Sinteza peptidelor în fază solidă, cunoscută cel mai adesea sub numele de SPPS (solid-phase peptide synthesis), este o metodă chimică de construcție a peptidelor din aminoacizi în aminoacid, în timp ce un capăt al lanțului format rămâne chimic legat de un suport insolubil.
În loc să izoleze peptida format după fiecare reacție, chimistii îl lasă legat de faza stătătoare, introducând și eliminând substanțe lichide și soluții de spălare ulterioare. Ciclul repetat permite descoperirea grupului aminoactiv, adăugarea unui alt aminoacid și eliminarea componentelor solubile care nu mai sunt necesare. După formarea secvenței aminoacide planificate, peptida poate fi desprins de suport și apoi supus unei alte procesări și analiză.
O astfel de organizare a procesului este unul dintre principalele motive pentru care SPPS a devenit o metodă atât de importantă în chimia peptidelor. Faza stațornică a simplificat efectuarea multor operațiuni chimice repetitive și a permis automatizarea sintezei.
Conformitatea sintezei la stadiul constant nu înseamnă însă o garanție chimică a perfecțiunii.
Adăugarea peptiduului în curs de formare la suportul său nu garantează că fiecare lanț va primi toate aminoacizii planificați. Nu înseamnă, de asemenea, că materialul eliberat la sfârșitul procesului va fi chimic pur sau va avea o structură corectă.
Afișarea lanțului, separarea și reciclația produsului, curățarea, confirmarea identității și caracterizarea structurală finală sunt părți separate ale întregului proces.
Publicațiile metodologice contemporane prezintă atât utilitatea SPPS, cât și necesitatea de a modifica metodele standard în cazul secvențelor dificile. Într-o metodă publicată care utilizează strategia Fmoc, de exemplu, este descrisă o sinteză rutină, dar și o abordare modificată pentru secvențele peptide susceptibile la agregare. [1]
Înțelegerea SPPS necesită, prin urmare, mai mult decât a-și aminti pașii chimici următori. Trebuie, de asemenea, să știm care este scopul fiecărui pas, ce poate merge greșit în timpul acestuia și ce întrebări analitice trebuie încă să fie răspunsuri după finalizarea lui.
Ce este sinteza peptidelor în fază solidă?
Peptida care se formează rămâne legată, iar soluțiile se schimbă
În SPPS convențional, peptida este legată chimic la mici particule insolubile, numite de obicei granule de rășină, folosind un legant chimic adecvat.
Grâușele rămân în sistemul reacțional, în timp ce următorii reactivi lichizi și soluțiile care circulă sunt introduși și eliminați.
Aceasta simplifică semnificativ sinteza repetitivă.
În sinteza clasică etapică, izolarea și purificarea peptidu-lui în curs de creștere după fiecare aducere a unui aminoacid poate fi dificilă. În SPPS, lanțul format rămâne legat de faza insolubilă. Astfel, excesele de reactivi solubili și multe dintre produsele secundare pot fi eliminate prin spălare, în timp ce peptida legată de polimerul de protecție rămâne în loc.
Determinarea termenului „faza constantă” poate, însă, să ducă la neînțelegeri.
Acest lucru nu înseamnă că formarea legăturilor peptidice are loc fără participarea apei sau a solventului.
Ceara este de obicei înconjurată de un mediu reacțional lichid și interacțiunea sa cu solventul poate influența semnificativ evoluția sintezei. Reacționii trebuie să continue să circule în mediul polimeric sau în jurul acestuia și să ajungă la locurile reactive ale peptidei în creștere.
Adăugarea peptidu la suportul său are, de obicei, un caracter covalent. Aceasta înseamnă că moleculele formate sunt unite la suport printr-un legament chimic.
Peptida nu este, prin urmare, pur și simplu închisă între particule, capturată de un filtru sau lipită vag pe suprafață.
O astfel de combinație chimică este proiectată în mod intenționat astfel încât lanțul format să rămână legat în timpul următoarelor reacții și etape de spălare, iar mai apoi să poată fi eliberat în condițiile adecvate.
Sinteza convențională are loc de la capătul C spre capătul N
Strategia liniară clasică a SPPS începe de obicei cu un aminoacid care va constitui capătul C al peptiduului finit.
Restul acestuia este atașat la suport.
După desprinderea grupului amino reactiv corespunzător, se introduce următorul aminoacid proteic protejat și acesta este covalent atașat chimic la lanțul format. Repetarea acestui proces prelungește progresiv peptida spre capătul N.
Este de remarcat această direcție, deoarece aceasta difera de sinteza biologică a proteinelor prin ribozomi.
Sinteza ribozomală prelungește polipeptida de la capătul N spre capătul C. Etapa SPPS convențională construiește de obicei secvența în sens opus.
Secvența finală de aminoacizi poate fi însă identică. Modul în care aceasta este construită diferă.
Este important să menționăm termenul „conventional”, deoarece chimia peptidelor include și strategii specializate care utilizează locuri de legare alternative, sinteza fragmentelor, reacții de ligare și alte soluții neconvenționale.
Descrierea direcției de la C la sfârșitul N se referă astfel la procesul tipic de etapă al SPPS, și nu la toate metodele posibile de chimie peptidică care utilizează faza stocatică.
SPPS este doar unul dintre elementele de producție a peptidelor
Sinteza la fază constantă nu este singura modalitate de a obține peptide.
Peptidy pot fi, de asemenea, obținute prin sinteză chimică într-un mediu de reacție, prin sisteme de expresie biologice, prin transformări enzimatice, prin ligarea fragmentelor sau prin combinarea diferitelor metode.
SPPS este deosebit de utilă atunci când este necesară o sinteză controlată a secvențelor și utilizarea de blocuri de aminoacizi specializate, securizate, modificate sau altfel.
