Peptidų sintezė kietojoje fazėje, dažniausiai vadinama santrumpa SPPS (angl. solid-phase peptide synthesis), yra cheminis peptidų kūrimo metodas po vieną aminorūgštį, kol vienas susidarančios grandinės galas lieka chemiškai sujungtas su netirpiu nešikliu.
Vietoj to, kad po kiekvienos reakcijos išskirtų susidedantį peptidą, chemikai palieka jį prijungtu prie kietosios fazės, įpildami ir pašalindami vis kitus skystus reagentus bei plovimo tirpalus. Pasikartojantys ciklai leidžia atidengti reaktyviąją aminogrupę, prijungti kitą aminorūgštį ir pašalinti tirpius komponentus, kurių nebereikia. Sukūrus numatytą aminorūgščių seką, peptidą galima atskirti nuo nešiklio, o vėliau toliau apdoroti ir analizuoti.
Tokio proceso organizacija yra viena pagrindinių priežasčių, dėl kurių SPPS tapo tokiu svarbiu peptidų chemijos metodu. Kietoji fazė supaprastina daugelio pasikartojančių cheminių operacijų atlikimą ir leido automatizuoti sintezę.
Tačiau kietosios fazės sintezės patogumas negarantuoja cheminio tobulumo.
Besiformuojančio peptido prijungimas prie nešiklio negarantuoja, kad kiekviena grandinė gaus visas suplanuotas aminorūgštis. Tai taip pat nereiškia, kad proceso pabaigoje išlaisvinta medžiaga bus chemiškai gryna arba turės taisyklingą struktūrą.
Grandinės sujungimas, produkto atskirimas ir gavimas, gryninimas, tapatybės patvirtinimas ir galutinė struktūrinė charakteristika yra atskiros viso proceso dalys.
Šiuolaikiniai metodologiniai leidiniai rodo tiek SSPS naudingumą, tiek būtinybę modifikuoti standartinius metodus sudėtingų sekojų atveju. Pavyzdžiui, viename iš paskelbtų metodų, kuriuose naudojama Fmoc strategija, aprašoma tiek įprastinė sintezė, tiek modifikuotas požiūris į agregacijai jautrias peptidų sekas. [1]
SPPS supratimas todėl reikalauja kažko daugiau nei tiesioginių cheminių etapų įsiminimo. Taip pat reikia žinoti kiekvieno etapo tikslą, kas jo metu gali pakrypti ne taip ir į kokius analitinius klausimus vis dar reikia atsakyti jam pasibaigus.
Peptidų sintezė ant kietojo nešiklio yra metodas, leidžiantis chemiškai sintetinti peptidus ir baltymus, pridedant aminorūgštis po vieną prie augančios grandinės, kuri yra chemiškai sujungta su netirpiu kietuoju pagrindu (derva).
Besiformuojantis peptidas lieka prijungtas, o tirpalai keičiasi
Įprastinėje SPPS peptide yra chemiškai prijungtas prie nedidelių netirpių dalelių, paprastai vadinamų dervos grūdeliais, naudojant tinkamą cheminį jungiklį.
Grūdai lieka reakcijos sistemoje, o toliau įvedami ir šalinami skysti reagentai bei plovimo tirpalai.
Tai labai supaprastina pakartotinę sintezę.
Klasikinėje pakopinėje sintezėje tirpale augančio peptido izoliavimas ir gryninimas po kiekvieno aminorūgšties prijungimo gali būti varginantis. SPPS metu susidarantis grandinė lieka susijusi su netirpia faze. Dėl to tirpūs reagentų perteklių ir daug šalutinių produktų galima pašalinti praplovimu, kol prie dervos prijungtas peptidas lieka savo vietoje.
Terminas „kietoji fazė” vis dėlto gali sukelti nesusipratimų.
Tai nereiškia, kad peptidinių ryšių susidarymas vyksta be skysčio ar tirpiklio.
Dervą paprastai supa skysta reakcinė terpė, o jos sąveika su tirpikliu gali daryti esminę įtaką sintezės eigai. Reagentai vis tiek turi judėti polimerinėje terpėje arba aplink ją ir pasiekti reaktyviąsias augančio peptido vietas.
Peptido prijungimas laikytojo dažniausiai yra kovalentinio pobūdžio. Tai reiškia, kad susidaranti molekulė yra sujungta su laikikliu per jungtį cheminio ryšio pagalba.
Taigi peptidas nėra tiesiog įkalintas tarp dalelių, sulaikytas filtro ar laisvai nusėdęs ant paviršiaus.
Tokio pobūdinio cheminis junginys yra tikslingai suprojektuotas taip, kad susidaranti grandinė išliktų susieta tolimesnių reakcijų ir plovimo etapų metu, o vėliau galėtų būti atpalaiduota esant tinkamoms sąlygoms.
Tradicinė sintezė vyksta nuo C-galo link N-galo
Klasikinė tiesioginė SPPS strategija paprastai prasideda nuo amino rūgšties, kuri galutiniame peptide sudarys jo C-galą.
Ši dalis prijungiama prie laikiklio.
Atidengus atitinkamą reaktyvią aminogrupę, įvedama kita apsaugota aminorūgštis ir chemiškai prijungiama prie susidarančios grandinės. Šio proceso kartojimas palaipsniui ilgina peptidą N-galo link.
Verta pabrėžti šią kryptį, nes ji skiriasi nuo biologinės baltymų sintezės ribosomose.
Ribosominė sintezė ilgina polipeptidą nuo N-galo iki C-galo. Įprastinė pakopinė SPPS paprastai kuria seką priešinga kryptimi.
Tačiau galutinė aminorūgščių seka gali būti identiškiausia. Skiriasi jos sudarymo būdas.
Čia svarbu paminėti terminą „konwencjonalna”, kadangi peptidų chemija apima ir specializuotas strategijas, kuriose naudojamos alternatyvios prijungimo vietos, fragmentų surinkimas, ligavimo reakcijos bei kiti nestandartiniai sprendimai.
Aprašymas nuo C iki N galo todėl taikomas tipiniam pakopiniam SPPS procesui, o ne visiems galimiems kietosios fazės peptidų chemijos metodams.
SPPS yra tik vienas iš peptidų gamybos elementų
Kietosios fazos sintezė nėra vienintelis peptidų gavimo būdas.
Peptidai taip pat gali būti gaunami cheminės sintezės būdu tirpale, biologinėse ekspresijos sistemose, vykdant ensimines transformacijas, fragmentų ligatūrą arba naudojant įvairių metodų derinius.
