Synthese van peptiden in vaste toestand (SPPS): principes en fasen

De vaste-fase-peptidensynthese (SPPS), ook wel bekend als peptide synthese op vaste fase (PSPS), is een chemische methode om aminozuren in een opeenvolging te synthetiseren, waarbij het ene uiteinde van de gevormde keten chemisch verbonden blijft met een onoplosbaar drager.

In plaats van het opgerolde peptide na elke reactie af te scheiden, laten de chemici het aan het vaste fase-element koppelen door het toevoegen en verwijderen van verdere vloeibare reactiemiddelen en oplosmiddelen. De herhaalde cycli maken het mogelijk om de reactieve aminogroep te onthullen, een nieuw aminozuur aan te sluiten en oplosbare bestanddelen die niet langer nodig zijn te verwijderen. Nadat de geplande aminozuursequentie is voltooid, kan het peptide worden losgekoppeld van het drager en vervolgens verder verwerkt en geanalyseerd.

Deze procesorganisatie is een van de belangrijkste redenen waarom SPPS een zo belangrijk instrument is geworden in de chemie van peptiden. De vaste fase vereenvoudigt het uitvoeren van veel herhaalbare chemische reacties en heeft de automatisering van de synthese mogelijk gemaakt.

Het gemak van de synthese op de vaste fase betekent echter geen garantie voor een chemisch perfecte kwaliteit.

Het aanbrengen van het opkomende peptide op een drager garandeert niet dat elke keten alle geplande aminozuren zal ontvangen. Het betekent ook niet dat het materiaal dat aan het einde van het proces vrijkomt chemisch schoon zal zijn of een juiste structuur zal hebben.

Het samenstellen van de keten, het verwijderen en herwinnen van het product, het reinigen, het bevestigen van de identiteit en de uiteindelijke structurele karakterisering zijn afzonderlijke onderdelen van het hele proces.

Huidige methodologische publicaties tonen zowel het nut van SPPS als de noodzaak om standaardmethoden aan te passen bij moeilijke sequenties. In een van de gepubliceerde methoden die gebruikmaken van de Fmoc-strategie wordt bijvoorbeeld een routinematige synthese beschreven, maar ook een aangepast benadering voor peptidensequenties die vatbaar zijn voor aggregatie. [1]

Het begrijpen van de SPPS vereist dus meer dan het onthouden van de volgende chemische stappen. Ook moet men weten wat het doel van elke stap is, wat er tijdens de stap mogelijk fout kan gaan en welke analytische vragen er nog moeten worden beantwoord na de voltooiing van de stap.

Wat is de synthese van peptiden in een vaste fase?

De opkomende peptyd blijft aan elkaar gekoppeld en de oplossingen veranderen.

In conventionele SPPS wordt het peptide chemisch aan kleine, niet-opgeloste deeltjes gekoppeld, meestal wel genoemd vezelgranulaat, met behulp van een geschikte chemische verbinding.

De zaden blijven in de reactiebaan, terwijl de volgende vloeibare reactiemiddelen en oplossingen worden toegevoegd en verwijderd.

Dit vereenvoudigt de herhaalde synthese aanzienlijk.

In de klassieke, stapelbare synthese kan het isoleren en reinigen van het groeiende peptide na elke aanbinding van een aminozuur een belemmering zijn. In SPPS blijft de gevormde keten verbonden met de onoplosbare fase. Hierdoor kunnen oplosbare overschotten aan reactiemiddelen en veel bijproducten worden verwijderd door het spoelen, terwijl het peptide dat aan het vezelbindmiddel is gekoppeld, op zijn plaats blijft.

De term „vaste fase” kan echter tot misverstanden leiden.

Dit betekent niet dat de vorming van peptidharen plaatsvindt zonder de aanwezigheid van vloeistof of oplosmiddel.

De hars wordt meestal omringd door een vloeibare reactieve omgeving en de interactie met de oplosmiddel kan een aanzienlijke invloed hebben op de synthese. De reactiemiddelen moeten nog steeds in of rondom het polymeer milieu bewegen en de reactieve plekken van het groeiende peptide bereiken.

De aanbinding van een peptide aan een drager heeft doorgaans een covalente aard. Dit betekent dat de gevormde molecule met de drager wordt verbonden via een verbindingsmiddel door chemische binding.

Het peptide is dus niet gewoon vastgehouden tussen de deeltjes, vastgehouden door een filter of los op het oppervlak geplaatst.

Deze chemische verbinding wordt doelbewust zo ontworpen dat de aanwezige keten tijdens de volgende reacties en het spoelproces wordt gehouden, en later kan worden losgelaten onder de juiste omstandigheden.

Conventionele synthese verloopt van het C-einde naar het N-einde.

De klassieke lineaire SPPS-strategie begint meestal met een aminozuur dat in het uiteindelijke peptide de C-terminus zal vormen.

De rest wordt aan het drager bevestigd.

Na het onttrekken van de juiste reactieve aminozuurgroep wordt een ander beschermd aminozuur toegevoegd en wordt chemisch aan de aanwezige keten gekoppeld. Het herhalen van dit proces verlengt het peptide geleidelijk naar de N-punt.

Het is de moeite waard om deze richting te benadrukken, omdat deze verschilt van de biologische proteïnesynthese via de ribosomen.

Synthese via ribosomen verlengt het polypeptide van de N-terminus naar de C-terminus. Een conventionele fase van SPPS bouwt meestal een sequentie in de tegenovergestelde richting.

De uiteindelijke aminozuursequentie kan echter identiek zijn. De manier waarop deze wordt opgebouwd verschilt.

Het is hier belangrijk om te benoemen dat het begrip „conventioneel” geldt, aangezien de chemie van peptiden ook gespecialiseerde strategieën omvat die gebruikmaken van alternatieve verbindingen, fragmenten aanleggen, ligatiereacties en andere niet-standaard oplossingen.

De beschrijving van de richting van C- tot N-punt verwijst dus naar een typisch stapsgewijze SPPS-proces en niet naar alle mogelijke methoden voor de chemie van peptiden die gebruikmaken van de vaste fase.

SPPS is slechts één van de componenten bij de productie van peptiden.

De synthese in de vaste fase is niet de enige manier om peptiden te verkrijgen.

Peptiden kunnen ook worden verkregen door chemische synthese in een oplossing, biologische expressie-systemen, enzymatische conversie, ligatie van fragmenten of combinaties van verschillende methoden.