Chiar și în cadrul unui singur proiect privind un anumit peptid, nu este întotdeauna necesar să se utilizeze aceeași metodă de la început până la sfârșit.
Fragmentele individuale ale unui peptid pot, de exemplu, fi sintetizate pe un polimer, curățate separat și apoi unite printr-o altă metodă chimică. Altele pot necesita folding, oxidare, ciclizare sau schimbări structurale suplimentare după obținerea secvenței inițiale liniară.
Decizia privind alegerea căii optime depinde astfel de componenta finală a moleculei, de complexitatea sa structurală și de cerințele analitice și calitative ale proiectului.
Procesul merită să fie privit ca o serie de întrebări consecutive.
Adăugarea la suport stabilește punctul de pornire și influențează ulterior chimia de eliberare a produsului. Totuși, trebuie încă stabilit dacă adăugarea a avut loc corect și dacă integritatea stereochemică a fost menținută.
Alegerea lanțului trebuie să ducă la legarea aminoacizilor în ordinea planificată. Apoi trebuie verificat dacă toate lanțurile au reacționat corect și dacă nu au apărut secvențe cu aminoacizi lipsă, produse scurtate sau modificate.
Ștergerea și eliminarea grupărilor protectoare au scopul de a elibera peptida și de a elimina anumite protecții chimice. Însă, pur și simplu eliminarea eficientă a produsului nu indică care sunt alte substanțe prezente în materialul brut.
Purificarea servește la separarea materialului dorit de ingredientele nedorite, dar chiar și fracția purificată necesită confirmarea identității și evaluarea calității.
Caracteristica structurală și analitică finală are rolul de a răspunde la întrebarea dacă materialul izolat are proprietățile chimice așteptate pentru peptidul țintă și dacă metodele analitice utilizate sunt adecvate pentru utilizarea preconizată.
Acestea sunt etape conceptuale, nu instrucțiuni de laborator. Reacțiile specifice cu substanțele chimice și dispozitivele necesare depind de peptidul dorit și necesită o metodă elaborată și validată corespunzător.
Adăugarea la rășină și legarea lanțului
Ceara, lipici și gradul de impregnare au funcții diferite
În discuțiile privind SPPS apar adesea trei termeni: ceara, ligant și gradul de încărcare, adică loading.
Acestea descriu proprietăți asociate, dar diferite.
Ceara este un material insolubil care constituie suportul.
Ligandul asigură o legătură chimică între acest transportor și peptida sau prima restă a aminoacizilor. Chimia sa poate influența atât modul în care se leagă peptida, cât și modul în care acesta se eliberează ulterior.
Loading descrie, pe de altă parte, numărul de locuri de conectare reactive în raport cu cantitatea de suport.
Aceste concepte nu sunt sinonime.
Două polimeri pot părea fizic foarte asemănători, dar în același timp pot avea grupuri funcționale diferite, liganți sau grade de polimerizare diferite. Aceste diferențe pot afecta disponibilitatea locurilor reactive în timpul lanțului de polimerizare, compacitatea polimerului și forma chimică finală a peptidei după separare.
Un alt element important este grupul planificat la C-final.
Diverse scheme de transport-ligare pot fi selectate, de exemplu, astfel încât să se obțină un peptid încheiat cu o grupă carboxilică sau amidică.
Aceasta este o diferență chimică semnificativă.
O schimbare a grupului terminal înseamnă o schimbare a moleculei însăși, nu doar a modului în care aceasta este ambalată sau descrisă.
Împănarea afectează accesul la lanțurile conectate
Majoritatea substanțelor utilizate în SPPS absorb solventul și se umflă la contactul cu mediul lichid adecvat.
Acest lucru modifică mediul polimeric și poate mări sau reduce spațiul prin care trebuie să se deplaseze reactanții dizolvați pentru a ajunge la lanțurile peptide legate de polimer.
Îngălbenirea nu este deci doar o curiositate fizică.
Poate influența disponibilitatea grupurilor reactive în timpul sintezei.
Olimpiada sistematică a suporturilor pe bază de polistiren și PEG a demonstrat că astfel de caracteristici precum tipul de legare și gradul de adăugare a rășinii au influențat semnificativ puncția în soluțiile mai ecologice studiate. De asemenea, s-a constatat că puncția poate varia în timpul eliminării grupurilor de protecție și pe măsură ce lanțul peptidic se prelungește. [2]
Acest lucru arată că comportamentul cearei nu poate fi întotdeauna considerat o proprietate constantă a acesteia.
În practică, acesta depinde de interacțiunea dintre rășină, solventul, liganul, peptidul adăugat și etapa actuală de sinteză.
Opracirea adecvată a compoziției sau evoluția favorabilă a reacției pentru o anumită combinație de rășină, solvent și peptid nu înseamnă că o altă combinație va acționa în același mod.
Și etapa de conectare în sine necesită controlul calității
Primul etap al integrarei poate părea simplu, deoarece lanțul peptidic abia începe să se formeze.
O eroare introdusă în această etapă poate, însă, să rămână prezentă pe parcursul întregii sinteze ulterioare.
Dacă prima restă este conectată incorect sau în timpul acestui proces se modifică configurația stereochemică a acesteia, adăugarea corectă a tuturor restelor următoare nu trebuie să remedieze problema inițială.
În studiul din 1992 a fost elaborată o metodă analitică destinată în mod special măsurării racemizării care are loc în timpul legării aminoacizilor proteici cu suporturile fixe. [3]
Importanța acestei lucrări depășește însă însăși metoda analitică utilizată.
Aceasta arată că calitatea stereochemică poate necesita control înainte de începerea ciclurilor repetate de prelungire a lanțului.
