La sintesi dei peptidi in fase solida, più comunemente definita SPPS (solid-phase peptide synthesis), è un metodo chimico per costruire peptidi aminoacidi uno ad uno, mentre l'estremità del catenaccio formato rimane chimicamente legata al supporto insolubile.
Invece di isolare il peptide in corso di formazione dopo ogni reazione, gli scienziati lo lasciano legato alla fase solida, introducendo e rimuovendo i reagenti liquidi successivi e i solventi di lavaggio. I cicli ripetuti consentono di rivelare il gruppo amino-reattivo, collegare un altro aminoacido e rimuovere i componenti solubili che non sono più necessari. Dopo aver completato la sequenza amino-sequenziale pianificata, il peptide può essere separato dal supporto e quindi sottoposto a ulteriori trattamenti e analisi.
Questa organizzazione del processo è uno dei principali motivi per cui la SPPS è diventata una tecnica così importante nella chimica dei peptidi. La fase stabile semplifica l'esecuzione di molte operazioni chimiche ripetitive e ha permesso l'automazione della sintesi.
La comodità della sintesi in fase stabile non significa tuttavia una garanzia chimica di eccellenza.
L'aggiunta del peptido in corso di formazione al supporto non garantisce che ogni catena riceva tutte le amminoacidi previsti. Non significa inoltre che il materiale rilasciato alla fine del processo sarà chimicamente puro o avrà una struttura corretta.
Il concatenamento, lo sfiato e il recupero del prodotto, la purificazione, la conferma dell’identità e la caratterizzazione strutturale finale sono componenti separate dell’intero processo.
Le pubblicazioni metodologiche contemporanee mostrano sia l'utilità del SPPS sia la necessità di modificare le metodologie standard in caso di sequenze difficili. In una delle metodologie pubblicate che utilizzano la strategia Fmoc, è descritta, ad esempio, la sintesi routinaria, ma anche un approccio modificato per le sequenze peptoidiche suscettibili di aggregazione. [1]
Per comprendere lo SPPS è quindi necessario fare molto più che ricordare i successivi passaggi chimici. È necessario anche sapere quale sia lo scopo di ogni passaggio, cosa può andare storto durante il processo e quali domande analitiche occorre ancora rispondere al termine dello stesso.
Cos’è la sintesi dei peptidi in fase solida?
Il peptide in fase di formazione rimane legato e i solventi cambiano
Nella SPPS convenzionale, il peptide viene chimicamente legato a piccole particelle insolubili, chiamate solitamente granuli di resina, tramite un collegante chimico appropriato.
Le granulate rimangono all'interno dell'unità di reazione, mentre i liquidi reagenti e i solventi che attraversano il processo vengono introdotti e eliminati.
Questo semplifica notevolmente la sintesi ripetitiva.
Nella classica sintesi in fase a secco, l’isolamento e la purificazione del peptide in crescita dopo ogni aggiunta di un aminoacido possono essere problematiche. Nel SPPS, il catenaccio formato rimane legato alla fase insolubile. In questo modo, gli eccessi di reagenti solubili e molte delle sostanze secondarie possono essere eliminati tramite lavaggio, mentre il peptide legato alla sostanza di supporto rimane sul posto.
Il termine „fase stabile” può tuttavia portare a fraintendimenti.
Questo non significa che la formazione di legami peptidici avvenga senza l’intervento di liquido o solvente.
La resina è solitamente circondata da un ambiente reattivo liquido e il suo contatto con il solvente può influire significativamente sul corso della sintesi. I reagenti devono comunque spostarsi nel o intorno all’ambiente polimerico e raggiungere i siti reattivi del peptide in crescita.
L'associazione del peptide al supporto è di solito di tipo covalente. Ciò significa che la molecola risultante è legata al supporto tramite un legame chimico.
Il peptido non è quindi semplicemente intrappolato tra le particelle, bloccato da un filtro o appiccicato a superficie in modo approssimato.
Questa combinazione chimica è progettata in modo tale che il catene così formata rimanga legata durante le successive reazioni e le fasi di lavaggio, e possa poi essere rilasciata in condizioni appropriate.
La sintesi convenzionale avviene dal C-terminale verso il N-terminale
La classica strategia lineare della SPPS inizia solitamente con un aminoacido che nel peptide finito costituirà il suo C-terminale.
Il resto viene collegato al supporto.
Dopo l'attivazione della rispettiva gruppo amino-reattivo, viene aggiunto un altro amminoacido proteico e viene chimicamente legato al catenone formato. Il processo di ripetizione di questo passaggio allunga gradualmente il peptide verso il nucleo.
Vale la pena sottolineare questo percorso, poiché differisce dalla sintesi biologica delle proteine tramite i ribosomi.
La sintesi ribosomale prolunga il polipeptide dal nucleo verso il C-terminale. L'SPPS tradizionale costruisce la sequenza in senso opposto.
La sequenza finale degli aminoacidi può tuttavia essere identica. Differisce solo il modo in cui essa viene costruita.
È importante qui la definizione di „convenzionale”, poiché la chimica dei peptidi comprende anche strategie specializzate che utilizzano punti di accoppiamento alternativi, la sintesi di frammenti, reazioni di ligazione e altre soluzioni non standard.
La descrizione del percorso da C a N si riferisce quindi a un processo SPPS tipico, e non a tutti i possibili metodi di chimica peptidica che utilizzano la fase stazionaria.
SPPS è solo uno degli elementi della produzione dei peptidi
La sintesi a fase stazionaria non è l'unico modo per ottenere peptidi.
I peptidi possono anche essere prodotti mediante sintesi chimica in soluzione, sistemi di espressione biologica, trasformazioni enzimatiche, legatura di frammenti o combinazioni di diverse metodologie.
SPPS è particolarmente utile quando è necessario un assemblaggio controllato delle sequenze e l'utilizzo di blocchi strutturali aminoacidici protetti, modificati o comunque speciali.