SPPS is vooral nuttig wanneer gecontroleerde sequentieopbouw en het gebruik van beveiligde, gemodificeerde of op andere manieren speciale aminozuurstructuren nodig zijn.

Zelfs binnen hetzelfde project met betrekking tot een specifieke peptide moet niet altijd dezelfde methode van begin tot eind worden gebruikt.

Afzonderlijke fragmenten van een peptide kunnen bijvoorbeeld worden synthetiseerd op een vezelbasis, apart worden gereinigd en vervolgens met een andere chemische methode worden gecombineerd. Andere moleculen kunnen wel een vormgeving, oxidatie, cyclisatie of aanvullende structurele veranderingen vereisen, al na het verkrijgen van de oorspronkelijke lineaire sequentie.

De keuze van de juiste route hangt dus af van het doelmolecuul, de structurele complexiteit ervan en de analytische en kwalitatieve vereisten van het project.

Het proces is het waard om het als een reeks van achtereenvolgende vragen te beschouwen.

De aanbinding aan het medium bepaalt het beginpunt en heeft invloed op de latere chemische afgifte van het product. Het is echter nog steeds nodig om vast te stellen of de aanbinding correct heeft plaatsgevonden en of de stereochemische integriteit is behouden gebleven.

Het samenstellen van de keten moet ervoor zorgen dat de aminozuren op de geplande volgorde worden aangemaakt. Vervolgens moet echter worden gecontroleerd of alle ketens correct hebben gereageerd en of er geen sequenties zijn ontstaan waarin ontbrekende aminozuren, verkorte of gemodificeerde producten voorkomen.

Het afscheiden en verwijderen van beschermende groepen moet het peptide vrijmaken en bepaalde chemische beschermingslagen verwijderen. Het effectieve afscheiden van het product zelf zegt echter niet wat voor andere stoffen er in het ruwe materiaal zitten.

De reiniging dient om het gewenste materiaal te scheiden van de ongewenste bestanddelen, maar zelfs de gereinigde fractie vereist nog steeds een bevestiging van de identiteit en een kwaliteitsbeoordeling.

De uiteindelijke structurele en analytische karakterisering moet echter beantwoorden aan de vraag of het geïsoleerde materiaal de chemische eigenschappen heeft die voor het beoogde peptide worden verwacht en of de gebruikte analytische methoden geschikt zijn voor de beoogde toepassing.

Dit zijn conceptuele stappen, niet een laboratoriuminstructie. De specifieke reactiemiddelen, apparatuur en omstandigheden zijn afhankelijk van het doelpeptide en vereisen een goed ontwikkeld en gevalideerd onderzoeksmethode.

Verbinding met de hars en het leggen van de ketting

Hars, verbinding en de mate van verhitting vervullen verschillende functies

In discussies over SPPS komen vaak drie termen voor: resin, binder en loading, oftewel de mate van verhitting.

Ze beschrijven verwante, maar verschillende eigenschappen.

Hars is een onoplosbaar materiaal dat als drager fungeert.

De koppeling zorgt voor een chemische verbinding tussen deze drager en het peptide of de eerste aminozuurrest. Zijn chemie kan zowel het manier waarop het peptide wordt verbonden als de daaropvolgende afgifte ervan beïnvloeden.

Loading beschrijft echter het aantal reactieve aansluitpunten in verhouding tot de hoeveelheid drager.

Deze begrippen zijn geen synoniemen.

Twee polymeren kunnen fysiek zeer vergelijkbaar lijken, maar tegelijkertijd verschillende functionele groepen, bindingen of verrijkinggraad hebben. Deze verschillen kunnen invloed hebben op de beschikbaarheid van reactieve plekken bij het vormen van de keten, de verstrengeling van de polymeren en de chemische vorm van het uiteindelijke peptide na het afbreken.

Het volgende belangrijke onderdeel is de geplande groep op C-punt.

Verscheidene oplossingen voor de drager-linkerbinding kunnen bijvoorbeeld worden gekozen zodat een peptide met een carboxylzuur- of amidgroep wordt verkregen.

Dit is een belangrijke chemische verschillen.

Een verandering van de terminalgroep betekent een verandering van de molecuul zelf, en niet alleen van de manier waarop deze wordt verpakt of beschreven.

Verstopping beïnvloedt de toegang tot de aangesloten kettingen

Veel oplosmiddelen die in SPPS worden gebruikt, absorberen het oplosmiddel en buigen ze samen na contact met de juiste vloeibare omgeving.

Dit verandert het polymeermilieu en kan de ruimte vergroten of verminderen waarin de oplosbare reactiemiddelen zich moeten bewegen om de vezelverbindingen in de proteïnedelen te bereiken.

Verkleuring is dus niet alleen een fysieke eigenschap.

Het kan de beschikbaarheid van reactieve groepen tijdens de synthese beïnvloeden.

Een systematisch onderzoek naar polystyreen- en PEG-gebaseerde dragermaterialen toonde aan dat eigenschappen zoals de soort verbinding en de mate van polymerisatie van de hars een significante invloed hadden op de verkleving bij de onderzochte meer ecologische oplosmiddelen. Bovendien werd vastgesteld dat de verkleving kan veranderen bij het verwijderen van beschermende groepen en bij verlenging van de peptilengang. [2]

Dit toont aan dat de eigenschappen van een hars niet altijd als een constante eigenschap ervan kunnen worden beschouwd.

In de praktijk hangt het af van de samenwerking tussen de hars, het oplosmiddel, de verbinding, het aangrenzende peptide en het huidige synthesetraject.

Een goede verpulvering of een gunstige reactie voor één combinatie van hars, oplosmiddel en peptide betekent dus niet dat een andere combinatie hetzelfde gedrag vertoont.

De zelfstandige aansluitfase vereist ook kwaliteitscontrole.

De eerste fase van de aanbinding lijkt misschien eenvoudig, omdat de peptydketen pas aan het ontstaan is.

Een fout die op dit moment is gemaakt, kan echter aanwezig blijven tijdens de volledige latere synthese.

Als de eerste restanten niet correct worden toegevoegd of tijdens dit proces de stereochemische configuratie ervan verandert, hoeft het correcte toevoegen van alle volgende restanten het oorspronkelijke probleem niet te herstellen.

In een onderzoek uit 1992 werd een analytische methode ontwikkeld die speciaal bedoeld is om de racemisatie te meten die plaatsvindt bij de aanbinding van beschermde aminozuren aan vaste dragerstoffen. [3]

De betekenis van dit werk gaat verder dan de gebruikte analytische methode zelf.