De asemenea, cantitatea de material adăugat inițial la suport necesită o interpretare adecvată.
Valoarea nominală a gradului de polimerizare al polimerului, încărcarea măsurată experimental, cantitatea de material brut reciclat după separarea polimerului și productivitatea finală a peptidei izolate și purificate sunt mărimi diferite.
Nu trebuie să le considerăm ca indicatori alternativi ai succesului sintezei.
Lanțurile mai lungi pot deveni mai greu accesibile
Pe măsură ce lanțul peptidic se prelungește, fiecare moleculă individuală începe să influențeze mediul său chimic.
Lanțurile adiacente pot interacționa între ele prin legături hidrofobe, interacțiuni hidrofobe și alte forțe intermoleculare. Unele secvențe pot prezenta o tendință deosebit de puternică de astfel de interacțiuni.
Acest lucru poate limita accesul la grupurile reactive.
În astfel de situații, integrarea unui alt aminoacid poate deveni mai dificilă, chiar dacă în sistem a fost introdusă, aparent, o cantitate suficientă de agent de ligare.
În studiul privind secvențele dificile și susceptibile de agregare, diferite metode de asocierare au fost comparate și produsele brute obținute au fost analizate. Rezultatele susțin principiul conform căruia procesul ar trebui să fie adaptat la secvența specifică, în loc să se presupună existența unei strategii unice de asocierare, care este întotdeauna cea mai bună. [4]
Acest lucru explică și de ce simpla creștere a gradului de acoperire al rășinii sau a cantității de agent de reacție nu rezolvă automat toate problemele.
Dacă problema principală este accesul limitat la locurile reactive, întrebarea despre cantitatea de agent adăugat devine mai importantă decât dacă acesta a ajuns efectiv la destinații adecvate și dacă reacția a avut loc eficient, fără apariția unei cantități nedorite de produse secundare.
Securizarea, eliminarea grupurilor de protecție și asamblarea
Echipa de protecție controlează locul unde a avut loc reacția
Aminoacizii conțin grupuri chimice capabile să participe la diverse reacții.
În timpul sintezei controlate a unui peptid, chimistii doresc, de obicei, ca o anumită grupă aminoasă să reacționeze cu un bloc specific care conține o grupă carboxilică, în timp ce alte locuri potențial reactive rămân temporar inactive.
Tocmai acest lucru sunt capabile să facă grupurile de protecție.
Acestea blochează temporar locurile de reacție aleasă, permițând unui alt loc să participe la reacția planificată.
În strategia SPPS utilizată în mod obișnuit, bazată pe Fmoc, grupul amino final al lanțului crescând rămâne protejat între etapele următoare de legare. Când urmează să fie adăugat următorul aminoacid, protecția temporară este eliminată, dezvăluind astfel grupul amino.
Lanțurile laterale reactive pot avea grupuri de protecție separate, proiectate astfel încât să rămână intacte în timpul ciclurilor repetate de construcție a lanțului principal.
Scopul este selectivitatea controlată.
Un bloc adecvat care conține o grupă carboxilică ar trebui să se lege de o grupă amino relevantă, în loc să ducă la o desprindere necontrolată sau la alte reacții competitive.
Ortogonalitatea înseamnă posibilitatea de a elimina în mod selectiv dispozitivele de protecție
Strategia ortogonală a grupărilor de protecție permite eliminarea unei singure grupări de protecție în condițiile în care celelalte măsuri de securitate necesare rămân suficient de intacte.
Acest lucru oferă unui chimist posibilitatea de a descoperi în mod controlat diferite locuri reactive în diferite etape ale sintezei.
FMOC și Boc sunt definiții bine cunoscute în chimia peptidelor, dar nu desemnează diferite tipuri de legături peptidice sau diferite structuri finale ale peptidelor.
Acestea sunt grupuri de protecție asociate cu diferite strategii de sinteză și cu diferite metode de eliminare a acestora.
Prin urmare, calea chimică temporară utilizată în timpul construcției peptiduului trebuie diferențiată de structura sa finală.
Siguranțele nu oferă, de asemenea, protecție completă împotriva tuturor reacțiilor adverse posibile.
Investigațiile privind formarea aspartimidului arată, de exemplu, că strategia de protecție, resturile aminoacide adiacente și condițiile de eliminare a grupărilor de protecție pot influența formarea contaminanților chiar și în metodele SPPS bine cunoscute [5] [6].
Strategia grupurilor de protecție, prin urmare, limitează anumite reacții nedorite, dar nu elimină necesitatea controlului procesului sau a caracteristicilor analitice finale.
Asocierarea formează o nouă legătură amidică a structurii peptidei
Reacția de ligare conduce la formarea a încă un legament amidic în structura peptidică.
Blocul de aminoacizi care conține o grupă carboxilică este de obicei activat chimic pentru a putea reacționa eficient cu grupul amino desprins al peptidei în creștere asociat cu substratul.
După finalizarea aglomerării, surplusul de material solubil poate fi eliminat prin spălare.
Aminoacidul nou adăugat devine atunci restul final al lanțului crescând. Apoi, se poate descifra grupul său aminoacidic și poate începe următorul ciclu de legare.
Teoretic, repetarea acestei secvențe permite controlul ordinii aminoacizilor prin controlul ordinii de introducere a blocurilor de construcție.
În practică există însă o precizare foarte importantă:
Reacția chimică planificată trebuie să se desfășoare corect în fiecare ciclu.
Dacă un singur legament este incomplet, o parte din lanțuri poate să nu primească restul planificat.
Dacă acestea rămân legate de amidon și reacționează corect în următorul ciclu, pot apărea secvențe deleciene, adică molecule de peptidă lipsite de unul sau mai multe aminoacizi planificați.
Alte lanțuri pot rămâne scurte.