Anche nel caso di un progetto che riguarda un singolo peptide, non è sempre necessario utilizzare la stessa metodologia dall’inizio alla fine.
I singoli frammenti del peptide, ad esempio, possono essere sintetizzati sulla resina, separatamente purificati e poi combinati mediante un altro metodo chimico. Altre molecole possono richiedere folding, ossidazione, ciclodazione o ulteriori trasformazioni strutturali già dopo l'ottenimento della sequenza lineare iniziale.
La scelta della via corretta dipende quindi dalla molecola di destinazione, dalla sua complessità strutturale e dai requisiti analitici e qualitativi del progetto.
Il processo vale la pena di essere considerato come una serie di domande successive.
L'attaccamento al supporto determina il punto di partenza e influenza la successiva chimica di rilascio del prodotto. Tuttavia, è ancora necessario stabilire se l'attaccamento si sia verificato correttamente e se sia stata mantenuta l'integrità stereomicheica.
Il processo di assemblaggio del filamento deve portare al legame degli aminoacidi nella sequenza prevista. Tuttavia, è necessario verificare se tutti i filamenti hanno reagito correttamente e se non sono state formate sequenze con aminoacidi mancanti, prodotti ridotti o modificati.
Lo scissione e la rimozione dei gruppi di protezione devono liberare il peptide e rimuovere determinati avvolgimenti chimici. Tuttavia, il solo fatto che il prodotto sia stato effettivamente liberato non indica quali altre sostanze si trovano nel materiale grezzo.
Il trattamento di depurazione serve a separare il materiale desiderato dai componenti indesiderati, ma anche la frazione depurata richiede comunque una conferma dell’identità e una valutazione della qualità.
La caratterizzazione strutturale e analitica finale invece deve rispondere alla domanda se il materiale isolato abbia le proprietà chimiche attese per il peptide di destinazione e se i metodi analitici utilizzati siano appropriati per l'uso previsto.
Si tratta di fasi concettuali e non di una istruzione di laboratorio. I reagenti specifici, l'apparecchiatura e le condizioni della reazione dipendono dal peptide obiettivo e richiedono una metodologia elaborata e validata adeguatamente.
Attaccatura alla resina e legatura del filo
La resina, il collante e il grado di indurimento svolgono diverse funzioni
Negli argomenti relativi alla SPPS vengono spesso menzionati tre termini: la resina, il legante e il grado di addizionamento, ovvero il loading.
Essi descrivono proprietà correlate ma diverse.
La resina è un materiale insolubile che funge da supporto.
Il legato chimico fornisce il collegamento tra questo trasportatore e il peptide o la prima residua amminoacidica. La sua chimica può influenzare sia il modo in cui il peptide viene legato che il suo successivo rilascio.
Loading invece descrive il numero di punti di connessione reattivi in relazione alla quantità di supporto.
Questi termini non sono sinonimi.
Due resine possono apparire fisicamente molto simili, pur avendo gruppi funzionali, collegamenti o gradi di polimerizzazione diversi. Queste differenze possono influire sulla disponibilità di siti reattivi durante la formazione del catenone, sul compattamento della resina e sulla forma chimica del peptide finale dopo la separazione.
Un altro elemento importante è il gruppo pianificato al C-end.
Diversi sistemi supporto-attacco possono essere selezionati, ad esempio in modo da ottenere un peptide concluso con un gruppo carbossilico o amidico.
Questa è una differenza chimica importante.
La modifica del gruppo terminale implica una modifica della stessa molecola, e non solo nel modo in cui essa è impacchettata o descritta.
La compressione influisce sull'accesso ai fili collegati
Le sostanze volatili utilizzate nelle SPPS assorbono il solvente e si espandono in contatto con l'ambiente liquido appropriato.
Questo modifica l'ambiente polimerico e può aumentare o ridurre lo spazio attraverso il quale i reagenti disciolti devono muoversi per raggiungere i filamenti peptidici legati alla proteina.
La curvatura non è quindi solo un’interessante caratteristica fisica.
Può influire sulla disponibilità di gruppi reattivi durante la sintesi.
Una analisi sistematica dei supporti a base di polistirene e PEG ha dimostrato che tali proprietà, come il tipo di legante e il grado di polimerizzazione della resina, influivano significativamente sulla compattazione nei solventi più ecologici studiati. Inoltre, è stato osservato che la compattazione può variare durante la rimozione dei gruppi di protezione e con l’allungamento del catetere peptidico. [2]
Questo dimostra che le proprietà della resina non sempre possono essere considerate come una sua caratteristica costante.
Nella pratica dipende dal funzionamento della resina, del solvente, del legante, del peptide aggiunto e dall'attuale stadio della sintesi.
Un buon compattamento o un esito positivo della reazione per una combinazione di resina, solvente e peptide non significa quindi che un'altra combinazione si comporti in modo identico.
Anche lo stesso passaggio di connessione richiede un controllo della qualità
Il primo stadio dell'aggregazione può sembrare semplice, poiché il reticolo peptidico sta appena iniziando a formarsi.
Un errore commesso in questo stadio può tuttavia rimanere presente durante tutta la successiva sintesi.
Se la prima rimanente parte viene inserita in modo errato oppure durante questo processo la sua configurazione stereomimetica cambia, l'inserimento corretto di tutte le rimanenti parti non deve necessariamente risolvere il problema iniziale.
In uno studio del 1992 è stata sviluppata una metodologia analitica appositamente concepita per misurare la racemizzazione che si verifica durante l’aggiunta di amminoacidi proteici a supporti stabili. [3]
Il significato di questo lavoro va oltre la semplice metodologia analitica utilizzata.
Questo dimostra che la qualità stereochimica può richiedere un controllo ancora prima dell'inizio dei cicli di prolungamento del filamento.
