Syntéza peptidů ve fixní fázi, nejčastěji označovaná zkratkou SPPS (solid-phase peptide synthesis), je chemickou metodou budování peptidů z aminokyselin po aminokyselině, přičemž jeden konec vznikajícího řetězce zůstává chemicky spojen s nerozpustným nosičem.
Místo izolace vznikajícího peptidu po každé reakci chemici ponechávají jej v přítomnosti pevných látek, přičemž uvádějí a odstraňují další kapalné činidla a rozpouštědla. Opakovací cykly umožňují odhalit reaktivní aminovou skupinu, připojit další aminokyselinu a odstranit rozpouštědla, která již nejsou potřebná. Po dokončení plánované sekvence aminokyselin lze peptid oddělit od nosiče a poté podrobit další úpravě a analýze.
Taková organizace procesu je jedním z hlavních důvodů, proč se SPPS stala tak důležitou metodou v chemii peptidů. Stálá fáze zjednodušuje provádění mnoha opakovaných chemických reakcí a umožnila automatizaci syntézy.
Komfort syntézy v pevném stavu však neznamená záruku chemické dokonalosti.
Připojení vznikajícího peptidu k nosiči nezaručuje, že každý řetězec obdrží všechny plánované aminokyseliny. Také neznamená, že materiál uvolněný na konci procesu bude chemicky čistý nebo bude mít správnou strukturu.
Skládání řetězce, odstraňování a opětovné získávání produktu, čištění, potvrzení identity a konečná strukturální charakterizace jsou samostatnými částmi celého procesu.
Současné metodologické publikace ukazují jak užitečnost SPPS, tak potřebu modifikace standardních metod v případě složitých sekvencí. V jedné z publikovaných metod využívajících strategii Fmoc je popsán například rutinní syntéza, ale také upravený přístup k peptidovým sekvencím náchylným k agregaci. [1]
Chápání SPPS tedy vyžaduje něco víc než jen zapamatování dalších chemických kroků. Je také potřeba vědět, jaký je účel každého kroku, co se může během něj pokazit a jaké analytické otázky je třeba položit i po jeho dokončení.
Co je syntéza peptidů v pevném stavu?
Vytvářející peptid zůstává připojen a roztoky se mění
V konvenční SPPS je peptid chemicky připojen k malým nerozpustným částicím, které se obvykle nazývají vláknovými zrnky, pomocí vhodného chemického spojovacího činidla.
Zrnká zůstávají v reaktantním systému, zatímco další kapalné činidla a rozpouštědla se dávají do působení a odstraňují.
To výrazně zjednodušuje opakovanou syntézu.
V klasické etapové syntéze v roztoku může být izolace a čištění rostoucího peptidu po každém připojení aminokyselin náročné. V SPPS vznikající řetězec zůstává vázán na nerozpustnou fázi. Díky tomu lze rozpustné přebytečné činidla a mnoho vedlejších produktů odstraňovat pomocí odplynění, zatímco peptid vázaný na živici zůstává na svém místě.
Výraz „stálá fáze” však může vést k nedorozuměním.
To neznamená, že tvorba peptidových vazeb probíhá bez účasti tekutiny nebo rozpouštědla.
Peptidová hmota je obvykle obklopena tekutým reaktivním prostředím a její interakce s rozpouštědlem může významně ovlivnit průběh syntézy. Reakční činidla musí nadále pohybovat v polymerním prostředí nebo kolem něj a pronikat do reaktivních míst rostoucího peptidu.
Připojení peptidu k nosiči má obvykle kovalentní povahu. To znamená, že vznikající molekula je spojena s nosičem prostřednictvím vazby pomocí chemického spojení.
Peptid tedy není jen tak uvězněn mezi částicemi, zadržen filtrem nebo volně uložen na povrchu.
Takové chemické spojení je záměrně navrženo tak, aby vznikající řetězec zůstal vázán během dalších reakcí a etap odstraňování, a poté mohl být v odpovídajících podmínkách uvolněn.
Konvenční syntéza probíhá od C-konečků směrem k N-konečkům
Klasická lineární strategie SPPS obvykle začíná aminokyselinou, která v hotovém peptidu bude představovat její C-koncový fragment.
Zbytek se připojí k nosiči.