Spălarea elimină substanțele solubile și produsele secundare, dar nu elimină selectiv toate lanțurile defectuoase, care continuă să fie legate covalent cu suportul.
Pierderile mici se pot acumula în mai multe cicluri
Caracterul repetitiv al SPPS duce la o problemă matematică semnificativă.
O mică imperfecțiune a unui singur etape poate părea insignifiantă, dar după multe repetiții, efectele ei pot să se acumuleze.
Să luăm un exemplu matematic simplu.
Dacă sinteza unui peptid necesitase 50 de etape de legare și fiecare dintre ele ar fi avut în mod independent o probabilitate de 99% de a se încheia cu succes, procentul teoretic de molecule care ar fi trecut cu succes toate cele 50 de etape ar fi fost de aproximativ 60,5%.
Acesta este doar un exemplu.
Aceasta presupune că toate etapele acționează identic și independent. Nu ia în considerare problemele legate de eliminarea grupurilor de protecție, reacțiile adverse, pierderile în timpul separării și purificării, agregarea și multe altele.
Prin urmare, acest rezultat nu trebuie interpretat ca o previziune a performanței reale a producției.
Exemplul arată doar de ce chiar și o performanță foarte ridicată a etapelor individuale nu garantează un produs brut chimic simplu după câțiva zeci de repetări.
De aceea, monitorizarea sintezei și controlul contaminării sunt importante pe tot parcursul procesului de preparare a peptidu, nu doar după adăugarea ultimului aminoacid.
Automatizarea, încălzirea și alte soluții tehnologice pot accelera procesul de sinteză, dar viteza procesului trebuie întotdeauna evaluată împreună cu calitatea produsului.
Un studiu asupra SPPS susținută de microfoane a analizat reziduarea dependentă de tip și formarea aspartimidului, demonstrând de ce condițiile reacției trebuie să fie în continuare adaptate la caracteristicile specifice a secvenței. [7]
Separarea și recuperarea produsului brut
Scăparea eliberează produsul de pe suport
După construirea secvenței peptidice planificate, acesta trebuie de obicei separat chimic de suportul său.
Acest etap este cunoscut sub numele de cleavage, adică desprinderea.
Dezintegrarea întrerupe legătura chimică intenționat proiectată între peptid și suport.
În funcție de strategia utilizată, dezinfectarea poate fi efectuată concomitent cu eliminarea părților sau tuturor grupurilor de protecție ale lanțurilor laterale. În alte procese, peptidul sau fragmentul său poate fi eliberat, cu respectarea anumitor măsuri de siguranță, dacă sunt planificate schimbări chimice ulterioare.
Chemia dezinhibării corespunzătoare depinde de ligant și de molecula țintă.
Condițiile care eliberează eficient un singur peptid pot deteriora grupul chimic sensibil din celălalt.
De aceea, dezinfectarea descrie un scop chimic, nu un set universal de reactivi sau condiții adecvate pentru toți peptizii.
De asemenea, structura corectă a structurii peptidei nu demonstrează că toate grupurile de protecție au fost apoi eliminate în mod eficient.
Afișarea lanțului și eliminarea finală a dispozitivelor de siguranță răspund la diverse întrebări chimice și necesită o evaluare separată.
Condițiile de epurare pot influența profilul poluării
Dezinfecția nu trebuie să fie o etapă chimic neutra.
Eliminarea grupurilor protectoare și ruperea legăturii peptidu-mediu poate duce la apariția de forme chimice reactive capabile să modifice peptida sau alte componente ale amestecului.
Din acest motiv, în metodele dezvoltate pot fi utilizate așa-numitele scavengery, adică compuși care capturează anumite produse reactive nedorite și influențează formarea produselor secundare.
În studiul din 2019, diferite scavengers au fost analizate în timpul extracției exenatidu din polimerul peptidic și s-a demonstrat că alegerea acestora a influențat calitatea produsului brut și profilul de poluare observat. [8]
Nu este necesar să se formuleze pe această bază o rețetă universală de eliminare a depunerilor.
Însă studiul arată că condițiile din această etapă pot influența calitatea produsului și, prin urmare, ar trebui evaluate pentru fiecare peptid în parte și pentru sistemul de grupuri de protecție utilizat.
Procesul de dezafectare corect are astfel mai multe dimensiuni.
Peptida trebuie să fie detașată corespunzător, grupurile de protecție necesare trebuie eliminate, materialul țintă trebuie recuperat și schimbările chimice nedorite trebuie controlate.
Recuperarea produsului brut nu este o curățare finală
După separarea de adsorbție, se efectuează un proces care permite separarea materialului care conține peptidul de ceara solidă și a celorlalte componente rămase din amestecul reactiv.
În acest caz, se pot utiliza diferențele de solubilitate, volatilitate sau alte proprietăți chimice.
Recuperarea unei impurități vizibile sau a unei fracțiuni care conține peptidă nu demonstrează, însă, că materialul este compus exclusiv din produsul intenționat.
La acest nivel, de obicei se vorbește despre un peptid brut.
Acesta poate conține o moleculă țintă împreună cu secvențe de deleție, lanțuri scurte, peptide modificate chimic, structuri nefinalizate, materiale provenite din reactivi și alte contaminante.
Importanța diferitelor poluanți depinde de secvența, condițiile de sinteză și utilizarea intenționată.
Într-unul dintre studii, s-a combinat cromatografia cu spectrometria de masă pentru a caracteriza produsele crude SPPS și a atribui peptidele respective fiecărui punct cromatografic. [9]
Acest lucru arată de ce informațiile obținute prin metodele de separare și structurale se completează reciproc.
Cromatografia poate demonstra prezența mai multor compuși, în timp ce spectrometria de masă poate furniza informații suplimentare care ajută la determinarea naturii acestora.