Het toont aan dat de stereochemische kwaliteit mogelijk controle vereist voordat de herhalende cycli van de verlenging van de keten beginnen.

Ook de hoeveelheid materiaal dat aanvankelijk aan het medium is gekoppeld, vereist een juiste interpretatie.

De nominale viscositeit van de hars, de lading die experimenteel gemeten is, de hoeveelheid ruw materiaal dat na afscheiding wordt teruggewonnen en de eindproductie van het geïsoleerde en gereinigde peptide zijn verschillende maten.

Ze mogen niet worden beschouwd als alternatieve indicatoren voor het succes van de synthese.

Langere kettingen kunnen moeilijker verkrijgbaar worden

Naarmate de peptidenketen langer wordt, begint het zelfgekoppelde onderdeel invloed te hebben op zijn chemische omgeving.

Negenliggende ketens kunnen met elkaar samenwerken via hydrofobe interacties en andere intermoleculare krachten. Sommige ketens kunnen een bijzonder sterke neiging tot dergelijke interacties vertonen.

Dit kan de toegang tot reactieve groepen beperken.

In een dergelijke situatie kan het moeilijker zijn om een volgende aminozuur toe te voegen, zelfs als er naar het schijnt voldoende hoeveelheid van het koppelingstermijnereermiddel in het systeem is geïnjecteerd.

In een onderzoek naar moeilijke, aggregatiegevoelige sequenties werden verschillende samenvoegmethoden vergeleken en de verkregen ruwe producten werden geanalyseerd. De resultaten ondersteunen het principe dat het proces moet worden aangepast aan de specifieke sequentie, in plaats van te stellen dat er één samenvoegstrategie bestaat die altijd de beste is. [4]

Dit verklaart ook waarom een verhoging van de viscositeit van de hars of de hoeveelheid reactiefmiddel op zichzelf niet automatisch alle problemen oplost.

Als het belangrijkste probleem een beperkte toegang tot reactieve plaatsen is, wordt de vraag naar de hoeveelheid toegevoegd reactief middel belangrijker dan de vraag of het daadwerkelijk is aangekomen bij de juiste plaatsen en of de reactie efficiënt heeft plaatsgevonden zonder dat onaanvaardbare hoeveelheden bijproducten werden gevormd.

Beveiliging, verwijdering van beveiligingsgroepen en koppelen

Beschermingsgroepen controleren de plaats waar de reactie plaatsvindt

Aminozuren bevatten chemische groepen die in verschillende reacties kunnen participeren.

Bij gecontroleerde synthese van een peptide willen chemici meestal dat een bepaalde aminozuurgroep reageert met een specifiek blok met een carboxylegroep, terwijl andere potentieel reactieve plekken tijdelijk niet actief blijven.

Dat is precies waar de beveiligingsgroepen voor dienen.

Ze blokkeren tijdelijk geselecteerde reactiepunten, waardoor een ander punt kan deelnemen aan de geplande reactie.

In de algemeen gebruikte SPPS-strategie, gebaseerd op Fmoc, blijft de uiteindelijke aminogroep van de groeiende keten veilig tussen de volgende stapen van de aanbinding. Wanneer de volgende aminozuur moet worden toegevoegd, wordt de tijdelijke bescherming verwijderd, waardoor de aminozuurgroep zichtbaar wordt.

Reaktive zijketens kunnen afzonderlijke beschermende groepen bevatten, die zodanig zijn ontworpen dat ze tijdens herhalende cycli van het opbouwen van de hoofdketen intact blijven.

Het doel is gecontroleerde selectiviteit.

Een geschikt blok met een carboxylgroep moet zich verbinden met een aangewezen aminogroep, in plaats van tot ongecontroleerde afsplitsing of andere concurrentiekrachtige reacties te leiden.

Ortogonaliteit betekent de mogelijkheid om beveiligingen selectief te verwijderen.

Een orthogonale strategie voor beschermingsgroepen maakt het mogelijk om één beschermingsgroep te verwijderen onder de voorwaarde dat andere noodzakelijke beveiligingen voldoende intact blijven.

Dit geeft de chemiker de mogelijkheid om verschillende reactiepunten te controleren tijdens de verschillende fasen van de synthese.

Fmoc en Boc zijn bekende termen in de chemie van peptiden, maar ze betekenen niet verschillende soorten peptidhoudingen of verschillende uiteindelijke peptstructuren.

Dit zijn beschermende groepen die verband houden met verschillende synthesestrategieën en verschillende methoden voor het verwijderen ervan.

De tijdelijke chemische structuur die tijdens de bouw van een peptide wordt gebruikt, moet dus worden onderscheiden van de uiteindelijke structuur ervan.

De voorzorgsmaatregelen bieden ook geen volledige bescherming tegen alle mogelijke bijwerkingen.

Onderzoek naar de vorming van aspartimid laat bijvoorbeeld zien dat strategieën voor de bescherming, naburige aminozuurresten en de voorwaarden voor het verwijderen van beschermende groepen kunnen invloed hebben op de vorming van verontreinigingen, zelfs bij goed gekende SPPS-methoden [5] [6].

De strategie van beschermende groepen beperkt dus bepaalde ongewenste reacties, maar elimineert niet de noodzaak van procescontrole of de uiteindelijke analytische karakterisering.

De samenstelling vormt een nieuwe amidbinding in het peptide-structuurframe.

De bindreactie leidt tot het vormen van een nieuw amidbinding in het schild van het peptide.

Een aminozuurblok met een carboxylgroep wordt meestal chemisch geactiveerd om effectief te kunnen reageren met de vrijkomende aminogroep van het groeiende eiwit dat aan het eiwitbindmiddel is gekoppeld.

Na het eindigen van de samenstelling kan het oplosbare overschot aan materiaal worden verwijderd door te spoelen.

De nieuw toegevoegde aminozuur wordt dan de laatste rest van de groeiende keten. Vervolgens kan de aminogroep ervan worden onthuld en kan een nieuwe bindingscyclus beginnen.

Theoretisch maakt het herhalen van deze sequentie het mogelijk om de volgorde van de aminozuren te controleren door de volgorde van de invoer van bouwblokken te regelen.

In de praktijk bestaat er echter een zeer belangrijk voorbehoud:

De geplande chemische reactie moet in elk cyclus inderdaad correct verlopen.

Als één koppeling niet volledig is, kan een deel van de kettingen de geplande rest niet ontvangen.

Als ze blijven binden aan de lijm en zich correct gedragen in de volgende cyclus, kunnen er delecine sequenties ontstaan, d.w.z. peptedelen die één of meerdere geplande aminozuren missen.