SPPS yra ypač naudinga, kai reikia kontroliuojamo sekučių sudarymo ir apsaugotų, modifikuotų ar kitaip specializuotų aminorūgščių statybinių blokų naudojimo.
Net ir vykdant vieną projektą, susijusį su konkrečiu peptidu, nebūtina visuomet taikyti to paties metodo nuo pradžios iki galo.
Atskiros peptido fragmentos gali būti, pavyzdžiui, susintetintos ant dervos, atskirai išvalytos, o po to sujungtos kitu cheminiu metodu. Kitoms molekulėms gali prireikti sulankstymo, oksidacijos, ciklizacijos ar papildomų struktūrinių pokyčių jau po pradinės linijinės sekos gavimo.
Tinkamo kelio pasirinkimas priklauso nuo tikslinės molekulės, jos struktūrinio sudėtingumo bei projekto analitinių ir kokybinių reikalavimų.
Procesą vertėtų nagrinėti kaip nuoseklių klausimų seriją.
Prijungimas prie nešiklio žymi pradinį tašką ir turi įtakos vėlesnei produkto išsiskyrimo chemijai. Tačiau vis dar reikia nustatyti, ar prijungimas įvyko teisingai ir ar buvo išlaikytas stereocheminis integralumas.
Grandinės sintezė turi užtikrinti aminorūgščių prijungimą reikalaujama tvarka. Tačiau vėliau būtina patikrinti, ar visos grandinės sureagavo tinkamai ir ar neatsirado sekų su trūkstamomis aminorūgštimis, sutrumpintų ar modifikuotų produktų.
Nuskaldymas ir apsauginių grupių pašalinimas turi atlaisvinti peptidą ir pašalinti tam tikras chemines apsaugas. Tačiau vien sėkmingas produkto atlaisvinimas neparodo, kokių kitų medžiagų yra neapdorotoje medžiagoje.
Valymas skirtas norimai medžiagai atskirti nuo nepageidaujamų komponentų, tačiau net ir išvalytai frakcijai vis tiek reikia patvirtinti tapatybę ir įvertinti kokybę.
Galinė struktūrinė ir analitinė charakteristika savo ruožtu turi atsakyti į klausimą, ar išskirta medžiaga pasižymi tiksliniam peptidui būtinomis cheminėmis savybėmis ir ar taikyti analitiniai metodai yra tinkami numatytam naudojimui.
Tai yra koncepciniai etapai, o ne laboratorinė instrukcija. Konkretūs reagentai, aparatūra ir reakcijos sąlygos priklauso nuo tikslinio peptido ir reikalauja tinkamai sukurto bei patvirtinto metodo.
Prijungimas prie dervos ir grandinės surinkimas
Derva, jungtis ir pakeitimo laipsnis atlieka skirtingas funkcijas
Diskusijose apie SPPS dažnai minima sąvoka iš trijų terminų: derva, jungtis ir pakaitos laipsnis, t. y. „loading“.
Jos apibūdina susijusias, bet skirtingas savybes.
Derva yra netirpi medžiaga, sudaranti nešiklį.
Jungtė užtikrina cheminį ryšį tarp šio nešiklio ir peptido ar pirmosios aminorūgšties liekanos. Jos chemija gali turėti įtakos tiek peptido prijungimo būdui, tiek vėlesniam jo atsipalaidavimui.
Apkrova apibūdina reaktyvių prijungimo vietų skaičių nešiklio kiekio atžvilgiu.
Šios sąvokos nėra sinonimai.
Dvi dervos gali fiziškai atrodyti labai panašiai, tačiau turėti skirtingas funkcines grupes, jungtis ar pakeitimo laipsnį. Šie skirtumai gali turėti įtakos reaktyvių vietų prieinamumui grandinės surinkimo metu, dervos brinkimui ir galutinio peptido cheminei formai po atskėlimo.
Kitas svarbus elementas yra planuojama grupė C gale.
Įvairios nešiklio ir jungties sistemos gali būti parinktos, pavyzdžiui, taip, kad būtų gautas peptidas, kurio galinė grupė yra karboksigrupė arba amidinė grupė.
Tai yra esminis cheminis skirtumas.
Terminalinės grupės pakeitimas reiškia paties molekulės pokytį, o ne tik jos supakavimo ar aprašymo būdą.
Brinkimas turi įtakos prijungtų grandinių prieinamumui
Daugelis SPPS naudojamų dervų sugeria tirpikį ir išbrinksta susilietusios su atitinkama skysta terpe.
Tai keičia polimerinę aplinką ir gali padidinti arba sumažinti erdvę, per kurią ištirpę reagentai turi judėti, kad pasiektų prie dervos prijungtas peptidų grandines.
Todėl brinkimas nėra tik įdomus fizinis reiškinys.
Gali turėti įtakos reaktyvių grupių prieinamumui sintezės metu.
Sistematinis polistirolo ir PEG pagrindu sukurtų nešiklių tyrimas parodė, kad tokios savybės kaip jungties tipas ir dervos pakaitų laipsnis reikšmingai paveikė brinkimą tiriamuose ekologiškesniuose tirpikluose. Taip pat nustatyta, kad brinkimas gali kisti šalinant apsaugines grupes bei ilgėjant peptidų grandinei. [2]
Tai rodo, kad dervos elgsenos negalima visuomet traktuoti kaip jos pastovios savybės.
Praktikoje tai priklauso nuo dervos, tirpiklio, jungties, prijungto peptido ir esamo sintezės etapo sąveikos.
Geras brinkimas arba palanki reakcijos eiga vienai dervos, tirpiklio ir peptido kombinacijai dar nereiškia, kad kita kombinacija elgsis identiškai.
Pats prijungimo etapas taip pat reikalauja kokybės kontrolės
Pirmasis prijungimo etapas gali atrodyti paprastas, nes peptidinė grandinė tik pradeda formuotis.
Tačiau šiame etape padaryta klaida gali išlikti visos vėlesnės sintezės metu.
Jeigu pirmoji liekana bus prijungta neteisingai arba šio proceso metu pasikeis jos stereocheminė konfigūracija, teisingas visų tolimesnių liekanų prijungimas nebūtinai ištaisys pradinę problemą.
1992 m. tyrime buvo sukurta analitinis metodas, skirtas specialiai matuoti racemizaciją, vykstančią prijungiant apsaugotas aminorūgštis prie kietųjų nešiklių. [3]
Šio darbo reikšmė peržengia pačio taikyto analitinio metodo ribas.
Ji rodo, kad stereocheminė kokybė gali reikalauti kontrolės dar prieš prasidedant pasikartojantiems grandinės ilginimo ciklams.