Anche la quantità di materiale inizialmente inserito nel supporto richiede una corretta interpretazione.
Il grado nominale di polimerizzazione della resina, il carico misurato sperimentally, la quantità di materiale grezzo recuperato dopo la separazione e la resa finale del peptide isolato e purificato sono dimensioni diverse.
Non devono essere considerati indicatori alternativi del successo della sintesi.
I fili più lunghi potrebbero diventare più difficili da reperire
Con l’allungamento del catenone peptidico, la stessa molecola unita inizia a influenzare il proprio ambiente chimico.
Le catene adiacenti possono interagire tra loro attraverso legami idridridici, interazioni idrofobiche e altre forze intermolecolari. Alcune sequenze possono mostrare una tendenza particolarmente forte a tali interazioni.
Questo può limitare l'accesso ai gruppi reattivi.
In tale situazione, l'aggiunta di un altro aminoacido può risultare più difficile, anche se all'interno del sistema è stato introdotto un quantitativo apparentemente sufficiente di agente di legame.
In uno studio riguardante le sequenze difficili e suscettibili di aggregazione, sono state confrontate diverse metodologie di aggrego e sono stati analizzati i prodotti grezzi ottenuti. I risultati supportano la teoria secondo cui il processo dovrebbe essere adattato alla specifica sequenza, anziché presupporre l'esistenza di una strategia di aggrego che sia sempre la migliore. [4]
Questo spiega anche perché un semplice aumento del grado di addizione della resina o della quantità di reagente non risolve automaticamente tutti i problemi.
Se il problema principale è l'accesso limitato ai siti reattivi, diventa più importante la questione se l'additivo è effettivamente arrivato nei siti appropriati e se la reazione si è svolta in modo efficiente senza l'insorgenza di quantità inaccettabili di prodotti secondari.
Protezione, rimozione dei gruppi di protezione e collegamento
Le squadre di sicurezza controllano il luogo della reazione
Le amminoacidi contengono gruppi chimici in grado di partecipare a diverse reazioni.
Durante la sintesi controllata del peptide, gli scienziati di solito vogliono che un particolare gruppo amino reagisca con un blocco specifico che contiene un gruppo carbossilico, mentre gli altri punti potenzialmente reattivi rimangono temporaneamente inattivi.
È proprio questo che servono i gruppi di protezione.
In questo modo bloccano temporaneamente i punti di reazione selezionati, consentendo ad un altro punto di partecipare alla reazione pianificata.
Nella strategia SPPS comunemente utilizzata, basata sull’FMOC, il gruppo amino finale della catena ramificata rimane protetto tra i successivi passaggi di legame. Quando viene aggiunto un altro aminoacido, la protezione temporanea viene eliminata, rivelando il gruppo amino.
Le catene laterali reattive possono avere gruppi di protezione separati, progettati in modo da rimanere intatte durante i cicli di costruzione ripetuti del catene principali.
L'obiettivo è la selezione controllata.
Un blocco adatto, che contenga un gruppo carbossilico, dovrebbe legarsi a un gruppo amino appropriato, invece di portare a una prolungazione incontrollata o ad altre reazioni competitive.
L'ortogonalità significa la possibilità di rimuovere selettivamente i dispositivi di protezione
La strategia ortogonale dei gruppi di protezione consente di rimuovere un gruppo di protezione in circostanze in cui gli altri mezzi di sicurezza necessari rimangono in misura sufficiente inalterati.
Questo permette al chimico di rivelare in modo controllato diversi siti reattivi in ciascuno dei diversi stadi della sintesi.
Fmoc e Boc sono termini ben noti nella chimica dei peptidi, ma non indicano diversi tipi di legami peptidici né diverse strutture terminali del peptide.
Si tratta di gruppi di protezione legati a diverse strategie di sintesi e a diverse metodologie per la loro eliminazione.
La via chimica temporanea utilizzata durante la costruzione del peptide deve quindi essere distinta dalla sua struttura definitiva.
Anche le misure di sicurezza non offrono una protezione completa contro tutte le possibili reazioni avverse.
Gli studi sul processo di formazione dell’aspartimide mostrano, ad esempio, che la strategia di protezione, le rimanenti amminoacidi circostanti e le condizioni di eliminazione dei gruppi di protezione possono influire sulla formazione di contaminanti anche nei metodi SPPS ben noti. [5] [6]
La strategia dei gruppi di protezione quindi limita determinate reazioni indesiderate, ma non elimina la necessità di controllo del processo né la caratterizzazione finale analitica.
La proteina forma un altro legame amidico strutturale del peptide.
La reazione di legame porta alla formazione di un altro legame amidico nel scaglione peptidico.
Il blocco amminoacidico che contiene un gruppo carbossilico è solitamente attivato chimicamente per consentire una reazione efficace con il gruppo amminico scoperto del peptide in crescita legato alla proteina.
Dopo la fine del reagzionamento, l'eccesso di materiale solubile può essere eliminato mediante lavaggio.
L'aminoacido appena aggiunto diventa quindi la parte finale del catetere crescente. Successivamente è possibile rivelare il suo gruppo amminico e iniziare un nuovo ciclo di legame.
In teoria, ripetere questa sequenza permette di controllare l'ordine delle aminoacidi controllando l'ordine di introduzione dei blocchi di costruzione.
In pratica, tuttavia, esiste una importante eccezione:
La reazione chimica pianificata deve effettivamente svolgersi correttamente in ogni ciclo.
Se una connessione è incompleta, una parte dei cavi potrebbe non ricevere la rimanente lunghezza prevista.
Se rimangono legati alla colina e reagiscono correttamente nel successivo ciclo, possono formare sequenze deleciche, ovvero molecole del peptide prive di uno o più amminoacidi previsti.
Altri fili possono rimanere accorciati.
Il lavaggio rimuove i reagenti e i prodotti di scarto solubili, ma non elimina selettivamente tutti i catene anormalmente strutturate che rimangono covalentemente legate al supporto.