Curățarea și confirmarea identității răspund la diverse întrebări
Purificarea are ca scop îmbogățirea sau izolarea moleculei țintă dintre alte componente.
Identificarea răspunde însă la întrebarea dacă materialul izolat are într-adevăr proprietățile chimice așteptate.
Aceste întrebări se regăsesc parțial în răspunsurile anterioare, dar nu sunt identice.
Un pic cromatografic bine divizat nu constituie în mod automat dovada completă a structurii moleculei.
La fel, obținerea masei moleculare așteptată în sine nu reprezintă o evaluare completă a purității sau a corectitudinii structurale.
Variantele apropiate în secvență, izomerele stereo sau formele modificate chimic pot fi dificil de distins sau de separat.
Metoda de purificare ar trebui deci să fie evaluată în raport cu amestecul real creat în timpul unei anumite sinteze, și nu să fie considerată suficientă doar pentru că s-a dovedit eficientă în cazul unui alt peptid.
Dacă moleculea finală necesită, de asemenea, formarea de legături disiarțice, ciclibilizare sau alte transformări după finalizarea lanțului de polimerizare, apar întrebări analitice suplimentare privind corectitudinea legăturilor, uniformitatea structurală și dacă a fost de fapt obținută forma finală dorită a moleculei.
Beneficii, limitări și sursele poluării
De ce SPPS este atât de răspândită?
Una dintre cele mai importante avantaje ale SPPS este posibilitatea de a menține peptida format pe suportul de transport în timpul schimbărilor multiple ale reactivelor lichide.
Aceasta simplifică operațiunile chimice repetitive și permite automatizarea acestora.
Cematicienii pot introduce o secvență planificată de blocuri de aminoacizi, iar dacă chimia procesului permite, pot, de asemenea, să introducă anumite aminoacizi nestandard și alte modificări.
Sistemele automate moderne arată cât de departe se poate extinde această concepție.
În studiul privind sinteza automată a proteinelor din 2020 s-a descris obținerea de lanțuri proteice care conțin până la 164 resturi de aminoacizi. După curățarea și foldingul ulterioare, s-au obținut materiale funcționale. [10]
Acesta este un exemplu impresionant al posibilităților tehnice.
Dar aceasta nu înseamnă că orice secvență de 164 de resturi — nici fiecare peptid lung sau proteină — poate fi obținută cu aceeași ușurință.
Nu înseamnă, de asemenea, că curățarea și caracteristicile structurale devin inutile.
Analiza arată mai degrabă care sunt rezultatele care pot fi obținute prin un sistem atent conceput pentru moleculele selectate corespunzător.
Automatizarea controlează execuția procesului.
Însă nu este capabil să transforme chimia nepotrivită în cea potrivită.
Prin urmare, performanța dispozitivului, secvența peptidică și caracteristicile moleculei în sine trebuie analizate în mod combinat.
Cum se formează tipurile de poluare obișnuite?
În timpul SPPS pot apărea mai multe căi diferite care duc la apariția contaminanților. Înțelegerea lor ajută la explicarea motivului pentru care studiile analitice finale sunt încă necesare.
O serie de deleții sau un produs scurtat poate apărea atunci când nu se realizează integrarea planificată a unui aminoacid sau când creșterea lanțului este întreruptă. Deoarece lanțul anormal poate rămâne încă legat de polimer, spălarea ulterioară nu trebuie să îl elimine.
Epimerizarea înseamnă schimbarea configurației stereociclică a unui centru specific. Aceasta are o importanță analitică deosebită, deoarece un epimer poate avea aceeași masă moleculară nominală ca și peptidul propriu, dar să difere în același timp în ceea ce privește configurația spațială.
Produsele derivate din aspartimidă pot apărea ca urmare a reacțiilor secundare dependente de secvența asparaginăi. În funcție de evoluția chimică, poate apărea mai mult de un tip de astfel de produse.
Eliminarea incompletă a grupărilor protectoare apare atunci când grupul care trebuie eliminat rămâne legat de molecula. Peptida poate astfel să aibă o lungime nominală a lanțului așteptată, dar să continue să aibă o structură chimică anormală.
Modificările asociate cu deaminarea pot apărea în timpul eliberării finale a peptidei sau în timpul eliminării grupărilor protectoare. Astfel, construirea corectă a lanțului nu garantează că peptidul va trece prin etapa de deaminare fără modificări.
Reacțiile incomplete asociate cu agregarea pot apărea atunci când lanțurile formate interacționează între ele într-un mod care limitează accesul la locurile de reacție. Introducerea unei cantități suficiente de reactant în recipientul de reacție nu garantează că fiecare loc de reacție este fizic accesibil și reacționează corespunzător.
Acestea sunt posibile căi de apariție a poluării.
Acest lucru nu înseamnă că fiecare partid care primește sprijin prin SPPS trebuie să conțină toate tipurile de nereguli menționate.
Importanța lor în sinteza specifică se stabilește pe baza cunoștințelor despre proces, a analizei analitice și a controlului de calitate adecvat.
Peptidele naturale complexe necesită ceva mai mult decât o replicare a secvenței
Unele peptide sunt structurau mult mai complexe decât ar fi rezultatul unei singure secvențe liniare de aminoacizi.
Un exemplu bun este epidermina.
Caracteristica structurală a epidermei a evidențiat prezența mai multor inele conținând azot și a unor resturi neobișnuite. [11]
Singurul reproces al ordinii liniară a aminoacizilor nu ar fi fost, prin urmare, dovada suficientă că s-a obținut o epidermă maturizată autentic.
Această distincție este importantă în interpretarea publicațiilor sau a cercetărilor privind sinteza epidermei în fază constantă.