Andere ketens kunnen worden verkort.

Het wassen elimineert oplosbare reactiemiddelen en bijproducten, maar elimineert niet selectief alle onvolledig gebouwde ketens die nog steeds covalente binding met het drager hebben.

Kleinere verliezen kunnen zich in meerdere cycli cumuleren

Het herhaalde karakter van SPPS leidt tot een belangrijk wiskundig probleem.

Een kleine onvolkomenheid aan een enkel onderdeel van een parcours kan misschien nietig lijken, maar na veel herhalingen kunnen de gevolgen ervan toenemen.

Laten we een eenvoudig wiskundig voorbeeld beschouwen.

Als de synthese van een peptide 50 fasen van binding vereist zou hebben en elk van deze fasen onafhankelijk 99% kans op een succesvolle voltooiing zou hebben, zou het theoretische percentage van de moleculen dat succesvol alle 50 fasen zou hebben doorlopen ongeveer 60,5% zijn.

Dit is slechts een illustratie.

Daarin wordt ervan uitgegaan dat alle fasen identiek en onafhankelijk van elkaar functioneren. Het omvat geen problemen met het verwijderen van beschermende groepen, bijwerkingen, verliezen tijdens het verwijderen en reinigen, aggregatie of veel andere reële factoren.

Het is dus niet te interpreteren als een voorspelling van de werkelijke productiviteit van de productie.

Het voorbeeld laat alleen zien waarom zelfs een zeer hoge efficiëntie van de afzonderlijke stappen niet garandeert dat het eindproduct chemisch gezien eenvoudig is na enkele tientallen herhalingen.

Daarom zijn monitoring van de synthese en controle van de verontreinigingen belangrijk gedurende het gehele proces van het aanmaken van het peptide, en niet pas nadat het laatste aminozuur is toegevoegd.

Automatiseren, verwarmen en andere technologische oplossingen kunnen de synthese versnellen, maar de snelheid van het proces moet altijd worden afgemeten in combinatie met de kwaliteit van het product.

Een onderzoek naar SPPS met behulp van microgolven analyseerde de afhankelijke van het type restracie en de vorming van aspartimid, en toonde aan waarom de reactievoorwaarden nog steeds moeten worden aangepast aan de eigenschappen van de specifieke sequentie. [7]

Het scheiden en herwinnen van het ruwe product

De ontbinding maakt het product los van de drager.

Na het opbouwen van de geplande peptidsynthese moet de peptide meestal chemisch worden afgebroken van het drager.

Deze fase wordt cleavage genoemd, oftewel afscheiding.

De afscheiding onderbreekt de doelgerichte chemische binding tussen het peptide en het drager.

Afhankelijk van de gebruikte strategie kan de afscheiding gelijktijdig plaatsvinden met het verwijderen van delen of alle groepen van de beschermende keten aan de zijkanten. In andere processen kan het peptide of een fragment ervan worden vrijgegeven met behoud van bepaalde beschermingsmechanismen, indien er verderfelijk chemisch verandering wordt beoogd.

De juiste afgiftechemie is afhankelijk van het verbindingsmiddel en de doelmolecule.

Voorwaarden die een enkel peptide effectief vrijmaken, kunnen een chemisch gevoelig groepje in een ander beschadigen.

Daarom beschrijft de afscheiding een chemische doelstelling en niet een universele reeks reactiemiddelen of omstandigheden die geschikt zijn voor alle peptiden.

Net zoals de juiste structuur van het skelet van het peptide niet bewijst dat alle beschermende groepen vervolgens effectief zijn verwijderd.

Het opbouwen van een ketting en het definitieve verwijderen van de beschermingsmiddelen beantwoorden aan verschillende chemische vragen en vereisen een aparte beoordeling.

De afvoersituatie kan invloed hebben op het verontreinigingsprofiel

De ontkapperij hoeft geen chemisch onbelangrijk proces te zijn.

Het verwijderen van beschermende groepen en het losmaken van de peptydbinding met het dragermiddel kan leiden tot de vorming van reactieve chemische stoffen die in staat zijn om het peptyd of andere bestanddelen van de mengeling te modificeren.

Daarom kunnen in de ontwikkelde methoden zogenaamde scavengers worden gebruikt, namelijk verbindingen die bepaalde ongewenste reactieve producten opvangen en de vorming van bijproducten beïnvloeden.

In een onderzoek uit 2019 werden verschillende scavengers geanalyseerd bij het afscheiden van exenatide uit een peptydische vezel en bleek dat hun keuze invloed had op de kwaliteit van het eindproduct en het waargenomen verontreinigingsprofiel. [8]

Er dient op deze basis geen universele receptuur voor ontgifting te worden ontwikkeld.

Het onderzoek toont echter aan dat de omstandigheden van deze fase van invloed kunnen zijn op de kwaliteit van het product en moeten daarom voor elk specifiek peptide en het toepasselijke beschermingssysteem worden beoordeeld.

Het juiste afscheidingsproces heeft dus meerdere dimensies.

Het peptide moet adequaat worden afgebroken, de vereiste beschermende groepen moeten worden verwijderd, het doelmateriaal moet worden teruggevonden en de ongewenste chemische veranderingen moeten worden gecontroleerd.

Het herwinnen van het ruwe product is geen eindige reiniging.

Na het afscheiden vindt een proces plaats waarmee het materiaal dat peptiden bevat, losgekoppeld kan worden van de vaste hars en de resterende componenten van de reactiemengsel.

Hierbij kunnen verschillen in oplosbaarheid, vluchtigheid of andere chemische eigenschappen worden gebruikt.

Het herstellen van zichtbaar afval of een fractie die peptiden bevat, bewijst echter niet dat het materiaal uitsluitend uit het beoogde product bestaat.

Op dit moment wordt meestal gesproken over een harde peptide.

Het kan de doelmolecule bevatten samen met deletische sequenties, verkorte ketens, chemisch gemodificeerde peptiden, onvolledig afgebroken structuren, materialen afkomstig van reactiemiddelen en andere verontreinigingen.

De betekenis van individuele verontreinigingen hangt af van de volgorde, de syntheseomstandigheden en de beoogde toepassing.

In één van de onderzoeken werd een chromatografisch gedeelte gecombineerd met massaspectrometrie om de ruwe producten van SPPS te karakteriseren en de individuele chromatografische punten aan bepaalde peptiden toe te wijzen. [9]

Dit laat zien waarom informatie die wordt verkregen door middel van scheidende en structurele methoden elkaar aanvult.