Le piccole perdite possono accumularsi in molti cicli.
Il carattere ripetitivo del SPPS porta a un problema matematico significativo.
Una piccola imperfezione in un singolo passaggio può sembrare insignificante, ma dopo molte ripetizioni i suoi effetti possono accumularsi.
Consideriamo un semplice esempio matematico.
Se la sintesi del peptide richiedesse 50 fasi di legame e ciascuna di esse avesse indipendentemente un 99% di probabilità di successo, il tasso teorico di molecole che avrebbero superato con successo tutte le 50 fasi sarebbe stato di circa il 60,5%.
Questa è solo un'illustrazione.
Essa presuppone che tutti gli stadi si comportino in modo identico e indipendente. Non tiene conto dei problemi di rimozione dei gruppi protettivi, delle reazioni avverse, delle perdite durante lo scissione e la purificazione, dell'aggregazione o di molti altri fattori reali.
Pertanto, non bisogna interpretare questo risultato come una previsione della reale produttività della produzione.
Questo esempio dimostra semplicemente perché anche una rendimento molto elevato dei singoli step non garantisce un prodotto grezzo chimicamente semplice dopo diverse decine di ripetizioni.
Pertanto, il monitoraggio della sintesi e il controllo delle contaminazioni sono importanti durante l'intero processo di sintesi del peptide, e non solo dopo l'aggiunta dell'ultimo amminoacido.
L’automazione, il riscaldamento e altre soluzioni tecnologiche possono accelerare la sintesi, ma la velocità del processo deve sempre essere valutata insieme alla qualità del prodotto.
Lo studio sui SPPS supportati da microonde ha analizzato la restrizione del tipo di residuo e la formazione di aspartimid, mostrando perché le condizioni della reazione devono ancora essere adattate alle proprietà della specifica sequenza. [7]
Lo scarto e il recupero del prodotto greggio
Lo sciacquaggio libera il prodotto dal supporto
Dopo la costruzione della sequenza peptidica prevista, il peptide deve solitamente essere separato chimicamente dal supporto.
Questo stadio viene definito scissione, ovvero de-epilazione.
La disgregazione interrompe la connessione chimica progettata intenzionalmente tra il peptido e il vettore.
A seconda della strategia adottata, lo scissione può avvenire simultaneamente alla rimozione di parte o di tutte le componenti della proteina di protezione delle catene laterali. In altri processi, la proteina o un suo frammento può essere rilasciata mantenendo alcune delle sue protezioni, se sono previste ulteriori trasformazioni chimiche.
La corretta chimica di rilascio dipende dal ponte e dalla molecola di destinazione.
Le condizioni che liberano efficacemente un singolo peptide possono danneggiare la parte chimicamente sensibile di un altro.
Pertanto, la desacrilazione descrive un obiettivo chimico, e non un insieme universale di reagenti o condizioni adatte a tutti i peptidi.
Analogamente, la struttura corretta del proteina non dimostra che tutti i gruppi di protezione siano stati successivamente efficacemente rimossi.
Il collegamento della catena e la rimozione finale dei dispositivi di sicurezza rispondono a diverse domande chimiche e richiedono una valutazione separata.
Le condizioni di disintossicazione possono influire sul profilo delle sostanze inquinanti
Lo scissione non deve essere un processo chimicamente neutro.
La rimozione dei gruppi di protezione e la separazione del peptide dal supporto possono portare alla formazione di forme chimiche reattive in grado di modificare il peptide o altri componenti della miscela.
Pertanto, nei metodi sviluppati possono essere utilizzate le cosiddette scavengery, ovvero le sostanze in grado di catturare determinati prodotti reattivi indesiderati e di influenzare la formazione di prodotti secondari.
In uno studio del 2019 sono stati analizzati diversi scavengeri durante la separazione dell’exenatide dalla polimerizzazione peptidica e si è dimostrato che la loro scelta influiva sulla qualità del prodotto greggio e sul profilo delle impurità osservato. [8]
Non si deve basare questa ipotesi su una formulazione universale per il depolveraggio.
La ricerca mostra tuttavia che le condizioni di questo stadio possono influire sulla qualità del prodotto e pertanto devono essere valutate per il particolare peptide e il sistema di gruppi di protezione utilizzato.
Il processo di separazione corretta ha quindi diversi aspetti.
Il peptide deve essere opportunamente separato, i gruppi di protezione richiesti devono essere eliminati, il materiale di destinazione deve essere recuperato e le trasformazioni chimiche indesiderate devono essere controllate.
Il recupero del prodotto greggio non è un processo di purificazione finale
Dopo la separazione, viene effettuato un processo che consente di separare il materiale contenente il peptido dalla resina fissa e dalle altre componenti della miscela reattiva.
In questo caso è possibile sfruttare le differenze nella solubilità, nell’attaccabilità o in altre proprietà chimiche.
Il recupero di una particella visibile o di una frazione contenente un peptide non dimostra tuttavia che il materiale consista esclusivamente nel prodotto previsto.
In questo stadio di sviluppo si parla solitamente di peptido crudo.
Può contenere la molecola di destinazione insieme a sequenze di delezione, a catene abbreviate, a peptidi chimicamente modificati, a strutture non completamente sbloccate, a materiali derivati da reagenti e ad altre contaminazioni.
La rilevanza dei singoli inquinanti dipende dalla sequenza, dalle condizioni di sintesi e dall'uso previsto.
In uno degli studi, il separatore cromatografico è stato combinato con la spettrometria di massa per caratterizzare i prodotti SPPS grezzi e assegnare i singoli picchi cromatografici ai rispettivi peptidi. [9]
Questo dimostra perché le informazioni ottenute attraverso i metodi separativi e strutturali si completano a vicenda.