Taip pat medžiagos, iš pradžių pritvirtintos prie nešiklio, kiekis reikalauja tinkamo interpretavimo.
Nominalus dervos pakaitos laipsnis, eksperimentiškai išmatuotas apkrovos kiekis, po atskėlimo atgautos žaliavos kiekis ir galutinis išskirto bei išvalyto peptido išeigas yra skirtingi dydžiai.
Jų negalima laikyti pakaitiniais sintezės sėkmės rodikliais.
Ilgesnės grandinės gali tapti sunkiau pasiekiamos
Ilvėjant peptidinei grandinei, pati prijungta molekulė pradeda veikia savo cheminę aplinką.
Kaimyninės grandinės gali sąveikauti tarpusavyje vandeniliniais ryšiais, hidrofobinėmis sąveikomis ir kitomis tarpmolekulinėmis jėgomis. Kai kurios sekos gali rodyti ypatingai stiprią polinkį tokioms sąveikoms.
Tai gali apriboti prieigą prie reaktyvių grupių.
Tokioje situacijoje kito aminorūgšties prijungimas gali tapti sunkesnis, net jei į sistemą buvo įvestas iš pažiūros pakankamas jungiamojo reagento kiekis.
Tyrime, kuriame buvo nagrinėjamos sunkiai sujungiamos, polinkį į agregaciją turinčios sekos, buvo palyginti įvairūs sujungimo metodai ir išanalizuoti gauti neapdoroti produktai. Rezultatai patvirtina nuostatą, kad procesas turėtų būti pritaikytas konkrečiai sekai, o ne remtis prielaida, jog egzistuoja viena visiems atvejams tinksčiausia sujungimo strategija. [4]
Tai taip pat paaiškina, kodėl vien tik dervos pakaitumo laipsnio ar reagento kiekio padidinimas automatiškai neišsprendžia visų problemų.
Jei pagrindinė problema yra ribota prieiga prie reaktyviųjų vietų, už klausimą apie pridėto reagentų kiekio svarbesnis tampa klausimas, ar jis iš tikrųjų pasiekė atitinkamas vietas ir ar reakcija vyko veiksmingai, nesusidarant nepriimtinam šalutinių produktų kiekiui.
Apsauga, apsauginių grupių šalinimas ir jungimas
Apsauginės grupės kontroliuoja reakcijos vietą
Aminorūgštys turi cheminių grupių, galinčių dalyvauti įvairiose reakcijose.
Atliekant kontroliuojamą peptidų sintezę, chemikai paprastai siekia, kad tam tikra aminogrupė reaguotų su konkrečiu bloku, turinčiu karboksigrupę, o kitos, potencialiai reaktyvios vietos, laikinai išliktų neaktyvios.
Tam būtent ir skirtos apsauginės grupės.
Jie laikinai blokuoja tamtąsias reakcijas sukeliančias vietas, leisdami kitai vietai dalyvauti suplanuotoje reakcijoje.
Plačiai taikomoje Fmoc pagrįstoje SPPS strategijoje augančios grandinės galinė aminogrupė tarp pakopinių prijungimo etapų lieka apsaugota. Kai reikia prijungti kitą aminorūgštį, laikinoji apsauga pašalinama, atidengiant aminogrupę.
Reaktyvios šoninės grandinės gali turėti atskiras apsaugines grupes, sukurtas taip, kad jos išliktų nepažeistos pasikartojančių pagrindinės grandinės statymo ciklų metu.
Tikslas – kontroliuojamas selektyvumas.
Tinkamas blokas su karboksigrupe turėtų jungtis su atitinkama aminogrupe, o ne lemti nekontroliuojamą šakojimąsi ar kitas konkurencines reakcijas.
Ortogonalność oznacza możliwość selektywnego usuwania zabezpieczeń
Ortogonali apsauginių grupių strategija leidžia pašalinti vieną apsauginę grupę tokiomis sąlygomis, kai kitos reikiamos apsaugos priemonės lieka pakankamai nepažeistos.
Tai suteikia chemikui galimybę kontroliuojamai atidengti įvairias reaktyvias vietas skirtinguose sintezės etapuose.
Fmoc ir Boc yra gerai žinomi terminai peptidų chemijoje, tačiau jie nereiškia skirtingų peptidinių ryšių tipų ar skirtingų galinių peptido struktūrų.
Tai apsauginės grupės, susijusios su įvairiomis sintezės strategijomis ir skirtingais jų pašalinimo metodais.
Todėl laikinas cheminis kelias, naudojamas peptido sintezės metu, turi būti skiriamas nuo galutinės jo struktūros.
Apsaugos priemonės taip pat neužtikrina visapusiškos apsaugos nuo visų galimų šalutinių reakcijų.
Aspartimido susidarymo tyrimai pavyzdžiui rodo, kad apsauginė strategija, gretimos aminorūgščių liekanos ir apsauginių grupių šalinimo sąlygos gali turėti įtakos priemaišų susidarymui net ir gerai žinomuose SPPS metoduose. [5] [6]
Apsauginių grupių strategija taigi riboja tam tikras nepageidaujamas reakcijas, tačiau nepanaikina proceso kontrolės ar galutinės analitinės charakteristikos poreikio.
Sujungimas sukuria kitą peptidinio karkaso amidinį ryšį
Porankio reakcija lemia kito amidinio ryšio susidarymą peptide.
Amino rūgščių blokas, turintis karboksi grupę, paprastai chemiškai aktyvuojamas, kad galėtų veiksmingai reaguoti su derva susieto augančio peptido atvira amino grupe.
Po sujungimo pabaigoje tirpi medžiagos perteklius gali būti pašalintas plovimu.
Naujai prijungtas aminorūgštis tampa augančios grandinės galine liekana. Tada jos aminogrupę galima atidengti ir pradėti kitąjungimo ciklą.
Teoriškai šios sekos kartojimas leidžia kontroliuoti aminorūgščių seka, kontroliuojant statybinių blokų įvedimo seka.
Praktikoje vis dėlto yra labai svarbi išimtis:
suplanuota cheminė reakcija iš tikrųjų turi vykti teisingai kiekviename cikle.
Jei vienas sujungimas yra nevisiškas, dalis grandinių gali negauti suplanuotos liekanos.
Jei jos liks prijungtos prie dervos ir tinkamai suveiks kitame cikle, gali susidaryti delecinės sekvencijos, t. y. peptido molekulės, neturinčios vieno ar kelių suplanuotų aminorūgščių.
Kiti grandinės gali likti sutrumpinti.
Skalbimas pašalina tirpius reagentus ir šalutinius produktus, tačiau selektyviai nepašalina visų neteisingai sukonstruotų grandinių, kurios vis dar yra kovalentiškai susijusios su nešikliu.