Chromatografie kan de aanwezigheid van veel bestanddelen aantonen, terwijl massaspectrometrie extra informatie kan verschaffen waarmee kan worden vastgesteld wat sommige van deze bestanddelen kunnen zijn.

Het zuiveren en bevestigen van de identiteit beantwoorden aan verschillende vragen.

De zuivering heeft tot doel om de doelmolecule te verrijken of te isoleren van andere bestanddelen.

Identificatie beantwoordt echter de vraag of het geïsoleerde materiaal daadwerkelijk de verwachte chemische eigenschappen heeft.

Deze vragen overlappen elkaar gedeeltelijk, maar ze zijn niet hetzelfde.

Een goed gedistilleerd chromatografisch pik vormt niet automatisch een volledig bewijs van de structuur van de molecule.

Net zoals het verkrijgen van de verwachte moleculaire massa op zichzelf nog geen volledige beoordeling van de zuiverheid of de structurele correctheid is.

Bijna verwante varianten van de sequentie, stereoisomeren of chemisch gemodificeerde vormen kunnen moeilijk te onderscheiden of te scheiden zijn.

De zuiveringsmethode moet dus worden beoordeeld in relatie tot de werkelijke mengeling die is ontstaan tijdens de betreffende synthese, en moet niet worden beschouwd als voldoende alleen omdat deze bij een andere peptide heeft gewerkt.

Als het eindmolecuul ook een disyrische verbinding, cyclisatie of andere transformatie vereist na het einde van de kettingvorming, rijzen er nieuwe analytische vragen over de correctheid van de bindingen, de structurele homogeniteit en of er inderdaad een gewenste volwassen vorm van het molecuul is verkregen.

Voordelen, beperkingen en bronnen van vervuiling

Waarom is SPPS zo veel gebruikt?

Een van de belangrijkste voordelen van SPPS is de mogelijkheid om het opgerolde peptide tijdens meerdere wisselingen van vloeibare reactiemiddelen op het drager te houden.

Dit vereenvoudigt herhalende chemische processen en maakt automatisering mogelijk.

Chemici kunnen een geplande reeks aminozuurbouwblokken invoeren en, indien de chemie van het proces dit toelaat, ook bepaalde niet-standaard aminozuren en andere modificaties.

Moderne automatische systemen laten zien hoe ver je deze conceptie kunt ontwikkelen.

In een onderzoek over geautomatiseerde flow-synthese uit 2020 werd beschreven hoe eiwitketens met tot wel 164 aminozuurresten kunnen worden verkregen. Na vervolgbehandeling en foldering werden functionele materialen verkregen. [10]

Dit is een indrukwekkend voorbeeld van de mogelijkheden van technologie.

Dat betekent echter niet dat elke sequentie met een lengte van 164 rest-eenheden — of elk lang peptide of eiwit — met dezelfde gemakken kan worden verkregen.

Het betekent ook niet dat reiniging en structurele karakterisering overbodig worden.

Het onderzoek laat eerder zien welke resultaten kunnen worden behaald met een zorgvuldig ontwikkelde methode voor de juiste selectie van de juiste moleculen.

De automatisering controleert de uitvoering van het proces.

Maar het is niet in staat om ongeschikte chemie om te zetten in geschikte chemie.

Daarom moet de prestatie van het apparaat, de sequentie van het peptide en het gedrag van het zelfde molecuul samen worden geanalyseerd.

Hoe ontstaan typische verontreinigingen?

Bij SPPS kunnen verschillende routes aanwezig zijn die leiden tot de vorming van verontreinigingen. Het begrijpen hiervan helpt om te verklaren waarom eindanalytische onderzoeken nog steeds noodzakelijk zijn.

Een delecyne-sequentie of een verkort product kan ontstaan wanneer de geplande aanbinding van een aminozuur niet lukt of wanneer de ketengroei wordt onderbroken. Omdat de onjuiste keten nog steeds aan de vezel kan blijven hechten, hoeft het later door het wassen niet verwijderd te worden.

Epimerisatie betekent een verandering in de stereochemische configuratie van het aangewezen centrum. Dit heeft een bijzonder analytisch belang, omdat een epimer dezelfde nominale moleculaire massa als het eigenlijke peptide kan hebben en tegelijkertijd een verschillend ruimtelijk ontwerp kan vertonen.

Producten die met aspartimid worden geassocieerd kunnen ontstaan door reacties die afhankelijk zijn van de sequentie van de bijproducten en die asparaginzuurresten omvatten. Afhankelijk van de chemische verloop kan er meer dan één type van dit product ontstaan.

Onvolledige verwijdering van beschermende groepen vindt plaats wanneer de groep die verwijderd moet worden nog aan de molecule is gebonden. Een peptide kan dus weliswaar een nominaal verwachte ketenlengte hebben, maar nog steeds een onjuist chemisch structuur hebben.

Modificaties die samenhangen met het afscheiden kunnen optreden tijdens de uiteindelijke afgifte van het peptide of bij het verwijderen van beschermende groepen. Een correcte ketenstructuur garandeert dus niet dat het peptide zonder veranderingen het afscheidingsstadium zal doormaken.

Onvolledige aggregatie-reacties kunnen echter optreden wanneer de opgerolde ketens elkaar beïnvloeden op een manier die de toegang tot reactieve plekken beperkt. Het toevoegen van voldoende reactiefmiddel aan het reactievat garandeert niet dat elk reactief gebied fysiek beschikbaar is en een passende reactie vertoont.

Dit zijn mogelijke routes van de vorming van verontreiniging.

Dit betekent niet dat elk partij dat via SPPS wordt ontvangen alle genoemde soorten onregelmatigheden moet bevatten.

Hun betekenis in een specifieke synthese wordt bepaald op basis van kennis over het proces, analytische onderzoek en geschikte kwaliteitscontrole.

Geïntegreerde natuurlijke peptiden vereisen meer dan het reproduceren van een sequentie.

Sommige peptiden zijn structureel veel complexer dan het resultaat van de lineaire aminozuursequentie zelf zou suggereren.

Een goed voorbeeld hiervan is de epidermis.

De structurele kenmerken van de epidermis toonden aan dat er veel zirkoniumhoudende ringen en ongebruikelijke resten aanwezig waren. [11]

Het alleen reproduceren van de lineaire aminozuursequentie zou dus geen voldoende bewijs zijn dat een authentieke volwassen epidermine is verkregen.