La cromatografia può rivelare la presenza di molti componenti, mentre la spettrometria di massa può fornire ulteriori informazioni che aiutano a determinare cosa possano essere alcuni di essi.
La purificazione e la conferma dell’identità rispondono a diverse domande
Il trattamento di purificazione mira a concentrare o isolare la particella di interesse tra gli altri componenti.
L'identificazione invece risponde alla domanda se il materiale isolato abbia effettivamente le proprietà chimiche attese.
Queste domande sono parzialmente complementari, ma non sono identiche.
Un pic cromatografico ben delimitato non costituisce automaticamente una prova completa della struttura della molecola.
Analogamente, il raggiungimento della massa molecolare prevista da sola non rappresenta una valutazione completa della purezza o della validità strutturale.
Le varianti strettamente affini della sequenza, le isomere stereo o le forme chimicamente modificate possono essere difficili da distinguere o da separare.
La metodologia di purificazione dovrebbe quindi essere valutata in relazione alla miscela effettiva risultante durante la sintesi in questione, e non considerata sufficiente solo perché ha funzionato con un altro peptide.
Se la molecola finale richiede anche la formazione di ponti disiarici, ciclicazioni o altre trasformazioni dopo la fine della catena di assemblaggio, sorgono ulteriori domande analitiche sulla corretta funzionalità dei collegamenti, sulla uniformità strutturale e sul fatto che sia realmente stata ottenuta la forma matura desiderata della molecola.
Vantaggi, limitazioni e fonti di inquinamento
Perché la SPPS è così ampiamente utilizzata?
Una delle principali vantaggi delle SPPS è la possibilità di mantenere il peptide in sospensione durante la sostituzione ripetuta dei reagenti liquidi.
Questo semplifica le operazioni chimiche ripetitive e consente l'automazione.
I chimici possono introdurre una sequenza pianificata di blocchi di aminoacidi strutturali e, se la chimica del processo lo consente, anche alcuni amminoacidi non standard e altre modifiche.
I sistemi automatici moderni mostrano fino a che punto è possibile sviluppare questa concezione.
In uno studio sulla sintesi fluida automatizzata del 2020 è stato descritto il processo di produzione di catene proteiche che contengono fino a 164 residui aminoacidici. Dopo un ulteriore processo di purificazione e folding, sono stati ottenuti materiali funzionali. [10]
Si tratta di un esempio impressionante delle possibilità tecniche.
Non significa tuttavia che ogni sequenza di lunghezza 164 residui — né ogni peptido o proteina lungo — possa essere ottenuta con la stessa facilità.
Non significa inoltre che la purificazione e la caratterizzazione strutturale diventino inutili.
Lo studio mostra piuttosto quali risultati si possono ottenere grazie a un sistema ben sviluppato per le molecole selezionate correttamente.
L'automazione controlla l'esecuzione del processo.
Non è tuttavia in grado di trasformare la chimica inadeguata in quella adeguata.
Pertanto, è necessario analizzare la performance dell’apparecchio, la sequenza del peptide e il comportamento della stessa molecola in modo globale.
Come si formano le tipiche contaminazioni?
Durante la SPPS possono verificarsi diversi percorsi che portano alla formazione di inquinanti. La comprensione di questi aiuta a spiegare perché gli studi analitici finali sono ancora necessari.
Una sequenza delecionale o un prodotto ridotto può formarsi quando l'associazione prevista dell'aminoacido non riesce o quando la crescita del filamento viene interrotta. Poiché un filamento non corretto può continuare ad essere legato alla resina, il successivo lavaggio non deve eliminarlo.
L'epimerizzazione implica una modifica della configurazione stereochimica del centro corrispondente. Ciò ha un significato analitico particolare, poiché l'epimer può avere la stessa massa molecolare nominale del peptido originale, pur essendo caratterizzato da una configurazione spaziale diversa.
I prodotti derivati dall’aspartamide possono essere prodotti come conseguenza di reazioni secondarie dipendenti dalla sequenza delle restanti amminoacidi dell’aspartato. A seconda del corso chimico, può essere presente più di un tipo di prodotto simile.
L'eliminazione incompleta dei gruppi proteici avviene quando il gruppo che deve essere eliminato rimane legato alla molecola. Il peptide può quindi avere la lunghezza di catena nominalmente prevista, ma continuerà comunque a presentare una struttura chimica anomala.
Le modifiche associate alla deacetillazione possono verificarsi durante il rilascio finale del peptide o durante la rimozione dei gruppi di protezione. Pertanto, la corretta struttura della catena non garantisce che il peptide superi il passaggio della deacetillazione senza modifiche.
Le reazioni incomplete associate all’aggregazione possono tuttavia verificarsi quando le catene formate interagiscono in modo da limitare l’accesso ai siti reattivi. L’introduzione di una quantità sufficiente di reagente nel recipiente reattivo non garantisce che ogni sito reattivo sia fisicamente accessibile e reagisca in modo adeguato.
Queste sono possibili vie di formazione delle inquinanti.
Non significa che ogni partita ottenuta tramite il sistema SPPS debba contenere tutti i tipi di irregolarità menzionati.
La loro importanza nella sintesi specifica è determinata sulla base della conoscenza del processo, delle analisi analitiche e della corretta qualità di controllo.
I peptidi naturali complessi richiedono qualcosa di più della riproduzione della sequenza.
Alcuni peptidi sono strutturalmente molto più complessi di quanto risulti dalla sequenza lineare di aminoacidi stessa.
Un buon esempio è l’epidermina.
La caratteristica strutturale dell’epidermide ha evidenziato la presenza di numerosi anelli contenenti azoto e di resti insoliti. [11]
Solo la ricostruzione della sequenza lineare degli aminoacidi non sarebbe quindi un valido indizio che si sia ottenuta un epidermide matura autentica.
Questa distinzione è importante durante l'interpretazione delle pubblicazioni o delle ricerche relative alla sintesi dell'epidermide in fase stabile.