Mažni nuostoliai gali kauptis per daugelį ciklų
Pasikartojantis SPPS pobūdis sukelia svarbią matematinę problemą.
Nedidelis vieno etapo netobulas gali atrodyti nesvarus, tačiau po daugelio pakartojimų jo padariniai gali kumuliuotis.
Apsvarstykime paprastą matematinį pavyzdį.
Jei peptido sintezei reikėtų 50 sujungimo etapų ir kiekvienas iš jų nepriklausomai turėtų 99% tikimybę sėkmingai pasibaigti, teorinė molekulių, sėkmingai perėjusių visus 50 etapų, dalis būtų apie 60,5%.
Tai yra tik iliustracija.
Ji daro prielaidą, kad visi etapai elgiasi identiškai ir nepriklausomai. Joje neatsižvelgiama į apsauginių grupių pašalinimo problemas, šalutines reakcijas, nuostolius atskeliant ir valant, agregaciją bei daugelį kitų realių veiksnių.
Todėl šio rezultato nereikėtų suprasti kaip realaus gamybos našumo prognozės.
Pavyzdys tik parodo, kodėl net ir labai didelis atskirų etapų našumas negarantuoja chemiškai paprasto neapdoroto produkto po kelių dešimčių pakartojimų.
Todėl sintezės stebėsena ir taršos kontrolė yra svarbios viso peptidų surinkimo proceso metu, o ne tik pridėjus paskutinę aminorūgštį.
Automatizacija, šildymas ir kiti technologiniai sprendimai gali paspartinti sintezę, tačiau proceso greitis visada turi būti vertinamas kartu su produkto kokybe.
Mikrobangomis palaikomo SPPS tyrimas parodė nuo liekanos tipo priklausančią racemizaciją ir aspartimido susidarymą, išryškindamas, kodėl reakcijos sąlygas vis dar reikia pritaikyti prie konkrečios sekvencijos savybių. [7]
Neapdoroto produkto atskyrimas ir regeneravimas
Atskyrimas išlaisvina produktą iš nešiklio
Po sukonstruojant suplanuotą sekvenciją, peptidą paprastai reikia chemiškai atskirti nuo nešiklio.
Šis etapas vadinamas cleavage, t. y. atskėrimu.
Skilimas nutraukia tikslingai suprojektuotą cheminį ryšį tarp peptido ir nešiklio.
Priklausomai nuo taikomos strategijos, atskėlimas gali vykti vienu metu pašalinant dalį arba visas šoninių grandinių apsaugines grupes. Kituose procesuose peptidas arba jo fragmentas gali būti atskirtas išlaikant kai kurias apsaugas, jei planuojamies tolesni cheminiai virsmai.
Tinkama išsiskyrimo chemija priklauso nuo jungties ir tikslinės molekulės.
Sąlygos, kurios veiksmingai atpalaiduoja vieną peptidą, gali chemiškai pažeisti jautrią grupę kitame.
Todėl nuskaldymas apibūdinamas kaip cheminis tikslas, o ne kaip vienas universalus reagentų ar sąlygų rinkinys, tinkantis visiems peptidams.
Panašiai, tinkamas peptido karkaso sustatymas neįrodo, kad visos apsauginės grupės vėliau buvo sėkmingai pašalintos.
Grandinės surinkimas ir galutinis apsauginių grupių pašalinimas atsako į skirtingus cheminius klausimus ir reikalauja atskiro įvertinimo.
Atskyrimo sąlygos gali turėti įtakos priemaišų profiliui
Atskyrimas nebūtinai turi būti chemiškai neutralus etapas.
Apsauginių grupių pašalinimas ir peptido ryšio su nešikliu nutraukimas galilemti reaktyvių cheminių formų, galinčių modifikuoti peptidą ar kitus mišinio komponentus, susidarymą.
Todėl sukurtuose metoduose gali būti naudojami vadinamieji „scavengerių“ junginiai (gaudyklės), t. y. medžiagos, kurios sugauna tam tikrus nepageidaujamus reaktyvius produktus ir daro įtaką šalutinių produktų susidarymui.
2019 m. tyrime buvo išanalizuoti įvairūs „scavengeriai“ (sugėrikliai) atskeliant exenatidą nuo peptidinės dervos ir nustatyta, kad jų pasirinkimas turėjo įtakos neapdoroto produkto kokybei ir stebėtam priemaišų profiliui. [8]
Remiantis tuo, nereikėtų kurti universalaus atsiskyrimo recepto.
Tyrimas rodo, kad šio etapo sąlygos gali turėti įtakos produkto kokybei, todėl jos turėtų būti įvertintos konkrečiam peptidui ir naudojamai apsauginių grupių sistemai.
Tinkamas atsiskyrimo procesas turi kelis matmenis.
Peptidas turi būti tinkamai atskirtas, reikiamos apsauginės grupės pašalintos, tikslinė medžiaga atgauta, o nepageidaujami cheminiai virsmai suvaldyti.
Neapdoroto produkto atgavimas nėra galutinis gryninimas
Po atskyrimo atliekamas procesas, leidžiantis atskirti peptido turinčią medžiagą nuo kietos dervos ir reakcijos mišinio likusių komponentų dalių.
Tam galima pasinaudoti tirpumo, takumo ar kitų cheminių savybių skirtumais.
Matomo, pastebimo nuosėdų ar peptidų turinčios frakcijos atgavimas neįrodo, kad medžiagą sudaro vien tik numatytas produktas.
Šiame etape paprastai kalbama apie neapdorotą peptidą.
Jis gali turėti tikslinę molekulę kartu su delecinėmis sekvencijomis, sutrumpintomis grandinėmis, chemiškai modifikuotais peptidais, nepilnai deblokuotomis struktūromis, iš reagentų kilusiomis medžiagomis ir kitais priemaišomis.
Atskirų priemaišų reikšmė priklauso nuo sekos, sintezės sąlygų ir numatomo paskirties būdo.
Viename tyrime chromatografinis skirstymas buvo sujungtas su mases spektrometrija, siekiant charakterizuoti neapdorotus SPPS produktus ir priskirti atskirus chromatografinius pikus konkretis peptidams. [9]
Tai rodo, kodėl separaciniais ir struktūriniais metodais gauta informacija viena kitą papildo.
Chromatografija gali parodyti daugelio komponentų buvimą, tuo tarpu masių spektrometrija gali pateikti papildomos informacijos, padedančios nustatyti, kas kai kurie iš jų galėtų būti.