Deze onderscheiding is belangrijk bij de interpretatie van publicaties of zoekopdrachten over de synthese van de epidermis in de vaste fase.

De publicatie kan een lineair precursor, een fragment, een analoge structuur of een andere verwante structuur beschrijven, in plaats van een gevalideerde volledige synthese van een volledig volwassen molecule.

De structurele publicatie die hier als [11] wordt genoemd beschrijft de kenmerken van de epidermis zelf; het is geen rapport over de totale synthese van de epidermis met behulp van de SPPS-methode.

De beweringen over de volledige synthese moeten dus worden beoordeeld in relatie tot de werkelijke doelstructuur van het molecuul, en niet alleen in relatie tot de lineaire aminozuursequentie ervan.

De prestaties, de zuiverheid en de identiteit moeten apart worden gepresenteerd.

De drie begrippen die vaak worden verward in discussies over de synthese van peptiden zijn efficiëntie, zuiverheid en identiteit.

Een grote hoeveelheid gerecupereerd materiaal hoeft niet te betekenen dat het meeste materiaal een doordachte peptide is. Het ruwe materiaal kan aanzienlijke hoeveelheden verontreinigingen bevatten.

Een even hoge chromatografische zuiverheid bevestigt niet automatisch alle aspecten van de structurele identiteit.

Zelfs een peptide waarvan de chemische structuur nauwkeurig is gekarakteriseerd, verkrijgt hierdoor niet automatisch een bevestigd biologisch, therapeutisch of klinisch gebruik.

Dit zijn afzonderlijke kwesties.

Een betrouwbare beschrijving van de synthese zou dus moeten aangeven welke doelmolecule werd gebruikt, op welk stadium de efficiëntie werd gemeten, of het onderzochte materiaal ruw of gezuiverd was en welke analytische gegevens werden gebruikt om de verklaringen over de structuur te bevestigen.

Daardoor kunnen de resultaten van de synthese op een meer betrouwbare manier worden geïnterpreteerd en vergeleken.

Een enkel percentage of massa-waarde mag niet worden verwoord als een algemene constatering dat een peptide „van hoge kwaliteit” is, zonder kennis van wat er daadwerkelijk is gemeten.

Veelgestelde vragen

1. Waarom wordt er bij SPPS gebruikgemaakt van een constante fase?

De vaste fase houdt het opkomende peptide op de drager vast, terwijl oplosbare reactiemiddelen, bijproducten en verontreinigende oplossingen herhaaldelijk kunnen worden toegevoegd en verwijderd. Dit vereenvoudigt aanzienlijk het herhaalbaar aanmaken van de keten en maakt het mogelijk om de synthese van peptiden te automatiseren, zoals blijkt uit de moderne methoden voor geautomatiseerde flow-synthese. [10] De drager garandeert echter niet dat elke reactie perfect verloopt of dat een onvolledig gebouwd peptide dat aan de vezel is gekoppeld, niet onvolledig wordt afgebroken. Zijn belangrijkste voordeel is de verbetering van de procesvoering. De chemische selectiviteit, de volledige reactie, de zuiverheid en de structurele identiteit vereisen nog steeds een aparte beoordeling.

2. Verwerkt de synthese op vaste fase de noodzaak van reiniging?

Nee. Onjuiste peptydketens kunnen tijdens de synthese aan de vezel blijven hechten en vervolgens samen met het beoogde product worden losgelaten. Onderzoek dat ruwe SPPS-producten analyseert met behulp van chromatografie en massaspectrometrie, laat zien dat het wassen tijdens de synthese en de uiteindelijke reiniging verschillende functies vervullen. [9] Het wassen verwijdert vooral de oplosbare componenten die de vezel omringen, terwijl de reiniging na het verwijderen de gewenste peptide en niet-peptide componenten scheidt. SPPS vereenvoudigt indirecte handelingen, maar garandeert geen eindige zuiverheid.

3. Betekent „standaardfase” dat er geen oplosmiddel wordt gebruikt?

Nee. In een conventionele SPPS is een onoplosbaar medium meestal omringd door vloeibare reactiemiddelen en oplosmiddelen. De oplosmiddelen beïnvloeden de fysieke omgeving van de hars, onder andere de mate van verstrengeling en de snelheid waarmee de reactiemiddelen de aan elkaar gekoppelde keten kunnen bereiken. Experimentele studies hebben het verstrengeling van harsen afhankelijk van de oplosmiddel en de chemische samenstelling van het verbindingsmiddel, de verstrengeling en de verlenging van de keten, aangetoond [2]. Hars en oplosmiddel vormen dus samen een reactieomgeving.

4. In welke richting groeit het peptide tijdens SPPS?

De conventionele fase-geleide SPPS bouwt meestal een peptide op van zijn C-terminale rest naar de N-terminus. De eerste aminozuur die de C-terminus van het eindproduct moet vormen, wordt aan het drager gekoppeld, en de volgende rest verlengt de vrijgekomen aminozuurketen aan de uiteinde. De gepubliceerde methoden op basis van Fmoc tonen dit typische patroon aan. [1] Er zijn echter gespecialiseerde strategieën die gebruikmaken van een vaste fase die anders kunnen verlopen.

5. Betekenen hars en verbinding hetzelfde?

Nee. De hars is een onoplosbaar drager, terwijl de verbinding een chemisch verband vormt tussen de drager en het groeiende peptide. De functionaliteit van de verbinding kan, afhankelijk van het polymeer zelf, invloed hebben op de hechting, het behoud van de hars en de latere afgifte van het peptide. Onderzoek naar dragers die worden gebruikt bij de synthese van peptiden laat zien waarom het zelf definiëren van het type hars mogelijk niet voldoende is om de werking van het hele systeem te beschrijven. [2]

6. Verhoogt een hoger percentage vulstof altijd de productie?

Nee. Een hoger loading betekent meer mogelijke verbindingen per hoeveelheid drager, maar dit hoeft niet te leiden tot een grotere hoeveelheid goed opgebouwd en herstelbaar peptide. De bindinggraad kan het lokale moleculaire milieu veranderen en is experimenteel aangetoond als een van de factoren die bijdragen aan de verkleving van de hars. [2] Als de verbonden keten te verzadigd is of sterk met elkaar verbonden, kan de beschikbaarheid van reactieve bindingen slechter zijn. Het loading moet dus samen met de eigenschappen van de hars, de sequentie, de reactieprestaties en de kwaliteit van het eindproduct worden geanalyseerd.