La pubblicazione può descrivere un precursore lineare, un frammento, un analogo o un'altra struttura affini, anziché la sintesi completa e completa della molecola matura.
La pubblicazione strutturale citata qui come [11] descrive la caratterizzazione dell'epidermide stessa; non è un rapporto sulla sua sintesi totale mediante la metodologia SPPS.
Le affermazioni sulla sintesi totale devono quindi essere valutate in relazione alla struttura effettiva della molecola finale, e non solo alla sua sequenza lineare di amminoacidi.
La produttività, la purezza e l'identità devono essere presentate separatamente
Tre concetti spesso confusi nei dibattiti sulla sintesi dei peptidi sono la produttività, la purezza e l'identità.
Una grande massa di prodotto recuperato non significa necessariamente che la maggior parte di questo materiale sia effettivamente il peptido previsto. Il materiale grezzo può contenere significative quantità di impurità.
Una purezza cromatografica elevata non conferma automaticamente tutti gli aspetti dell'identità strutturale.
Anche un peptide la cui struttura chimica è stata accuratamente caratterizzata non garantisce automaticamente un utilizzo biologico, terapeutico o clinico confermato.
Si tratta di questioni distinte.
Un'accurata descrizione della sintesi dovrebbe quindi indicare quale fosse la particella di riferimento, quale fosse lo stadio raggiunto nella produzione, se il materiale analizzato fosse crudo o purificato e quali dati analitici fossero stati utilizzati per confermare le affermazioni relative alla struttura.
Grazie a questo, i risultati della sintesi possono essere interpretati e confrontati in modo più affidabile.
Un valore percentuale o una massa non devono essere trasformati in una affermazione generale secondo cui il peptido è „di alta qualità”, senza conoscere cosa è stato effettivamente misurato.
Domande frequenti
1. Perché nella SPPS viene utilizzata la fase costante?
La fase stazionaria mantiene il peptido in sospensione sul supporto, mentre i reagenti solubili, i prodotti di scarto della reazione e i solventi di lavaggio possono essere introdotti e rimossi più volte. Ciò semplifica notevolmente la ripetizione della catena e consente l'automazione della sintesi dei peptidi, come ad esempio le moderne metodologie di sintesi automatica a flusso continuo. [10] Tuttavia, il supporto non garantisce che ogni reazione avverrà in modo perfetto né separa correttamente il catenone non strutturalmente corretto dalla matrice. La sua principale vantaggia è quella di facilitare la conduzione del processo. La selettività chimica, la completezza della reazione, la purezza e l'identità strutturale continuano a richiedere una valutazione separata.
2. L’integrazione in fase stazionaria elimina la necessità di purificazione?
No. Le catene peptiche anormali possono rimanere attaccate alla resina durante la sintesi e poi essere rilasciate insieme al prodotto previsto. Studi che analizzano i prodotti grezzi SPPS mediante cromatografia e spettrometria di massa mostrano che il lavaggio durante la sintesi e la purificazione finale svolgono funzioni diverse. [9] Il lavaggio rimuove principalmente i componenti solubili che circondano la resina, mentre la purificazione dopo la separazione ha lo scopo di separare il peptido desiderato dai componenti peptoidi e non peptoidi indesiderati. L'SPPS semplifica le operazioni intermedie, ma non garantisce la purezza finale.
3. Significa la „fase stazionaria” che non si utilizza il solvente?
No. In una SPPS convenzionale, il supporto insolubile è solitamente circondato da reagenti liquidi e solventi. I solventi influenzano l’ambiente fisico della resina, tra l’altro il grado di fragilità e la facilità con cui i reagenti possono raggiungere le catene aderenti. Studi sperimentali hanno dimostrato che il fragilizzamento della resina è dipendente dal solvente e che le variazioni sono correlate alla chimica del legame, al grado di affinità e all’allungamento del catena. [2] La resina e il solvente quindi formano insieme un ambiente di reazione.
4. In quale direzione cresce il peptide durante la SPPS?
La SPPS convenzionale generalmente costruisce il peptide dalla sua parte C-terminale verso il N-terminale. Il primo amminoacido che deve costituire il C-terminale della molecola finale viene legato al supporto, mentre le successive restrizioni allungano il lato aminoacido scoperto del catetere. Le metodologie pubblicate basate su Fmoc mostrano questo schema tipico. [1] Tuttavia, esistono strategie specializzate che utilizzano la fase stazionaria e possono presentare una progressione diversa.
5. La resina e il collante significano la stessa cosa?
No. La resina è un vettore insolubile, mentre il legante è una connessione chimica tra il vettore e il peptide in crescita. La funzionalità del legante può, indipendentemente dal polimero stesso, influenzare l'adesione, la conservazione della resina e il successivo rilascio del peptide. Le ricerche sui vettori utilizzati nella sintesi dei peptidi mostrano che il semplice riferimento al tipo di resina potrebbe non essere sufficiente per descrivere il comportamento dell'intero sistema. [2]
6. Il maggior grado di polimerizzazione della resina aumenta sempre la produzione?
No. Una carica più elevata significa un maggior numero di possibili punti di accoppiamento per una determinata quantità di supporto, ma non deve necessariamente portare a un aumento della quantità di peptide correttamente strutturato e recuperabile. Il grado di carica può alterare l’ambiente molecolare locale e è stato sperimentato come uno dei fattori che influenzano la fragilizzazione della resina. [2] Se i filamenti accoppiati sono eccessivamente compatti o fortemente interconnessi, la disponibilità di punti reattivi può peggiorare. La carica deve quindi essere analizzata insieme alle proprietà della resina, al comportamento della sequenza, alla performance della reazione e alla qualità del prodotto finale.