Po odkrytí příslušné reaktivní aminové skupiny se přidává další zabezpečený aminokyselina a chemicky se připojuje k vznikajícímu řetězci. Opakování tohoto procesu postupně prodlužuje peptid směrem k N-konci.
Je třeba zdůraznit tento směrový prvek, protože se odlišuje od biologické syntézy proteinů pomocí ribozomů.
Syntéza ribozomální prodlužuje polypeptid od N-konce směrem k C-konci. Konvenční kroková SPPS obvykle vytváří sekvenci v opačném směru.
Koncová sekvence aminokyselin však může být stejná. Rozdíl je v tom, jak je tvořena.
Je důležité definovat pojem „konvenční”, protože chemie peptidů zahrnuje také specializované strategie využívající alternativní místa připojení, syntézu fragmentů, reakce ligace a další nestandardní řešení.
Popis směru od konce C do konce N tedy odkazuje na typický krokový proces SPPS a nikoli na všechny možné metody peptidové chemie využívající stálou fázi.
SPPS je pouze jedním z prvků tvorby peptidů
Syntéza v pevném stavu není jediným způsobem získávání peptidů.
Peptidy lze také získávat chemickou syntézou v roztoku, biologickými expresními systémy, enzymatickými transformacemi, ligací fragmentů nebo kombinací různých metod.
SPPS je obzvlášť užitečná v situacích, kdy je potřeba kontrolovat sestavování sekvencí a využívat zabezpečené, modifikované nebo jinak specializované aminokyselinové stavební bloky.
I v rámci jednoho projektu týkajícího se konkrétního peptidu není vždy třeba používat stejnou metodu od začátku do konce.
Jednotlivé fragmenty peptidu mohou být například syntetizovány na bázi živice, odděleně čištěny a poté spojeny jinou chemickou metodou. Jiné molekuly mohou vyžadovat faldování, oxidaci, cyklizaci nebo další strukturalní modifikace již po získání původní lineární sekvence.
Výběr správné cesty závisí tedy na cílové molekule, její struktuře a analytických a kvalitativních požadavcích projektu.
Proces je třeba chápat jako sérii dalších otázek.
Připojení k nosiči určuje počáteční bod a má vliv na pozdější chemickou reakci uvolňování produktu. Je však stále třeba určit, zda připojení proběhlo správně a zda byla zachována stereochemická integrita.
Při složení řetězce je třeba zajistit spojení aminokyselin v plánovaném pořadí. Poté je však třeba zkontrolovat, zda všechny řetězce reagovaly správně a zda nevznikly sekvence chybějících aminokyselin, zkratované nebo modifikované produkty.
Odstraňování a likvidace ochranných skupin má umožnit uvolnění peptidu a odstranit určité chemické ochrany. Samotné účinné uvolnění produktu však neříká, jaké další látky se nacházejí v surovém materiálu.
Očista slouží k oddělení požadovaného materiálu od nežádoucích složek, ale i tak vyčištěná frakce stále vyžaduje potvrzení identity a hodnocení kvality.
Koncová struktura a analytická charakteristika mají však odpovědět na otázku, zda izolovaný materiál má chemické vlastnosti očekávané pro cílový peptid a zda použité analytické metody jsou vhodné pro zamýšlené použití.
Jedná se o koncepční kroky, nikoli o laboratorní instrukci. Konkrétní činidla, zařízení a podmínky reakce závisí na cílovém peptidu a vyžadují vhodně vyvinutou a validovanou metodu.
Připojení k živici a složení řetězu
Živica, spojovací materiál a stupně přilnutí plní různé funkce
V diskusích o SPPS se často objevují tři termíny: živice, spojiva a stupeň přilnutí, tedy loading.
Popisují je vázané, ale odlišné vlastnosti.
Živica je nerozpustný materiál, který slouží jako nosič.
Spojovací prostředek zajišťuje chemické spojení mezi tímto nosičem a peptidem nebo první aminokyselinou. Jeho chemie může ovlivnit jak způsob připojení peptidu, tak i jeho následné uvolňování.
Loading popisuje však počet reaktivních míst připojení vzhledem k množství nosiče.
Tyto pojmy nejsou synonymy.
Dvě pryskyřice mohou fyzicky vypadat velmi podobně, ale zároveň mohou mít odlišné funkční skupiny, vazby nebo stupeň polymerizace. Tyto rozdíly mohou ovlivnit dostupnost reaktivních míst při syntéze řetězce, tuhnutí pryskyřice a chemickou podobu konečného peptidu po oddělení.
