindegyikének is vannak korlátai.
A kezdeti összekapcsolódás befolyásolhatja a stereokémiai minőséget. [3] A nehéz szekvenciák aggregálhatják és korlátozhatják a reagensek hozzáférhetőségét. [4] A csoportok védőmolekulákhoz való kötődésének és eltávolításának kémiai folyamata elősegítheti a melléktermékek képződését, mint például az aspartimid képződését. [5] [6] A gyorsított szintézis körülmények változtathatják a racemizáció mértékét vagy a szennyezőanyagok profilját. [7] A eltávolítási körülmények tovább befolyásolhatják a nyers termék összetételét. [8]
Ezért a lánc megfelelő összetétele nem egyenértékű a tiszta és megfelelően azonosított peptid előállításaival.
A nyers termék visszanyerése, a tisztítás és a strukturális jellemzők továbbra is külön lépések maradnak. A kromatográfia információkat szolgáltat a keverék összetételéről és tisztaságáról, míg a tömegspektrometri és más analitikai módszerek információkat szolgáltatnak a peptidek identitásáról. Egyetlen analitikai eredmény sem kellően bizonyítja minden peptid struktúrájának aspektusát. [9] [12]
A modern automatizált folytonos szintézis azt mutatja, hogy a megfelelően kidolgozott körülmények között az SPPS-t akár nagyon hosszú láncok esetén is alkalmazni lehet. [10] Ugyanakkal idővel strukturálisan összetett peptidek, mint például az epidermisz, azt mutatják be, hogy miért nem elegendő a lineáris aminosav-lánc egyedileg való rekonstruálása, ha a érett molekula további gyűrűket, szokatlan maradékokat vagy egy adott összekapcsolási rendszert tartalmaz. [11]
A SPPS-t a legjobb úgy értelmezni, hogy nem egyetlen reakcióként, hanem különálló kémiai és analitikai lépések sorakozásaként.
A csatlakozás jelöli az indulási pontot. A rendszeres védő-, kioldó- és összekapcsolási ciklusok egy tervezett láncot hoznak létre. A leválasztás felszabadítja a terméket. A tisztítás elválasztja a célciklustól a nem kívánt összetevőket. A végső jellemzők azt lehetővé teszik, hogy meghatározzuk, az elkülönített anyag valóban rendelkezik-e a hozzá rendelt struktúrával és minőséggel.
Ezeknek a lépéseknek a megkülönböztetése megakadályozza a gyakori félreértéseket: a sikeres szintézis nem bizonyítja automatikusan a tisztaságot, a magas hatékonyság nem bizonyítja automatikusan az identitást, és a várt molekulasúly önmagában nem bizonyítja a teljes strukturális pontosságot.
Hivatkozások
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Szilárd fázisú peptid-szintézis: a standard eljárásoktól a nehéz szekvenciák szintéziséig. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K., & Willway, H. (2020). A zöld oldószerben lévő gyanta feloldódását befolyásoló paraméterek vizsgálata. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). A Marfey-féle reakció használata az aminosavak szilárd alátámasztóanyagokra való rögzítése során a racemizáció mennyiségének meghatározására peptidek szintézisében. Analitikai Biokémia, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Az Oxyma és a HATU kombinált használatának értékelése a peptidláncok összesítésében. Peptide Science Journal, 23.(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Az aspartimiddal kapcsolatos probléma az Fmoc-alapú SPPS-ben. I. rész. Peptide Science Journal, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Az aspartimid probléma az Fmoc-alapú SPPS-ben. II. rész. Peptide Science Journal, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). A racemizáció és az aspartimid képződés korlátozása a mikrohullámú erősítésű Fmoc szilárd fázisú peptid-szintézis során. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzenedimetanil (1,4-BDMT) a zöldebb peptidegyanta-elválasztások elleni védőanyagként. RSC előrelépés, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). A szilárd fázisú peptide-szintézisből származó nyersanyagok jellemzése mu-HPLC/gyors atombombázásos tömegspektrometriával. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E., & Pentelute, B. L. (2020). Proteinekészítés automatizált folyamatkémiai eljárással. Science, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: A heterodetik tetracyklikus 21-peptid-amid antibiotikum szekvenálása. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). A peptidszintézissel kapcsolatos racemizációs vizsgálatok: védett epimérő peptidek elválasztása reverz-fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x