7. Perché gli amminoacidi vengono proteggersi durante la sintesi del peptide?
Le protezioni temporanee impediscono temporaneamente ai gruppi reattivi selezionati di partecipare alle reazioni mentre si forma un legame specifico. Ciò consente una deposizione progressiva e controllata del catena. Tuttavia, la protezione non elimina tutte le reazioni secondarie. Studi su sistemi modellati hanno dimostrato, ad esempio, che la strategia delle protezioni e la sequenza circostante possono influenzare la formazione di aspartimidio. [5] Le protezioni forniscono quindi una selezione chimica, ma l'intera strategia di protezione e deprotezione richiede ancora una pianificazione e una valutazione accurata.
8. Cosa significa la protezione ortogonale dei gruppi funzionali?
L'ortogonalità implica la possibilità di rimuovere un gruppo di protezione in condizioni che lasciano altre protezioni necessarie in misura sufficiente intatte. Ciò consente di rivelare determinati siti reattivi durante le fasi di sintesi pianificate. Le metodologie SPPS consolidate si basano sul controllo del protezionamento e del deprotezionamento, invece che sul rivelamento simultaneo di tutti i gruppi reattivi. [1] Tuttavia, la reale conformità dei gruppi di protezione utilizzati rimane comunque dipendente dalla molecola di destinazione e dalle condizioni della reazione.
9. Le parole Fmoc e Boc significano diversi tipi di peptidi?
No. Fmoc e Boc sono gruppi proteici e strategie sintetiche associate a questi, non diversi tipi di struttura peptidica. Le differenze nella loro eliminazione chimica influenzano il modo in cui viene condotta la sintesi, ma la chimica protettiva temporanea non deve essere confusa con la struttura finale del peptide di destinazione. I metodi pubblicati basati su Fmoc mostrano uno dei vari SPPS più comunemente utilizzati, ma questo non significa che ogni peptide debba essere ottenuto con tale metodo. [1]
10. Può già il primo stadio dell'integrazione causare inquinamento?
Sì. L'attacco covalente può influire sulla qualità stereochimica ancora prima dell'inizio del prolungamento ripetuto del catene. Sono state sviluppate metodologie analitiche appositamente concepite per rilevare la racemizzazione durante l'attacco di amminoacidi protetti con le resine. [3] Ciò non significa che ogni attacco causi una racemizzazione significativa. Tuttavia, indica che l'attacco stesso è un passaggio chimicamente rilevante durante il quale possono verificarsi variazioni misurabili che devono essere considerate nell'ambito della valutazione complessiva della qualità.
11. Perché alcune sequenze peptoidali sono definite difficili da studiare?
Alcuni filamenti peptidici in crescita interagiscono tra loro o con filamenti vicini in modo da limitare l'accesso ai siti reattivi. Le leghe idriche, gli effetti idrofobici e le reazioni che ricordano l'aggregazione possono rendere più difficile la successiva legatura. Gli studi sulle sequenze suscettibili di aggregazione mostrano che la modifica del modo di legatura può influire sulla composizione del prodotto finale. [4] La difficoltà della sintesi dipende quindi dalle proprietà della molecola e dalle condizioni della reazione, e non solo dalla lunghezza del peptide.
12. L'assimilazione più rapida significa sempre un prodotto migliore?
No. La velocità di sintesi e la qualità del prodotto sono parametri separati. Il riscaldamento, l’assistenza a microonde e l’automazione possono ridurre il tempo del processo, ma accelerare la reazione può anche cambiare l’equilibrio tra reazioni desiderate e secondarie. Le ricerche sulla sintesi assistita da microonde hanno evidenziato una correlazione tra la restrizione del tipo di residuo e la formazione di aspartimid, indicando la necessità di un’adeguata regolazione dei parametri. [7] Un tempo di sintesi più breve è vantaggioso solo se il materiale ottenuto soddisfa anche i requisiti chimici e analitici richiesti.
13. La rimozione della colla significa semplicemente l’eliminazione dei granuli di colla?
No. La despolimerizzazione è un processo chimico che porta alla rottura del legame progettato tra il peptido e il vettore. La rimozione dei granuli di colla tramite filtrazione è invece un’operazione fisica che non conferma in sé la corretta esecuzione della chimica della despolimerizzazione. L’attivazione del peptido può avvenire simultaneamente alla rimozione dei gruppi di protezione e ad altre reazioni. Gli studi sui scavenger utilizzati durante la despolimerizzazione mostrano che questo passaggio può influire sul profilo delle impurità. [8]
14. La grande efficienza del prodotto grezzo significa una grande purezza del peptido?
No. La resa è la quantità di materiale recuperato prima di rimuovere tutti gli ingredienti indesiderati. Questo materiale può includere il peptide target insieme alle sequenze di delezione, alle strutture modificate, ai restanti gruppi di protezione e ad altri contaminanti. Gli studi sulle miscele SPPS crude utilizzando cromatografia e spettrometria di massa mostrano perché la massa recuperata, la purezza e l’identità molecolare richiedono una interpretazione separata. [9] Pertanto, una resa accuratamente descritta dovrebbe indicare il passaggio in cui è stata misurata e se il materiale è stato già purificato.
15. La SPPS consente di ottenere lunghe catene peptidiche?
Sì. Le metodologie SPPS ben sviluppate possono consentire di ottenere catene molto lunghe. In studi sulla sintesi automatica a flusso, sono stati ottenuti catene che contenevano fino a 164 residui, che sono stati successivamente trattati per la purificazione e la folding prima della valutazione funzionale. [10] Ciò dimostra le possibilità della sintesi peptidica moderna, ma non significa che ogni sequenza di lunghezza simile possa essere ottenuta con la stessa efficienza. La lunghezza è solo uno dei fattori; anche la aggregazione dipendente dalla sequenza, le reazioni secondarie, i requisiti per la folding e la difficoltà della purification sono importanti.