Tapatybės valymas ir tapatybės patvirtinimas atsako į skirtingus klausimus
Valymo tikslas – praturtinti arba išskirti tikslinę molekulę iš kitų komponentų.
Savo ruožtu identifikacija atsako į klausimą, ar išskirta medžiaga tikrai turi pageidaujamas chemines savybes.
Šie klausimai iš dalies sutampa, bet nėra tapatūs.
Gerai atskirtas chromatografinis pikas automatiškai nesudaro visapusiško molekulės struktūros įrodymo.
Panašiai, tikėtinos molekulinės masės gavimas savaime nėra pilnas grynumo ar struktūrinio teisingumo įvertinimas.
Glaudžiai susijusius sekvenavimo variantus, stereoisomerus arba chemiškai modifikuotas formas gali būti sunku atskirti arba atskirti.
Todėl valymo metodas turėtų būti vertinamas atsižvelgiant į faktinį mišinį, susidariusį konkrečios sintezės metu, o ne laikomas pakankamu vien dėl to, kad pasiteisino kito peptido atveju.
Jei galutinei molekulei taip pat reikia sudaryti disulfidinius tiltelius, ciklizuoti ar atlikti kitą transformaciją baigus grandinės surinkimą, iškyla papildomų analitinių klausimų dėl jungčių taisyklingumo, struktūrinio vienalytiškumo ir to, ar tikrai buvo gauta numatyta subrendusi molekulės forma.
Privalumai, apribojimai ir taršos šaltiniai
Kodėl SPPS yra taip plačiai naudojama?
Vienas svarbiausių SPPS privalumų yra galimybė išlaikyti susidarantį peptidą ant nešiklio pakartotinai keičiant skystus reagentus.
Tai supaprastina pasikartojančias chemines operacijas ir leidžia jas automatizuoti.
Chemikai gali įterpti suplanuotą aminorūgščių statybinių blokų seką, o jei tai leidžia proceso chemija, taip pat kai kurias nestandartines aminorūgštis bei kitus pakeitimus.
Šiuolaikinės automatinės sistemos rodo, kaip tolygiai galima išplėtoti šią koncepciją.
2020 m. tyrime, susijusiame su automatizuota srautine sinteze, aprašytas baltymų grandinių, turinčių iki 164 amino rūgščių liekanų, gavimas. Po vėlesnio gryninimo ir lankstymo buvo gautos funkcinės medžiagos. [10]
Tai įspūdus techninių galimybių pavyzdys.
Tačiau tai nereiškia, kad kiekvieną 164 liekanų ilgio seką – ar bet kurį ilgesnį peptidą ar baltymą – galima gauti vienodai lengvai.
Tai taip pat nereiškia, kad gryninimas ir struktūrinis charakterizavimas tampa nereikalingi.
Tyrimas greičiau parodo, kokių rezultatų galima pasiekti naudojant kruopščiai sukurtą sistemą tinkamai parinktoms molekulėms.
Automatizacija kontroluoja proceso vykdymą.
Tačiau ji nepajėgi netinkamos chemijos paversti tinkama.
Todėl įrangos našumą, peptido seką ir pačios molekulės elgseną reikia analizuoti bendrai.
Kaip atsiranda tipinė tarša?
Vykdant SPPS gali atsirasti kelis skirtingi taršos atsiradimo keliai. Jų supratimas padeda paaiškinti, kodėl galutiniai analitiniai tyrimai vis dar yra būtini.
Deleciosekvencija arba sutrumpintas produktas gali susidaryti, kai nepavyksta numatytas aminorūgšties prijungimas arba kai grandinės augimas nutraukiamas. Kadangi ydinga grandinė gali likti prijungta prie dervos, vėlesnis plovimas jos nebūtinai pašalina.
Epimerizacija reiškia atitinkamo centro stereocheminės konfigūracijos pasikeitimą. Tai turi ypač svarbią analitinę reikšmę, nes epimeras gali turėti tokią pačią nominalią molekulinę masę kaip ir tikrasis peptidas, o kartu skirtis erdvine konfigūracija.
Su aspartimidu susiję produktai gali susidaryti dėl sekvencijai priklausomų šalutinių reakcijų, apimančių asparagino rūgšties liekanas. Priklausomai od cheminės eigos, gali susidaryti daugiau nei viena tokio produkto rūšis.
Nepilnas apsauginių grupių pašalinimas pasireiškia tada, kai grupė, kuri turėjo būti pašalinta, lieka sujungta su molekule. Vadinasi, peptidas gali būti nominaliai tikėtams grandinės ilgio, tačiau vis tiek turėti neteisingą cheminę struktūrą.
Modifikacijos, susijusios su nukirpimu, gali atsirasti galutinio peptido išskyrimo arba apsauginių grupių pašalinimo metu. Todėl teisingas grandinės surinkimas negarantuoja, kad peptidas praeis nukirpimo etapą nepakitęs.
Nepilnos su agregacija susijusios reakcijos tuo tarpu gali pasireikšti tada, kai susidarantys grandinės sąveikauja tarpusavyje taip, kad apriboja priėjimą laisvoms (reaktyviosioms) vietoms. Pakankamo kiekio reagentų įvedimas į reakcijos indą negarantuoja, kad kiekviena reaktyvioji vieta yra fiziškai prieinama ir atitinkamai reaguoja.
Tai galimi taršos atsiradimo keliai.
Tai nereiškia, kad kiekviena SPPS metodu gaunama partija turi turėti visus išvardytus nešvarumų tipus.
Jų reikšmė konkrečioje sintezėje nustatoma remiantis žiniomis apie procesą, analitiniais tyrimais ir atitinkama kokybės kontrole.
Sudėtingi natūralūs peptidai reikalauja daugiau nei vien sekos atkartojimo
Kai kurie peptidai yra struktūriškai kur kas sudėtingesni, nei galima spėti iš pačios linijinės aminorūgščių sekos.
Geras pavyzdys yra epiderminas.
Epidermino struktūrinė charakteristika parodė daugybę sieros turinčių žiedų ir neįprastų liekanų buvimą. [11]
Vien tik linijinės aminorūgščių sekos atkūrimas todėl nebūtų pakankamas įrodymas, kad buvo gauta autentiška brandi epiderminas.
Šis skirtumas yra svarbus interpretuojant leidinius ar paieškas, susijusias su epidermino sinteze kietojoje fazėje.
Leidinys gali aprašyti linijinį pirmtaką, fragmentą, analogą ar kitą susijusią struktūrą, o ne patvirtintą pilną brandžios molekulės sintezę.
Čia [11] nurodyta struktūrinė publikacija aprašo paties epidermino charakteristiką; tai nėra ataskaita apie jo visišką sintezę SPPS metodu.