7. Waarom worden aminozuren tijdens het aanmaken van een peptide beschermd?

Beschermgroepen belemmeren tijdelijk de betrokken reactiegroepen bij het uitvoeren van de reacties, terwijl een specifieke binding wordt gevormd. Dit maakt het mogelijk om de keten geleidelijk en gecontroleerd te vormen. Bescherming elimineert echter niet alle bijwerkingen. Onderzoek op modelsystemen toonde bijvoorbeeld aan dat de strategie van beschermende groepen en de omringende sequentie van invloed kunnen zijn op de vorming van aspartimid. [5] Beschermende groepen zorgen dus voor chemische selectiviteit, maar de volledige strategie voor de bescherming en ontmanteling vereist nog steeds een zorgvuldige planning en evaluatie.

8. Wat betekent orthogonale bescherming van functionele groepen?

Ortogonaliteit betekent de mogelijkheid om een beschermende groep te verwijderen onder omstandigheden die andere noodzakelijke beschermingen in voldoende mate intact laten. Dit maakt het mogelijk om specifieke reactiegebieden tijdens de geplande synthesefasen zichtbaar te maken. Verfijnde SPPS-methoden zijn gebaseerd op gecontroleerd beveiligen en ontgrendelen in plaats van het gelijktijdig zichtbaar maken van alle reactieve groepen. [1] De werkelijke overeenstemming tussen de toegepaste beschermingen blijft echter afhankelijk van het doelmolecule en de reactieomstandigheden.

9. Betekenen Fmoc en Boc verschillende soorten peptiden?

Nee. Fmoc en Boc zijn beschermgroepen en de bijbehorende synthetische strategieën, en niet verschillende soorten peptidhars. Verschillen in de chemie van hun verwijdering hebben invloed op de manier waarop de synthese wordt uitgevoerd, maar de tijdelijke beschermende chemie moet niet worden verward met de uiteindelijke structuur van het doelpeptide. De gepubliceerde methoden op basis van Fmoc tonen een van de veelgebruikte varianten van SPPS, maar dit betekent niet dat elk peptide op deze manier moet worden verkregen. [1]

10. Kan de eerste fase van de aansluiting al vervuiling veroorzaken?

Ja. De aanhechtingstap kan een invloed hebben op de stereochemische kwaliteit nog voordat de herhaalde verlenging van de keten wordt gestart. Analysemethoden zijn ontwikkeld die speciaal zijn ontworpen om racemisatie bij de aanhechting van beschermde aminozuren aan verbindingen te meten. [3] Dit betekent niet dat elke aanhechting een significante racemisatie veroorzaakt. Het wijst er echter wel op dat de aanhechting zelf een chemisch belangrijk stadium is waarin meetbare veranderingen kunnen optreden die in de algemene kwaliteitsbeoordeling moeten worden meegenomen.

11. Waarom worden sommige peptidschema's beschreven als moeilijk?

Sommige groeiende peptidenketenwerkingen reageren met elkaar of met naburige ketens op een manier die de toegang tot reactieve plekken beperkt. Waterbindingen, hydrofobe interacties en aggregatie-achtige eigenschappen kunnen het latere samenbrengen bemoeilijken. Onderzoek naar aggregatiegevoelige sequenties toont aan dat een verandering in de manier waarop de keten wordt gesynthetiseerd kan invloed hebben op de samenstelling van het eindproduct. [4] De moeilijkheid van de synthese is dus afhankelijk van de eigenschappen van de molecule en de reactieomstandigheden, en niet alleen van de lengte van het peptide.

12. Betekent een snellere synthese altijd een beter product?

Nee. De snelheid van de synthese en de kwaliteit van het product zijn afzonderlijke parameters. Verwarming, microgolfondersteuning en automatisering kunnen de procesduur verkorten, maar het versnellen van de reacties kan ook de balans tussen gewenste en bijkomende reacties veranderen. Onderzoek naar de synthese met behulp van microgolfondersteuning heeft aangetoond dat de restreactie en de vorming van aspartimid afhankelijk zijn van het type, wat wijst op de noodzaak van adequate controle van de omstandigheden. [7] Een kortere synthesetijd is alleen gunstig wanneer het verkregen materiaal ook voldoet aan de vereiste chemische en analytische criteria.

13. Betekent het afschillen gewoon het verwijderen van de lijmdeeltjes?

Nee. De afscheiding is een chemisch proces dat leidt tot het verbreken van de geplande binding tussen het peptide en het drager. De verwijdering van de lijmdeeltjes door filtratie is echter een fysieke operatie die scheiding impliceert en op zichzelf niet bevestigt dat de chemische afscheiding correct verloopt. De afgifte van het peptide kan plaatsvinden tegelijkertijd met het verwijderen van beschermende groepen en andere reacties. Onderzoek naar scavengers die tijdens de afscheiding worden gebruikt, toont aan dat deze fase kan invloed hebben op het verontreinigingsprofiel. [8]

14. Betekent een hoge productiviteit van het ruwe product een hoge zuiverheid van het peptide?

Nee. De zuiverheid beschrijft de hoeveelheid gerecupereerd materiaal vóór het verwijderen van alle ongewenste bestanddelen. Dit materiaal kan de doelpeptid bevatten samen met deletiesequenties, gemodificeerde structuren, overige beschermende groepen en andere verontreinigingen. Onderzoek naar zuivere SPPS-mengsels met behulp van chromatografie en massaspectrometrie laat zien waarom de gerecupereerde massa, de zuiverheid en de moleculaire identiteit een aparte interpretatie vereisen. [9] Betrouwbare getallen moeten dus aangeven welke fase is gebruikt voor de meting en of het materiaal al is gereinigd.

15. Kan SPPS het ontvangen van lange peptidenketen mogelijk maken?

Ja. Gezamenlijk ontwikkelde SPPS-methoden kunnen het verkrijgen van zeer lange ketenstructuren mogelijk maken. In onderzoek naar geautomatiseerde synthese via stromen werd 164 restanten opgenomen in ketens die vervolgens werden gezuiverd en gefold voordat ze een functionele beoordeling kregen. [10] Dit laat zien welke mogelijkheden moderne peptydensynthese biedt, maar betekent niet dat elke sequentie met een vergelijkbare lengte met dezelfde efficiëntie kan worden verkregen. De lengte is slechts één van de factoren; ook aggregatie afhankelijk van de sequentie, bijproducten, eisen voor het gefolden en de moeilijkheid bij het reinigen spelen een rol.