Publicația poate descrie un precursor liniar, un fragment, un analog sau o altă structură conexe, și nu o sinteză completă verificată a unei molecule mature complete.
Publicația structurală citată aici sub numele [11] descrie caracteristicile proprii epidermei; aceasta nu este un raport privind sinteza ei totală prin metoda SPPS.
Concluziile privind sinteza completă trebuie, prin urmare, evaluate în raport cu structura reală a moleculei țintă, și nu doar cu secvența liniară de aminoacizi a acesteia.
Productivitatea, curățenia și identitatea trebuie prezentate separat
Cele trei concepte care sunt adesea confundate în discuțiile despre sinteza peptidelor sunt performanță, puritate și identitate.
Marea masă de produs recuperat nu trebuie să însemne că majoritatea acestui material este formată din peptidul intenționat. Materialul brut poate conține cantități semnificative de contaminanți.
Oricum, o puritate cromatografică ridicată nu confirmă automat toate aspectele identității structurale.
Chiar și un peptid al cărui structură chimică a fost caracterizată exact nu obține în acest fel automat o utilizare biologică, terapeutică sau clinică confirmată.
Acestea sunt chestiuni distincte.
O astfel de descriere fidelă a sintezei ar trebui să indice care a fost compoziția țintă, în ce etapă s-a măsurat performanța, dacă materialul analizat a fost brut sau purificat și ce date analitice au fost utilizate pentru a confirma afirmațiile privind structura.
Astfel, rezultatele sintezei pot fi interpretate și comparate într-un mod mai credibil.
Un valor procentual sau o valoare de masă individuală nu trebuie transformat într-un pronostic general că un peptid este „de înaltă calitate”, fără a cunoaște ceea ce a fost de fapt măsurat.
Întrebări frecvente
1. De ce se folosește în SPPS etapa constantă?
Faza stațioasă menține peptida format în suport, în timp ce reactanții solubili, produsele secundare ale reacției și soluțiile de deplasare pot fi introduse și eliminate în mod repetat. Acest lucru simplifică semnificativ procesul de fabricare a lanțului și permite automatizarea sintezei peptidelor, un exemplu fiind metodele moderne de sinteză automată a lanțului. [10] Cu toate acestea, suportul nu garantează că fiecare reacție va decurge perfect sau nu va separa corect lanțul neformat legat de polimerizant de cel corect. Avantajul său principal este îmbunătățirea conducerii procesului. Selectivitatea chimică, completitudinea reacției, puritatea și identitatea structurală necesită în continuare o evaluare separată.
2. Elimină sinteza la fază constantă nevoia de purificare?
Nu. Lanțurile peptide anormale pot rămâne lipite de polimer în timpul sintezei și apoi să fie eliberate împreună cu produsul dorit. Analizele care analizează produsele crude SPPS prin cromatografie și spectrometrie de masă arată că spălarea în timpul sintezei și curățarea finală au funcții diferite. [9] Spălarea elimină în principal componentele solubile care înconjoară polimerul, în timp ce curățarea după separarea polimerului are rolul de a separa peptidul dorit de componentele peptide și nonpeptide. SPPS simplifică operațiunile intermediare, dar nu garantează puritatea finală.
3. Înseamnă „faza staționară” că nu se utilizează solventul?
Nu. În SPPS convențională, suportul insolubil, de obicei, este înconjurat de reactivi lichizi și solventi. Solventii influențează mediul fizic al cearei, inclusiv gradul de fragilizare și ușurința cu care reactivi pot ajunge la lanțurile adiacente. Studiile experimentale au demonstrat fragilizarea cearei dependentă de solvent și modificările asociate cu chimia legantului, gradul de fragilizare și prelungirea lanțului. [2] Ceara și solventul formează astfel un mediu de reacție în comun.
4. În ce direcție crește peptida în timpul SPPS?
SPPS-ul etapic conventional constă de obicei în construirea unui peptid de la restul său C-terminal spre N-terminal. Primul aminoacid care va constitui C-terminalul moleculei finite este atașat la suport, iar următoarele resturi prelungesc capătul aminoacidic al lanțului. Metodele publicate bazate pe Fmoc prezintă acest tipar caracteristic. [1] Cu toate acestea, există strategii specializate care utilizează fază constantă, care pot fi implementate în mod diferit.
5. Înseamnă același lucru plasticul și lipiciul?
Nu. Ceara este un vehicul insolubil, în timp ce legantul reprezintă o legătură chimică între vehicul și peptida în creștere. Funcționalitatea legantului poate, independent de polimerul în sine, influența legarea, conservarea cearei și eliberarea ulterioară a peptida. Studiile privind vehiculele utilizate în sinteza peptidelor arată de ce singurul termen pentru a descrie comportamentul întregului sistem nu este suficient. [2]
6. Într-adevăr, un grad mai mare de adeziv crește întotdeauna producția?
Nu. O încărcare mai mare înseamnă un număr mai mare de locuri potențiale de legare pentru o anumită cantitate de suport, dar aceasta nu trebuie să ducă la obținerea unei cantități mai mari de peptidă bine formată și ușor de recoltat. Gradul de încărcare poate modifica mediul molecular local și a fost indicat experimental ca unul dintre factorii care influențează fragilizarea rășinii. [2] Dacă lanțurile legate sunt prea dense sau interacționează puternic între ele, disponibilitatea locurilor reactive poate scădea. De aceea, încărcarea trebuie analizată împreună cu proprietățile rășinii, comportamentul secvenței, performanța reacției și calitatea produsului final.