Teiginius apie visišką sintezę todėl reikėtų vertinti atsižvelgiant į tikrąją tikslinės molekulės struktūrą, o ne vien į jos linijinę aminorūgščių seką.
Naudingumą, švarą ir tapatybę reikėtų pateikti atskirai
Trys sąvokos, kurios dažnai painiojamos diskusijose apie peptidų sintezę, yra išeiga, grynumas ir tapatybė.
Didelė gauto produkto masė nebūtinai reiškia, kad didžiąją šios medžiagos dalį sudaro numatytas peptidas. Neapdorotoje medžiagoje gali būti didelis kiekis priemaišų.
Panašiai didelis chromatografinis grynumas automatiškai nepatvirtina visų struktūrinio tapatumo aspektų.
Net peptidas, kurio cheminė struktūra yra tiksliai apibūdinta, tuo pačiu automatiškai neįgyja patvirtinto biologinio, terapinio ar klinikinio taikymo.
Tai yra atskiri klausimai.
Patikimas sintezės aprašymas turėtų nurodyti, kokia buvo tikslinė molekulė, kuriame etape buvo išmatuotas išeigos dydis, ar analizuojama medžiaga buvo neapdorota, ar išvalyta, ir kokie analitiniai duomenys buvo panaudoti struktūros teiginiams patvirtinti.
Dėl to sintezės rezultatus galima interpretuoti ir palyginti patikimesniu būdu.
Vienos procentinės vertės arba masės vertės negalima paversti bendru teigimu, kad peptidas yra „aukštos kokybės”, nežinant, kas iš tikrųjų buvo išmatuota.
Dažniausiai užduodami klausimai
1. Kodėl SPPS naudojama kieta fazė?
Kietoji fazė išlaiko susidarantį peptidą ant nešiklio, tuo tarpu tirpūs reagentai, reakcijos šalutiniai produktai ir plovimo tirpalai gali būti pakartotinai įvedami ir šalinami. Tai gerokai supaprastina pasikartojantį grandinės surinkimą ir įgalina peptidų sintezės automatizavimą, ko pavyzdys yra šiuolaikiniai automatizuotos srautinės sintezės metodai. [10] Tačiau nešiklis negarantuoja, kad kiekviena reakcija vyks idealiai, taip pat neatskiria neteisingai sukonstruotos su derva susijusios grandinės nuo teisingos. Pagrindinis jo privalumas yra proceso eigos supaprastinimas. Cheminis selektyvumas, reakcijos išsamumas, grynumas ir struktūrinė tapatybė vis tiek reikalauja atskiro įvertinimo.
2. Ar kietosios fazės sintezė pašalina gryninimo poreikį?
Ne. Neteisingos peptidų grandinės sintezės metu gali likti prisijungusios prie dervos ir vėliau atsiskirti kartu su norimu produktu. Tyrimai, analizuojantys neapdorotus SPPS produktus chromatografijos ir masės spektrometrijos pagalba, rodo, kad plovimas sintezės metu ir galutinis gryninimas atlieka skirtingas funkcijas. [9] Plovimas pirmiausia pašalina tirpius komponentus, supančius dervą, o gryninimas po atskyrimo turi atskirti pageidaujamą peptidą nuo nepageidaujamų peptidinių ir nepeptidinių komponentų. SPPS supaprastina tarpines operacijas, tačiau negarantuoja galutinio grynumo.
3. Ar „kietoji fazė” reiškia, kad tirpiklis nenaudojamas?
Ne. Įprastame kietosios fazės peptidų sintezėje (SPPS) netirpus nešėjas paprastai yra apsuptas skystų reagentų ir tirpiklių. Tirpikliai veikia fizinę dervos aplinką, tarp jų ir jos brinkimo laipsnį bei lengvumą, su kuriuo reagentai gali pasiekti prijungtas grandines. Eksperimentiniai tyrimai parodė nuo tirpiklio priklausantį dervų brinkimą ir pokyčius, susijusius su jungiklio chemija, pakaitos laipsniu ir grandinės ilginimu. [2] Taigi derva ir tirpiklis kartu sudaro reakcijos aplinką.
4. Į kurią pusę auga peptidas SPPS metu?
Įprastinė pakopinė SPPS paprastai sintetina peptidą nuo jo C-galo liekanos N-galo link. Pirmoji aminorūgštis, kuri turi sudaryti gatavos molekulės C-galą, yra prijungiama prie nešiklio, o vėlesnės liekanos ilgina atiduktą grandinės aminogalą. Paskelbti metodu, pagrįsti Fmoc, rodo šį tipinį scheminį modelį. [1] Tačiau egzistuoja specializuotos kietfazio strategijos, kurios gali vykti kitaip.
5. Ar derva ir jungtis reiškia tą patį?
Ne. Derva yra netirpus nešiklis, o tarpininkas (jungtis) sudaro cheminį ryšį tarp nešiklio ir augančio peptido. Tarpininko funkcinės savybės gali nepriklausomai nuo paties polimero paveikti prijungimą, dervos elgseną ir vėlesnį peptido išskyrimą. Peptidų sintezėje naudojamų nešiklių tyrimai rodo, kodėl vien tik dervos tipo nurodymas gali būti nepakankamas visos sistemos elgsenai apibūdinti. [2]
6. Ar didesnis dervos pakaitumo laipsnis visada padidina gamybą?
Ne. Didesnė apkrova reiškia didesnį potencialių prijungimo vietų skaičių tam tikram nešiklio kiekiui, tačiau nebūtinai lemia didesnį teisingai sukonstruoto ir atgaunamo peptido kiekis. Pakeitimo laipsnis gali pakeisti vietinę molekulinę aplinką ir eksperimentiškai buvo nustatytas kaip vienas veiksnių, turinčių įtakos dervos brinkimui. [2] Jei prijungtos grandinės yra per daug sužemintos arba stipriai tarpusavyje sąveikauja, reaktyviųjų vietų prieinamumas gali pablogėti. Todėl apkrovą reikėtų analizuoti kartu su dervos savybėmis, sekos elgsena, reakcijos išeiga ir galutinio produkto kokybe.
7. Kodėl amino rūgštys yra apsaugomos peptidų sintezės metu?
Apsauginės grupės laikinai neleidžia tam tikroms reaktyvioms grupėms dalyvauti reakcijose, kol susidaro konkreti jungtis. Tai leidžia atlikti apgalvotą, pakopinį grandinės surinkimą. Tačiau apsauga nepašalina visų šalutinių reakcijų. Tyrimai su modelinėmis sistemomis parodė, pavyzdžiui, kad apsauginių grupių strategija ir supančioji seka gali turėti įtakos aspartimido susidarymui. [5] Taigi apsauginės grupės užtikrina cheminį selektyvumą, tačiau visa apsaugos ir deapsaugos strategija vis tiek reikalauja kruopštaus planavimo ir įvertinimo.