Dalším důležitým prvkem je plánovaná skupina na C-konec.
Různé systémy nosiču–reakce mohou být voleny například tak, aby se získal peptid zakončený karboxylovou nebo amidovou skupinou.
Jedná se o významný chemický rozdíl.
Změna terminální skupiny znamená změnu samotné molekuly a nikoli pouze způsob jejího balení nebo popisu.
Zkroucení ovlivňuje dostupnost připojených řetězů
Mnoho živic používaných v SPPS pohlcuje rozpouštědlo a po kontaktu s příslušným tekutým prostředím se zahušťuje.
To mění polymérní prostředí a může zvyšovat nebo snižovat prostor, kterým musí rozpustné činidla pohybovat, aby se dostaly k peptidovým řetězcům spojeným s živicí.
Zpětné zatížení tedy není pouze fyzickou zajímavostí.
Může ovlivňovat dostupnost reaktivních skupin během syntézy.
Systematické studie nosičů založených na polystyrenu a PEG prokázaly, že vlastnosti jako typ vazby a stupeň přichycení pryskyřice významně ovlivnily pěnění v testovaných ekologičtějších rozpouštědlech. Také bylo zjištěno, že pěnění se může měnit při odstraňování ochranných skupin a také při prodlužování peptidového řetězce. [2]
To ukazuje, že chování pryskyřice nelze vždy považovat za její stálou vlastnost.
V praxi to závisí na interakci živice, rozpouštědla, lanko-spojujícího činidla, připojeného peptidu a aktuálního stadia syntézy.
Dobré zředění nebo příznivý průběh reakce pro jednu kombinaci živice, rozpouštědla a peptidu tedy neznamená, že jiná kombinace bude chovat se stejně.
Samotný proces připojení také vyžaduje kontrolu kvality.
První fáze připojení může působit jednoduchou, protože peptidový řetězec teprve začíná vznikat.
Chyba zavedená v tomto kroku však může zůstat přítomná i během celého následného syntézy.
Pokud bude první zbytková část připojena nesprávně, nebo se během tohoto procesu změní její stereochemická konfigurace, správné připojení všech následujících zbytkových částí nemusí odstranit původní problém.
V roce 1992 byl vyvinut analytický postup určený speciálně k měření racemizace prováděné při připojování zabezpečených aminokyselin k pevných nosičům. [3]
Význam této práce přesahuje samotnou analytickou metodu použitou.
To ukazuje, že stereochemická kvalita může vyžadovat kontrolu ještě před zahájením opakujících se cyklů prodlužování řetězce.
Také množství materiálu, které bylo původně připojeno k nosiči, vyžaduje správnou interpretaci.
Nominální stupeň polymerace, měřený experimentálně, množství surového materiálu získaného po odštěpování a konečná účinnost izolovaného a čištěného peptidu jsou různými veličinami.
Nemají být považovány za náhradní ukazatele úspěšnosti syntézy.
Dlouhé řetězy mohou být stále obtížněji dostupné
Jak se peptidový řetězec prodlužuje, samotná připevněná částice začíná ovlivňovat své chemické prostředí.
Sousední řetězce se mohou navzájem ovlivňovat prostřednictvím vazeb vodíkových, hydrofobních interakcí a dalších mezichmoterických sil. Některé sekvence mohou vykazovat obzvláštní silnou tendenci k takovým interakcím.
To může omezit přístup k reaktivním skupinám.
V takové situaci může být připojení dalšího aminokyselinového řetězce obtížnější, i když do systému byl zřejmě přidán dostatečný objem spojujícího činidla.
V rámci studie týkající se složitých sekvencí citlivých na agregaci byla porovnána řada metod pro jejich spojení a analyzovány získané surové produkty. Výsledky podporují princip, že proces by měl být přizpůsoben konkrétní sekvenci namísto předpokládání existenci jedné strategie spojení, která je vždy nejlepší. [4]
To také vysvětluje, proč samo zvýšení koncentrace živice nebo množství činidla automaticky nevyřeší všechny problémy.
Pokud je základním problémem omezený přístup k reaktivním místům, stává se důležitějším než otázka množství přidávaného činidla otázka, zda skutečně dorazil do příslušných míst a zda reakce proběhla efektivně bez vzniku nepřijatelného množství vedlejších produktů.