7. De ce sunt protejate aminoacizii în timpul formării peptidu?
Echipamentele de protecție împiedică temporar grupurile reactive alebiți să participe la reacții, în timp ce se formează o legătură specifică. Acest lucru permite o legare etapizată și controlată a lanțului. Cu toate acestea, protecția nu elimină toate reacțiile secundare. Studiile pe modele demonstrat, de exemplu, că strategia echipamentelor de protecție și a secvenței care le înconjoară poate influența formarea aspartimidului. [5] Echipamentele de protecție asigură astfel selectivitate chimică, dar întreaga strategie de protecție și de dezlipire necesită în continuare o planificare și o evaluare atentă.
8. Ce înseamnă protecția ortogonală a grupurilor funcționale?
Ortogonalitatea înseamnă posibilitatea de a elimina o singură grupă de protecție în condiții care lasă alte protecții necesare în proporție suficientă intacte. Acest lucru permite expunerea unor locuri de reacție specifice în etapele planificate ale sintezei. Metodele stabilite pentru SPPS se bazează pe o protecție și o dezprotecție controlate, în loc să se expună simultan toate grupurile de protecție. [1] Conformitatea reală a protecțiilor aplicate rămâne totuși dependentă de componenta țintă și de condițiile reacției.
9. Ce inseamnă Fmoc și Boc și sunt acestea diferite tipuri de peptide?
Nu. Fmoc și Boc sunt grupuri de protecție și strategiile asociate cu acestea sunt sintetice, nu diferite tipuri de structuri peptidice. Diferențele în chimia de eliminare a acestora influențează modul de realizare a sintezei, dar chimia de protecție temporară nu trebuie confundată cu structura finală a peptidu-ului țintă. Metodele publicate bazate pe Fmoc prezintă unul dintre variantele cele mai utilizate ale SPPS, dar aceasta nu înseamnă că fiecare peptid trebuie să fie obținut prin această metodă. [1]
10. Poate deja prima etapă a conectării să genereze poluare?
Da. Etapa de adunare poate influența calitatea stereochimică încă înainte de începerea îndepărtării multiple a lanțului. Metode analitice special concepute pentru determinarea racemizării în timpul adunării de aminoacizi proteici cu proteina de legare au fost dezvoltate [3]. Acest lucru nu înseamnă că fiecare adunare provoacă racemizare semnificativă. Însă indică faptul că adunarea în sine este un etapă chimic semnificativă, în timpul căreia pot apărea modificări măsurabile care trebuie luate în considerare în evaluarea generală a calității.
11. De ce anumite secvențe peptidice sunt descrise ca fiind dificile?
Unele lanțuri peptide crescătoare interacționează între ele sau cu lanțurile adiacente într-un mod care limitează accesul la locurile de reacție. Legările hidrodinamiice, interacțiunile hidrofobe și comportamentele care amintesc de agregare pot dificulta ulterior legarea ulterioară. Studiile privind secvențele sensibile la agregare arată că schimbarea modului de agregare poate influența compoziția produsului finit. [4] Astfel, dificultatea sintezei depinde de proprietățile moleculei și de condițiile reacției, și nu doar de lungimea peptidu.
12. Întotdeauna o sinteză mai rapidă înseamnă un produs mai bun?
Nu. Viteza sintezei și calitatea produsului sunt parametri distincte. Încălzirea, asistența cu microunde și automatizarea pot scurta timpul procesului, dar accelerarea reacțiilor poate, de asemenea, schimba echilibrul dintre reacțiile dorite și cele secundare. Studiile privind sinteza asistată cu microunde au evidențiat o racemiție dependentă de tipul restului și formarea de aspartimid, ceea ce indică necesitatea unei controalelor adecvate a condițiilor. [7] Un timp de sinteză mai scurt este benefic numai atunci când materialul obținut îndeplinește, de asemenea, criteriile chimice și analitice necesare.
13. Înseamnă dezinfectarea pur și simplu îndepărtarea granulelor de rășină?
Nu. Desprinderea este un proces chimic care duce la ruperea legăturii proiectate între peptid și suport. În schimb, eliminarea granulelor de ceară prin filtrare este o operațiune fizică de separare și în sine nu confirmă buna desfășurare a procesului chimic de desprindere. Eliberarea peptidului poate avea loc concomitent cu eliminarea grupărilor protectoare și cu alte reacții. Studiile privind scavengerii utilizați în timpul desprinderii arată că această etapă poate influența profilul poluării. [8]
14. Înseamnă performanța ridicată a produsului brut o puritate ridicată a peptidu?
Nu. Performanța strictă descrie cantitatea de material recuperat înainte de eliminarea tuturor componentelor nedorite. Acest material poate conține peptidul țintă, împreună cu secvențele de deleție, structurile modificate, restul grupurilor de protecție și alte contaminanți. Analizele de compoziție strictă a amestecurilor SPPS utilizând cromatografie și spectrometrie de masă arată de ce masa recuperată, puritatea și identitatea moleculară necesită o interpretare separată. [9] Astfel, performanța prezentată corect trebuie să indice etapa în care aceasta a fost măsurată și dacă materialul a fost deja purificat.
15. SPPS permite obținerea de lanțuri peptide lungi?
Da. Metodele SPPS elaborate cu atenție pot permite obținerea de lanțuri foarte lungi. În studiile privind sinteza automatizată a fluxului, s-au obținut lanțuri care conțineau până la 164 resturi, care au fost apoi purificate și foldate înainte de evaluarea funcțională. [10] Acest lucru evidențiază posibilitățile sintezei moderne a peptidelor, dar nu înseamnă că orice secvență cu o lungime similară poate fi obținută cu aceeași eficiență. Lungimea este doar unul dintre factori; importanță au, de asemenea, agregarea dependentă de secvență, reacțiile secundare, cerințele de folding și dificultatea de purificare.