16. Betekent het bouwen van een epidermische sequentie de volledige synthese ervan?

Nee. Volwassen epidermie bevat ongebruikelijke structurele elementen, waaronder ringen die zink bevatten en die buiten de lineaire aminozuursequentie vallen. Dit is aangetoond in structurele studies. [11] Het verkrijgen van een lineaire sequentie, een precursor of een fragment betekent dus niet automatisch de synthese van een volledige volwassen molecule. De stelling dat volledige synthese plaatsvindt vereist analytische gegevens die bevestigen dat de beoogde bindingen en andere relevante structurele elementen worden gereproduceerd.

17. Ondersteunt de verwachte moleculaire massa de volledige correctheid van de structuur?

Nee. Het verkrijgen van de verwachte moleculaire massa is een waardevolken informatie, maar de massa zelf bevestigt niet alle aspecten van de structuur van het peptide en elimineert niet alle relevante verontreinigingen. Twee moleculen kunnen dezelfde nominale massa hebben, maar tegelijkertijd kunnen ze verschillen in stereochemie of in een bepaald structureel patroon. Onderzoeken waarbij epimere peptiden worden geanalyseerd, tonen aan waarom stereochemische verschillen analytische methoden vereisen die in staat zijn structuren te onderscheiden die niet alleen op basis van de massa kunnen worden gedefinieerd. [12] De uiteindelijke karakterisering moet dus worden gepland met rekening houdend met realistische verontreinigingen en alternatieve structuren die kunnen ontstaan tijdens een specifieke synthese.

Samenvatting

De synthese van peptiden op vaste fase veranderde de chemie van peptiden, waardoor het mogelijk werd om een groeiend molecuulketen op een niet-opgeloste drager te behouden tijdens herhaalde invoer, reacties en verwijdering van oplosbare reactieproducten. Dit maakt het mogelijk om de sequentie in fasen op te bouwen en vormt een praktische basis voor automatische synthese.

De schijnbare eenvoud van deze methode mag echter niet de chemie verhullen die zich in elk stadium voordoet.

Hars, verbinding en de mate van polymerisatie hebben invloed op de essentiële eigenschappen van de syntheseomgeving. De oplosmiddelafhankelijkheid van de verkleuring heeft invloed op de toegang tot de ketenverbindingen die aan het hars zijn gekoppeld. Beschermende groepen bepalen welke functiegroepen kunnen reageren, terwijl de bindreacties het peptide-structuurframe vormen. [1] [2]

Elk van deze fasen heeft ook zijn beperkingen.

Het eerste aanmaken kan invloed hebben op de stereochemische kwaliteit. [3] Moeilijke sequenties kunnen de beschikbaarheid van reactieproducten beperken en aggregeren. [4] De chemie voor de bescherming en verwijdering van beschermende groepen kan bijdragen aan bijproducten zoals aspartimid. [5] [6] Versnelde synthesetoepassingen kunnen het niveau van racemisatie of het verontreinigingsprofiel wijzigen. [7] De afscheidingseigenschappen kunnen bovendien invloed hebben op de samenstelling van het eindproduct. [8]

Daarom is een correcte constructie van de keten niet hetzelfde als het verkrijgen van een zuiver en correct geïdentificeerd peptide.

De terugwinning van het ruwe product, de zuivering en de structurele karakterisering blijven afzonderlijke fasen. Chromatografie kan informatie over de samenstelling van de mengsel en de zuiverheid verschaffen, terwijl massaspectrometrie en andere analytische methoden informatie over de identiteit verschaffen. Geen enkel enkel analytisch resultaat hoeft alle aspecten van de structuur van een peptide te bevestigen. [9] [12]

De moderne geautomatiseerde flow-synthese laat zien dat bij goed ontwikkelde omstandigheden SPPS zelfs tot zeer lange ketens kan worden toegepast. [10] Tegelijkertijd tonen structureel complexe peptiden zoals epidermine aan waarom het zelf herstellen van een lineaire aminozuursequentie wellicht ontoereikend kan zijn als het volwassen molecule extra ringen, atypische restanten of een bepaalde samenstelling van bindingen bevat. [11]

SPPS moet het beste niet als een enkele reactie worden begrepen, maar als een reeks afzonderlijke chemische en analytische stappen.

De verbinding markeert het beginpunt. De herhaalde cycli van bevestigen, ontluchten en verbinden vormen een geplande keten. De ontluchting maakt het product vrij. De reiniging scheidt de doelmolecule van ongewenste bestanddelen. De eindkarakterisatie stelt vervolgens vast of het geïsoleerde materiaal inderdaad de toegewezen structuur en kwaliteit heeft.

Het scheiden van deze fasen maakt het mogelijk om een aantal veel voorkomende misverstanden te vermijden: een succesvolle synthese bevestigt niet automatisch de zuiverheid, een hoge efficiëntie bevestigt niet automatisch de identiteit, en de verwachte moleculaire massa op zichzelf is niet voldoende om volledige structurele correctheid te bewijzen.

Referenties

1. Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Peptidensynthese op vaste fase: Van standaardprocedures tot de synthese van complexe sequenties. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
2. Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K. en Willway, H. (2020). Onderzoek naar parameters die de verhitting van de hars in groene oplosmiddelen beïnvloeden. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
3. Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Gebruik van Marfey’s reagentia om de racemisatie te kwantificeren bij het verankeren van aminozuren op vaste ondersteuningen voor peptide synthese. Analytische Biochemie, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
4. Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluatie van het gecombineerde gebruik van Oxyma en HATU bij het samenstellen van peptideketens. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
5. Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Het aspartimide-probleem bij Fmoc-gebaseerde SPPS. Deel I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
6. Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Het aspartimide-probleem bij Fmoc-gebaseerde SPPS. Deel II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
7. Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Beperking van racemisatie en aspartimidevorming bij microgolfgestuurd Fmoc-solierepolymerisatie van peptiden. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
8. Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzenedimethanethiol (1,4-BDMT) als remmer van de afbraak van groenere peptideharsen. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
9. McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). De karakterisering van ruwe producten uit vaste-fase-peptidensynthese met mu-HPLC/fast atom bombardment mass spectrometry. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed
10. Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E. en Pentelute, B. L. (2020). Synthese van eiwitten door geautomatiseerde stroomchemie. Wetenschap, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
11. Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: Sequencing van een heterodetisch tetracyclisch 21-peptideamideantibioticum. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
12. Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T. en Kuwata, S. (1992). Racemisatieonderzoeken in peptide synthese door het scheiden van beschermde epimerische peptiden met behulp van reverse-phase high performance liquid chromatography. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x