Ochrana, odstranění ochranných skupin a spojování
Ochranné skupiny kontrolují místo výskytu reakce
Aminokyseliny obsahují chemické skupiny schopné podílet se na různých reakcích.
Při kontrolovaném podávání peptidu chtějí chemici obvykle, aby určité aminové skupině došlo k reakci s konkrétním blokem obsahujícím karboxylovou skupinu, zatímco ostatní potenciálně reaktivní místa zůstanou dočasně neaktivní.
To právě skupinám ochrany slouží.
Dočasně blokují vybraná aktivní místa, což umožňuje jinému místu účastnit se plánované reakce.
V běžně používané strategii SPPS založené na Fmoc zůstává konečná aminová skupina rostoucího řetězce zajištěna mezi následujícími fázemi sloučení. Když má být přidán další aminokyselina, dočasná ochrana se odstraní, čímž se odhalí aminová skupina.
Reaktivní boční řetězce mohou mít samostatné ochranné skupiny navržené tak, aby zůstaly nedotčené během opakujících se cyklů vytváření hlavního řetězce.
Cílem je kontrolovaná selekce.
Správný blok obsahující karboxylovou skupinu by se měl spojit s příslušnou aminovou skupinou, místo aby vedl k nekontrolovanému rozdělení nebo jiným konkurenčním reakcím.
Ortogonalita znamená možnost selektivního odstranění zabezpečení.
Ortogonalní strategie ochranných skupin umožňuje odstranit jednu ochrannou skupinu za podmínek, kdy ostatní potřebné zabezpečení zůstane dostatečně nedotčeno.
To chemikovi poskytuje možnost kontrolovatelného odhalování různých reaktivních míst v jednotlivých fázích syntézy.
FMOC a Boc jsou dobře známé termíny v chemii peptidů, ale neznamenají různé typy peptidových vazeb ani různé konečné struktury peptidů.
Jedná se o ochranné skupiny spojené s různými strategiemi syntézy a různými metodami jejich odstranění.
Dočasnou chemickou cestu používanou při tvorbě peptidu je tedy třeba odlišit od jeho konečné struktury.
Opatření také neposkytují plnou ochranu před všemi možnými vedlejšími účinky.
Výzkum vzniku aspartimidu například ukazuje, že strategie zabezpečení, sousední aminokyselinové zbytky a podmínky odstraňování ochranných skupin mohou mít vliv na vznik znečištění i v dobře známých metodách SPPS [5] [6].
Strategie ochranných skupin tedy omezuje určité nežádoucí reakce, ale neodstraňuje potřebu kontroly procesu ani konečné analytické charakteristiky.
Spojení vytváří další amidovou vazbu skelové struktury peptidu.
Reakce spájení vede k vytvoření dalšího amidového vazebného bodu v struktuře peptidu.
Aminokyselinový blok obsahující karboxylovou skupinu je obvykle chemicky aktivován, aby mohl účinně reagovat s odkrytou aminovou skupinou rostoucího peptidu spojeného s živicí.
Po ukončení spárování lze rozpustný přebytek materiálu odstranit mýdlovým mytím.
Nově připojený aminokyselina se stává konečnou zbytkovou součástí rostoucího řetězce. Poté lze odhalit její aminokyselinovou skupinu a zahájit další cyklus syntézy.
Teoreticky opakování této sekvence umožňuje kontrolovat pořadí aminokyselin prostřednictvím kontroly pořadí vstupu stavebních bloků.
V praxi však existuje velmi důležité upozornění:
Plánovaná chemická reakce musí skutečně proběhnout správně v každém cyklu.
Pokud je jedno spojení neúplné, část řetězů nemusí obdržet plánovanou částku.
Pokud zůstanou spojeny s živicí a správně reagují v dalším cyklu, mohou vzniknout sekvence delecyjne, tedy molekuly peptidů bez jednoho nebo několika plánovaných aminokyselin.
Ostatní řetězce mohou zůstat zkráceny.
Oplachování odstraňuje rozpustné činidla a vedlejší produkty, ale selektivně eliminuje všechny nesprávně sestavené řetězce, které jsou stále kovalenčně spojeny s nosičem.
Malé ztráty se mohou kumulovat v mnoha cyklech
Opakovací charakter SPPS vede k významnému matematickému problému.