16. Construirea unei secvențe epidermice înseamnă realizarea sintezei ei complete?
Nu. Epidermia maturată conține elemente structurale neobișnuite, inclusiv inele care conțin azot, care depășesc ordinea liniară a aminoacizilor. Acest lucru a fost demonstrat în studii structurale. [11] Obținerea unei secvențe liniare, a unui precursor sau a unui fragment nu înseamnă în mod automat sinteza unei molecule complet maturate. Pretenția privind sinteza completă necesită date analitice care să confirme reproducerea legăturilor propuse și a altor elemente structurale importante.
17. Massă moleculară așteptată confirmă corectitudinea structurii?
Nu. Obținerea masei moleculare așteptate reprezintă o informație valoroasă, dar masa însăși nu confirmă toate aspectele structurii peptiduzei și nu exclude toate contaminanții relevanți. Două molecule pot avea aceeași masă nominală și, în același timp, să prezinte diferențe de stereochimie sau un anumit tip de structură. Studiile care includ separarea peptidelor epimere arată de ce diferențele de stereochimie pot necesita metode analitice capabile să diferențieze structuri care nu pot fi distins de la o singură dată prin măsurarea masei. [12] Astfel, caracteristicile finale trebuie proiectate având în vedere contaminanții realistici și structurile alternative care pot apărea în timpul unei sinteze specifice.
Rezumat
Simularea peptidelor la fază solidă a schimbat chimia peptidelor, permițând menținerea lanțului în creștere pe un suport insolubil în timpul introducerii repetate, efectuării reacțiilor și eliminării reactanților solubili. Acest lucru facilitează construirea etapizată a secvențelor și constituie baza practică a sintezei automate.
Simplitatea aparentă a acestei metode nu ar trebui să ascundă însă chimia care se produce în fiecare etapă.
Ceara, ligant și gradul de polimerizare influențează proprietățile importante ale mediului de sinteză. Compresia dependentă de solvent influențează accesul la lanțurile legate de ceară. Grupele de protecție controlează care grupe funcționale pot reacționa, în timp ce reacțiile de ligare construiesc structura peptidică a restului după restul. [1] [2]
Fiecare dintre aceste etape are, de asemenea, propriile limitări.
Conectarea inițială poate afecta calitatea stereochimică. [3] Secvențele dificile pot agrega și reduce accesul la reactanți. [4] Chimie de protejare și eliminare a grupărilor protectoare poate favoriza reacțiile secundare, cum ar fi formarea de aspartimidă. [5] [6] Condițiile accelerate de sinteză pot modifica gradul de racemizare sau profilul de contaminare. [7] Condițiile de separare pot afecta, de asemenea, compoziția produsului brut. [8]
Prin urmare, construirea corectă a lanțului nu este echivalentă cu obținerea unui peptid pur și identificat corect.
Recuperarea produsului brut, purificarea și caracterizarea structurală rămân etape separate. Cromatografia poate furniza informații despre compoziția amestecului și puritatea acestuia, în timp ce spectrometria de masă și alte metode analitice furnizează informații despre identitate. Niciun rezultat analitic individual nu trebuie să confirme toate aspectele structurii unui peptid. [9] [12]
Simularea automatizată modernă a fluxului de reacții demonstră că, în condiții adecvate, SPPS poate fi aplicată chiar și la lanțuri foarte lungi. [10] În același timp, peptidele structurativ complexe, precum epidermina, demonstrează de ce replicarea liniară a unei secvențe de aminoacizi poate fi insuficientă dacă moleculele mature conțin inele suplimentare, resturi neobișnuite sau un anumit tip de legături. [11]
Cel mai bine să înțelegem SPPS nu ca pe o singură reacție, ci ca pe o serie de etape chimice și analitice separate.
Conectarea stabilește punctul de pornire. Cicluluri repetate de securizare, de deschidere și de conectare construiesc un lanț planificat. Desprinderea eliberează produsul. Curățarea separă componenta țintă de elementele nedorite. Caracteristica finală permite apoi să se stabilească dacă materialul izolant are, într-adevăr, structura și calitatea atribuită lui.
Divizarea acestor etape permite evitarea mai multor neînțelegeri frecvente: sinteza reușită nu confirmă automat puritatea, performanța ridicată nu confirmă automat identitatea, iar masa moleculară așteptată în sine nu demonstrează în mod automat exactitatea structurală.
Referințe
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Sinteza peptidelor în fază solidă: de la proceduri standard la sinteza secvențelor dificile. Protokole Naturi, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K. și Willway, H. (2020). Investigație a parametrilor care afectează dilatarea rășinii în solvenți verzi. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Utilizarea reactivului Marfey pentru cuantificarea racemizării în urma legării aminoacizilor la suporturile solide în vederea sintezei de peptide. Biochemică analitică, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluarea utilizării combinate a Oxyma și HATU pentru agregarea secvențelor peptide. Jurnalul de Chimie a Peptidei, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Problema aspartimidei în SPPS bazat pe Fmoc. Partea I. Jurnalul de Chimie Peptidică, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Problema aspartimidei în SPPS bazat pe Fmoc. Partea a II-a. Jurnalul de Chimie Peptidică, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J. și Collins, J. M. (2007). Limitarea racemizării și a formării aspartimidei în sinteza peptidică în fază solidă Fmoc asistată de microunde. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzenedimethaniol (1,4-BDMT) ca agent de eliminare a fragmentărilor peptidei în urma hidrolizei. RSC avansează, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). Caracterizarea produselor brute din sinteza pe fază solidă de peptide prin spectrometria de masă cu mu-HPLC/bombardament rapid cu atomi. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E. și Pentelute, B. L. (2020). Sinteza proteinelor prin chimie de flux automatizată. Știință, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: Secvențierea unui antibiotic heterodetic tetraciclic cu amida peptidică 21. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Studii privind racemizarea în sinteza peptidelor prin separarea peptidelor epimere protejate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu fază inversată. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x