8. Ką reiškia ortogonalinė funkcinių grupių apsauga?
Ortogonalumas reiškia galimybę pašalinti vieną apsauginę grupą tokiomis sąlygomis, kurios kitas reikalingas apsaugas palieka pakankamai nepažeistas. Tai leidžia atidengti tam tikras reaktyvias vietas suplanuotais sintezės etapais. Nusistovėję SPPS metodai remiasi kontroliuojamu apsaugojimu ir apsaugos panaikinimu, o ne vienu metu atliekamu visų reaktyvių grupių atidengimu. [1] Tačiau faktinis naudojamų apsaugų suderinamumas vis tiek priklauso nuo tikslinės molekulės ir reakcijos sąlygų.
9. Ar Fmoc ir Boc reiškia skirtingų rūšių peptidus?
Ne. Fmoc ir Boc yra apsauginės grupės bei su jomis susijusios sintetinės strategijos, o ne skirtingi peptidinio karkaso tipai. Jų pašalinimo chemijos skirtumai įtakojantys sintezės eigą, tačiau laikinosios apsauginės chemijos nereikėtų painioti su galutine tikslinio peptido struktūra. Publikuoti metodai, pagrįsti Fmoc, rodo vieną iš plačiai taikomų SPPS variantų, tačiau tai nereiškia, kad kiekvienas peptidas turi būti gaunamas šiuo metodu. [1]
10. Ar jau pirmasis prijungimo etapas gali sukelti taršą?
Taip. Prijungimo etapas gali turėti įtakos stereocheminei kokybei dar prieš pradedant daugiakryptį grandinės ilginimą. Sukurti analitiniai metodai, skirti specialiai racemizacijai nustatyti prijungiant apsaugotas aminorūgštis prie dervų. [3] Tai nereiškia, kad kiekvienas prijungimas sukelia reikšmingą racemizaciją. Tai rodo, kad pats prijungimas yra chemiškai svarbus etapas, kurio metu gali atsirasti išmatuojamų pokyčių, kuriuos reikia įvertinti bendroje kokybės vertinimo apžvalgoje.
11. Kodėl kai kurios peptidų sekos yra vadinamomis sunkiomis?
Kai kurios augančios peptidų grandinės sąveikauja tarpusavyje arba su gretimomis grandinėmis taip, kad apriboja priėjimą laisvoms reaktyviosioms vietoms. Vandeniliniai ryšiai, hidrofobinė sąveika ir į agregaciją panašus elgesys gali apsunkinti vėlesnį sujungimą. Agregacijai jautrių sekvencijų tyrimai rodo, kad jungimo būdo pakeitimas gali turėti įtakos neapdoroto produkto sudėčiai. [4] Todėl sintezės sudėtingumas priklauso nuo molekulės savybių ir reakcijos sąlygų, o ne vien nuo peptido ilgio.
12. Ar greitesnė sintezė visada reiškia geresnį produktą?
Ne. Sintezės greitis ir produkto kokybė yra atskiri parametrai. Kaitinimas, mikrobangų palaikymas ir automatizavimas gali sutrumpinti proceso laiką, tačiau reakcijos pagreitinimas taip pat gali pakeisti pusiausvyrą tarp pageidaujamų ir šalutinių reakcijų. Mikrobangų pagalba vykdomos sintezės tyrimai parodė nuo liekanos tipo priklausančią racemizaciją ir aspartimido susidarymą, o tai rodo būtinumą tinkamai kontroliuoti sąlygas. [7] Trumpesnis sintezės laikas yra naudingas tik tada, gdy gauta medžiaga taip pat atitinka reikalaujamus cheminius ir analitinius kriterijus.
13. Ar defosforizavimas reiškia tiesiog dervos granulių pašalinimą?
Ne. Atskyrimas yra cheminis procesas, kuris sukelia suprojektuoto ryšio tarp peptido ir nešiklio nutrūkimą. Tuo tarpu dervos dalelių pašalinimas filtracijos būdu yra fizinio atskyrimo operacija ir pats savaime nepatvirtina teisingos atskyrimo chemijos eigos. Peptido išlaisvinimas gali vykti vienu metu su apsauginių grupių pašalinimu ir kitomis reakcijomis. Tyrimai, susiję su atskyrimo metu naudojamais „scavenger“ (surišikliais), rodo, kad šis etapas gali paveikti priemaišų profilį. [8]
14. Ar didelis neapdoroto produkto našumas reiškia didelį peptido grynumą?
Ne. Neapdorotas išeiga apibūdo atgautos medžiagos kiekį prieš pašalinant visus nepageidaujamus komponentus. Šioje medžiagoje gali būti tikslinis peptidas kartu su delecijos sekomis, modifikuotomis struktūromis, likusiomis apsauginėmis grupėmis ir kitais teršalais. SPPS neapdorotų mišinių tyrimai naudojant chromatografiją ir masės spektrometriją parodo, kodėl atgauta masė, grynumas ir molekulinė tapatybė reikalauja atskiro interpretavimo. [9] Todėl patikimai pateikta išeiga turėtų nurodyti etapą, kuriame ji buvo išmatuota, ir tai, ar medžiaga jau buvo išvalyta.
15. Ar SPPS leidžia gauti ilgas peptidų grandines?
Taip. Kruopščiai parengti SPPS metodai gali leisti gauti labai ilgas grandines. Tyrimuose, susijusiuose su automatizuota srautine sinteze, buvo gaunamos grandinės, turinčios net 164 liekanas, kurios vėliau buvo valomos ir lankstomos prieš atliekant funkcinį vertinimą. [10] Tai rodo šiuolaikinės peptidų sintezės galimybes, tačiau nereiškia, kad bet kokią panašaus ilgio seką galima gauti vienodu našumu. Ilgis yra tik vienas iš veiksnių; taip pat svarbu nuo sekos priklausanti agregacija, šalutinės reakcijos, lankstymo reikalavimai ir valymo sudėtingumas.
16. Ar epiderminos sekvenavimas reiškia jos visišką sintezę?
Ne. Brandžioje epiderminoje yra netipiškų struktūrinių elementų, įskaitant sieros turinčius žiedus, kurie viršija paprastą tiesinę aminorūgščių seka. Tai buvo įrodyta struktūriniais tyrimais. [11] Todėl tiesinės sekos, pirmtako ar fragmento gavimas automatiškai nereiškia visiškai brandžios molekulės sintezės. Teiginiui apie pilnutinę sintezę reikalingi analitiniai duomenys, patvirtinantys numatytų jungčių ir kitų svarbių struktūrinių elementų atkūrimą.