Malá nedokonalost jednotlivého kroku se může jevit jako nepodstatná, ale po mnoha opakováních její dopady mohou začít kumulovat.
Rozmysleme si jednoduchý matematický příklad.
Pokud by syntéza peptidu vyžadovala 50 kroků spárování a každý z nich sám o sobě měl 99 procentní pravděpodobnost správného dokončení, teoretický podíl částic, které úspěšně dokonaly všechny 50 kroků, by byl přibližně 60,5%.
Je to pouze ilustrace.
Predpokládá, že všechny fáze působí stejně a nezávisle. Nebere v úvahu problémy s odstraněním ochranných skupin, vedlejší účinky, ztráty během odstraňování a čištění, agregaci ani mnoho dalších skutečných faktorů.
Proto by se tento výsledek neměl interpretovat jako předpověď skutečné výkonnosti výroby.
Příklad pouze ukazuje, proč dokonce velmi vysoká účinnost jednotlivých kroků nezaručuje chemicky jednoduchý surový produkt po několika desítkách opakování.
Proto je sledování syntézy a kontrola znečištění důležité během celého procesu tvorby peptidu, a nikoli až po přidání posledního aminokyselinového řetězce.
Automatizace, vytápění a další technologická řešení mohou urychlit syntézu, ale rychlost procesu by měla být vždy posuzována spolu s kvalitou produktu.
Studie o mikrovlně podporované syntéze SPPS analyzovala závislost typu zbytkových produktů na syntéze a vznik aspartimidu, což ukázalo, proč podmínky reakce musí být nadále přizpůsobeny vlastnostem konkrétní sekvence. [7]
Odstranění a získání surového produktu
Odstraňování uvolňuje produkt z nosiče
Po vytvoření plánované sekvence peptidů je obvykle chemicky oddělen od nosiče.
Tento krok je označován jako cleavage, což znamená odpojení.
Odstraňování odděluje záměrně navržený chemický vazebný bod mezi peptidem a nosičem.
V závislosti na použité strategii může odštěpování probíhat současně s odstraněním části nebo všech skupin ochranných vazeb na boku řetězce. V jiných procesech může být peptid nebo jeho fragment uvolněn s zachováním některých ochranných mechanismů, pokud jsou plánovány další chemické transformace.
Přesná chemie uvolňování závisí na vazbě a cílové molekule.
Podmínky, které účinně uvolňují jeden peptid, mohou chemicky poškodit chemicky citlivou skupinu v jiném.
Proto popisování deštrukce popisuje chemický účel a ne univerzální sadu činidel nebo podmínek vhodných pro všechny peptidy.
Stejně tak správné strukturování peptidu nedokazuje, že všechny ochranné skupiny byly následně účinně odstraněny.
Skládání řetězce a konečné odstraňování pojistek odpovídají různým chemickým požadavkům a vyžadují zvláštní posouzení.
Podmínky odstraňování mohou ovlivňovat profil znečištění
Odstraňování nechtěných chloupků nemusí být chemicky neutrálním krokem.
Odstranění ochranných skupin a oddělení peptidu od nosiče může vést k vzniku reaktivních chemických látek schopných modifikovat peptid nebo další složky směsi.
Proto mohou být v vypracovaných metodách použity takzvané scavengery, tedy sloučeniny zachycující určité nežádoucí reaktivní produkty a ovlivňující vznik vedlejších produktů.
V roce 2019 byl zkoumán různorodý výběr scavengery při odstraňování exenatidu z peptidové pryskyřice a prokázalo se, že jejich výběr ovlivňoval kvalitu surového produktu a sledovaný profil znečištění. [8]
Na tomto základě by se nemělo vytvářet univerzální receptura pro odstraňování škodlivých látek.
Zkoumání však ukazuje, že podmínky tohoto kroku mohou ovlivnit kvalitu produktu a proto by měly být hodnoceny pro konkrétní peptid a pro použité systém ochranných skupin.
Správný proces odstraňování je tedy v několika ohledech důležitý.
Peptid musí být vhodně oddělen, požadované ochranné skupiny musí být odstraněny, cílový materiál musí být získán zpět a nežádoucí chemické transformace musí být kontrolovány.
Obnova surového produktu není konečným čištěním
Po odstraňování separuje se materiál obsahující peptid od pevných pryskyřic a zbytečných částic reakční směsi.
V tomto případě lze využít rozdíly v rozpustnosti, viskozitě nebo jiných chemických vlastnostech.