16. La costruzione di una sequenza epidermica significa effettuare la sua sintesi completa?
No. L’epidermide matura contiene elementi strutturali insoliti, tra cui anelli contenenti azoto che vanno oltre la semplice sequenza lineare degli amminoacidi. Ciò è stato dimostrato in studi strutturali. [11] L’ottenimento di una sequenza lineare, un precursore o un frammento non significa quindi automaticamente la sintesi di una molecola completa e matura. La tesi della sintesi completa richiede dati analitici che confermino la ricostruzione dei collegamenti previsti e di altri elementi strutturali importanti.
17. La massa molecolare prevista conferma la struttura nella sua interezza?
No. La determinazione della massa molecolare prevista fornisce informazioni preziose, ma la massa da sola non conferma tutti gli aspetti della struttura del peptide e non esclude tutte le impurità rilevanti. Due molecole possono avere la stessa massa nominale pur presentando differenze nella stereosità o nell’organizzazione strutturale specifica. Gli studi che coinvolgono la separazione dei peptidi epimerici dimostrano perché le differenze stereosottili possono richiedere metodi analitici in grado di distinguere strutture che non possono essere individuate esclusivamente mediante la misurazione della massa. [12] La caratterizzazione finale deve pertanto essere progettata tenendo conto delle impurità realistiche e delle strutture alternative che possono emergere durante una particolare sintesi.
Sintesi
La sintesi dei peptidi a fase solida ha cambiato la chimica dei peptidi, consentendo di mantenere un filamento in crescita su un supporto insolubile durante l'inserimento ripetuto, la reazione e la rimozione degli agenti disolubili. Ciò facilita la costruzione progressiva della sequenza e costituisce una base pratica per la sintesi automatica.
La apparente semplicità di questa metodologia non dovrebbe tuttavia nascondere la complessità della chimica che si svolge in ogni fase.
La resina, il legante e il grado di polimerizzazione influenzano le proprietà ambientali della sintesi. Il compattamento dipendente dal solvente influenza l’accesso alle catene legate alla resina. Le classi di protezione controllano quali gruppi funzionali possono reagire, mentre le reazioni di legame formano lo scheletro peptidico delle restanti molecole. [1] [2]
Ogni di questi passaggi ha anche i suoi limiti.
L'accostamento iniziale può influire sulla qualità stereomiche.[3] Le sequenze difficili possono aggregare e ridurre l'accesso agli attivatori. [4] La chimica di protezione e rimozione dei gruppi di protezione può favorire le reazioni secondarie, come l'assorbimento di aspartimidio. [5] [6] Le condizioni di sintesi accelerate possono alterare il grado di racemizzazione o il profilo delle impurità. [7] Le condizioni di separazione possono inoltre influenzare la composizione del prodotto grezzo. [8]
Pertanto, la costruzione corretta del filamento non è sinonimo di un peptide puro e correttamente identificato.
Il recupero del prodotto greggio, la purificazione e la caratterizzazione strutturale restano fasi separate. La cromatografia può fornire informazioni sulla composizione della miscela e sulla purezza, mentre la spettrometria di massa e altre metodologie analitiche forniscono informazioni sull’identità. Nessun singolo risultato analitico deve confermare tutti gli aspetti della struttura del peptide. [9] [12]
La sintesi fluida automatizzata moderna dimostra che, con condizioni appropriate, SPPS può essere applicata anche a catene molto lunghe. [10] Allo stesso tempo, i peptidi strutturalmente complessi, come l'epidermina, dimostrano perché la ricostruzione strutturale della sequenza lineare di amminoacidi può non essere sufficiente se la molecola matura contiene ulteriori anelli, residui insoliti o un particolare sistema di legami. [11]
È meglio comprendere lo SPPS non come una reazione singola, ma come una sequenza di fasi chimiche e analitiche distinte.
L'attacco stabilisce il punto di partenza. I cicli ripetuti di protezione, sbloccaggio e fissaggio costruiscono un insieme pianificato. Lo sbloccaggio libera il prodotto. La purificazione separa la particella destinata dal resto indesiderato. La caratterizzazione finale consente di stabilire se il materiale isolato ha effettivamente la struttura e la qualità attribuite.
La separazione di questi stadi permette di evitare alcuni comuni fraintendimenti: la sintesi riuscita non conferma automaticamente la purezza, la produttività elevata non conferma automaticamente l'identità, e la massa molecolare prevista da sola non dimostra la completezza della struttura strutturale.
Riferimenti
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Sintesi peptidica in fase solida: dai metodi standard alla sintesi di sequenze complesse. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K. e Willway, H. (2020). Investigazione dei parametri che influenzano la gonfiabilità della resina nei solventi verdi. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Utilizzo del reagente Marfey per quantificare la racemizzazione durante l’anchilamento degli aminoacidi su supporti solidi per la sintesi di peptidi. Biochimica Analitica, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Valutazione dell’uso combinato di Oxyma e HATU per l’aggregazione delle sequenze peptiche. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Il problema dell’aspartimide nell’SPPS a base di Fmoc. Parte I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Il problema dell’aspartimide nell’SPPS a base di Fmoc. Parte II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limitazione della racemizzazione e della formazione di aspartimide nella sintesi a fase solida di peptidi Fmoc potenziata con il microonde. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzenedimethanethiol (1,4-BDMT) come rimedio per le scissioni delle resine peptidiche più ecologiche. RSC Avanzata, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D. e Pallai, P. (1991). La caratterizzazione dei prodotti grezzi della sintesi peptidica a fase solida mediante spettrometria di massa mu-HPLC/fast atom bombardment. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E. e Pentelute, B. L. (2020). Sintesi di proteine mediante una chimica a flusso automatizzato. Scienza, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: Sequenziamento di un antibiotico heterodico tetraciclico a base di amido peptidico 21. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Studi di racemizzazione nella sintesi di peptidi mediante la separazione di peptidi epimerici protetti mediante cromatografia liquida ad alta performance in fase inversa. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x