17. Ar numatoma molekulinė masė patvirtina visišką struktūros teisingumą?
Ne. Tikėtinos molekulinės masės gavimas yra vertinga informacija, tačiau pati masė nepatvirtina visiškų peptido struktūros aspektų ir nepašalina visų svarbių priemaišų. Dvi molekulės gali turėti tą pačią nominalią masę ir tuo pačiu skirtis stereochemija arba konkrečia struktūrine sąranga. Tyrimai, apimantys epimerinių peptidų atskyrimą, parodo, kodėl stereocheminiams skirtumams gali prireikti analitinių metodų, gebančių atskirti struktūras, kurių neįmanoma atskirti vien remiantis masės matavimu. [12] Todėl galutinę charakteristiką reikėtų suprojektuoti atsižvelgiant į realistiškas priemaišas ir alternatyvias struktūras, kurios gali susidaryti konkrečios sintezės metu.
Santrauka
Peptidų sintezė ant kietos fazės iš esmės pakeitė peptidų chemiją, leisdama išlaikyti augančią grandinę ant netirpausnešiklio pakartotinai įvedant, atliekant reakcijas ir šalinant tirpius reagentus. Tai palengvina laipsnišką sekos kūrimą ir yra praktinis automatinės sintezės pagrindas.
Akivaizdus šio metodo paprastumas neturėtų užgožti kiekviename etape vykstančios chemijos.
Dervos, jungtis ir pakaitų laipsnis turi įtakos svarbioms sintezės terpės savybėms. Nuo tirpiklio priklausomas brinkimas turi įtakos prie dervos prijungtų grandinių prieinamumui. Apsauginės grupės kontroliuoja, kurios funkcinės grupės gali reaguoti, o sujungimo reakcijos kuria peptidų kraną lieka po liekanos. [1] [2]
Kiekvienas iš šių etapų taip pat turi savo apribojimų.
Pradminis prijungimas gali paveikti stereocheminę kokybę. [3] Sudėtingos sekos gali agreguoti ir apriboti reagentų prieinamumą. [4] Apsauginių grupių prijungimo ir pašalinimo chemija gali paskatinti šalutines reakcijas, tokias kaip aspartimido susidarymas. [5] [6] Pagreitintos sintezės sąlygos gali pakeisti racemizacijos laipsnį arba priemaišų profilį. [7] Atskyrimo sąlygos gali papildomai paveikti neapdoroto produkto sudėtį. [8]
Todėl tinkamas grandinės sukonstravimas nėra tapatus gryno ir teisingai identifikuoto peptido gavimui.
Neapdoroto produkto gavimas, gryninimas ir struktūrinis charakterizavimas išlieka atskirais etapais. Chromatografija gali pateikti informaciją apie mišinio sudėtį ir grynumą, tuo tarpu masės spektrometrija ir kiti analitiniai metodu patvirtina tapatybę. Nė vienas pavienis analitinis rezultatas neprivalo patvirtinti visų peptido struktūros aspektų. [9] [12]
Šiuolaikinė automatizuota srautinė sintezė rodo, kad, esant tinkamai paruoštoms sąlygoms, SPPS galima taikyti net labai ilgoms grandinėms. [10] Kartu struktūriškai sudėtingi peptidai, tokie kaip epiderminas, rodo, kodėl vien tik linijinės aminorūgščių sekos atkūrimas gali būti nepakankamas, jei brandžioje molekulėje yra papildomų žiedų, neįprastų liekanų ar specifinė jungčių sistema. [11]
SPPS geriau suprasti ne kaip pavienę reakciją, o kaip atskirų cheminių ir analitinių etapų seką.
Prijungimas žymi pradinį tašką. Besikartojantys apsaugimo, nuslopinimo ir susiejimo ciklai sukuria suplanuotą grandinę. Atskyrimas atlaisvina produktą. Gryninimas atskiria tikslinę molekulę nuo nepageidaujamų komponentų. Galutinė charakteristika leidžia nustatyti, ar išskirta medžiaga iš tikrųjų turi jai priskiriamą struktūrą ir kokybę.
Šių etapų atskyrimas padeda išvengti kelių dažnų nesusipratimų: sėkminga sintezė automatiškai nepatvirtina grynumo, didelė išeiga automatiškai nepatvirtina tapatybės, o numatoma molekulinė masė pati po savęs neįrodo visiško struktūrinio teisingumo.
Nuorodos
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Kietafazė peptidų sintezė: nuo standartinių procedūrų iki sudėtingų sekų sintezės. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K., & Willway, H. (2020). Dervų brinkimui žaliuose tirpikliuose įtakos turinčių parametrų tyrimas. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Marfey reagento naudojimas racemizacijai kiekybiškai įvertinti pritvirtinant aminorūgštis prie kietųjų nešiklių peptidų sintezei. Analytical Biochemistry, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A. ir Ruvo, M. (2017). Kombinuoto „Oxyma“ ir „HATU“ naudojimo agreguojančiose peptidinėse sekomis įvertinimas. Peptidų mokslo žurnalas, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P. ir Vorherr, T. (2003). Aspartimido problema Fmoc pagrindu vykdomoje SPPS. I dalis. Peptidų mokslo žurnalas, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Aspartimido problema Fmoc pagrindu vykdomoje SPPS. II dalis. Peptidų mokslo žurnalas, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J. ir Collins, J. M. (2007). Racemizacijos ir aspartimido susidarymo ribojimas mikrobangų pagreitintoje Fmoc kietosios fazės peptidų sintezėje. „Journal of Peptide Science“, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzendimetantiolis (1,4-BDMT) kaip šalintuvas žalesniam peptidų dervos skilimui. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., ir Pallai, P. (1991). „mu-HPLC / fast atom bombardment mass spectrometry“ metodiką taikant kietfazių peptidų sintezės metu gautų neapdorotų produktų charakterizavimas. Peptidų tyrimai, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E., & Pentelute, B. L. (2020). Baltymų sintezė naudojant automatizuotą srauto chemiją. Mokslas, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U. ir Zähner, H. (1986). Epidermin: heterodetinio tetraciklinio 21 peptido amido antibiotiko sekvenavimas. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T. ir Kuwata, S. (1992). Racemizacijos tyrimai peptide sintezėje atskiriant apsaugotus epimerinius peptidus naudojant atvirkštų fazių didelio efektyvumo skysčių chromatografiją. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x