Obnovení viditelného usazenin nebo frakce obsahující peptid však neprokazuje, že materiál se skládá pouze z zamýšleného produktu.
Na této úrovni se obvykle mluví o surovém peptidu.
Může obsahovat cílovou molekulu spolu s delečními sekvencemi, zkrácenými řetězci, chemicky modifikovanými peptidy, nedokonale uzavřenými strukturami, materiály pocházejícími z činidel a dalšími znečištěními.
Význam jednotlivých znečišťujících látek závisí na sekvenci, podmínkách syntézy a zamýšleném použití.
V jednom z výzkumů byl rozdíl chromatografický propojen se spektrometrií hmotností za účelem charakterizace surových produktů SPPS a přiřazení jednotlivých chromatografických piků konkrétním peptidům. [9]
To ukazuje, proč informace získané pomocí separativních a strukturálních metod vzájemně doplňují.
Kromatografie může prokázat přítomnost mnoha látek, zatímco hmotnostní spektrometrie může poskytnout další informace, které pomohou určit, co mohou být některé z nich.
Očista a potvrzení totožnosti odpovídají na různé otázky
Čištění má za cíl obohatit nebo izolovat cílovou částici mezi ostatními složkami.
Identifikace naopak odpovídá otázce, zda izolovaný materiál skutečně má očekávané chemické vlastnosti.
Tyto otázky se částečně doplňují, ale nejsou totéž.
Dobře rozdělený chromatografický pik automaticky neposkytuje úplný důkaz struktury molekuly.
Stejně tak samotné dosažení očekávané molekulární hmotnosti není plnou mírou čistoty ani strukturální správnosti.
Blízkými variantami sekvencí, stereoizomery nebo chemicky modifikovanými formami mohou být obtížně odlišitelné nebo rozlišitelné.
Metoda čištění by proto měla být hodnocena s ohledem na skutečnou směs vzniklou během dané syntézy a neměla by být považována za dostačující pouze proto, že fungovala u jiného peptidu.
Pokud konečná molekula také vyžaduje vytvoření disiarčných můstků, cyklizace nebo jinou transformaci po dokončení řetězcového složení, objevují se další analytické otázky týkající se správnosti vazeb, strukturalní jednotnosti a toho, zda skutečně byla získána zamýšlená zralá forma molekuly.
Výhody, omezení a zdroje znečištění
Proč je SPPS tak široce používána?
Jedním z nejvýznamnějších výhod SPPS je možnost udržení vznikajícího peptidu na nosiči během opakovaných výměn kapalných činidel.
To usnadňuje opakované chemické operace a umožňuje automatizaci.
Chemici mohou implementovat plánovanou sekvenci aminokyselinových stavebních bloků a pokud to chemie procesu umožňuje, také některé nekonvenční aminokyseliny a další modifikace.
Současné automatizační systémy ukazují, jak daleko lze tuto koncepci rozvinout.
V studii z roku 2020 týkající se automatizované syntézy proteinů byl popsán proces získávání řetězců proteinů obsahujících až 164 aminokyselinových restů. Po následném čištění a fázování bylo dosaženo funkčních materiálů. [10]
Je to působivý příklad technických možností.
Nicméně to neznamená, že každou sekvenci o délce 164 aminokyselin – ani žádný dlouhý peptid nebo protein – lze získat s takovou stejnou snadností.
To také neznamená, že čištění a struktura struktury se stávají zbytečnými.
Studie ukazuje spíše, jaké výsledky lze dosáhnout díky pečlivě vypracovanému systému pro vhodně zvolené molekuly.
Automatizace kontroluje provedení procesu.
Nicméně není schopen přeměnit nevhodnou chemii na vhodnou.
Proto je třeba celkově analyzovat výkonnost zařízení, sekvenci peptidu a samotnou molekulu.
Jak vznikají typické znečištění?
V rámci SPPS může existovat několik různých cest vedoucích k vzniku znečištění. Jejich porozumění pomáhá objasnit, proč jsou konečné analytické testy nadále nezbytné.
Deleční sekvence nebo zkrácený produkt mohou vzniknout v případě, že plánované připojení aminokyselin selže, nebo pokud bude růst řetězce přerušen. Jelikož nesprávný řetězec může nadále být připevněn k pektinu, pozdější odstraňování jej nemusí odstranit.
Epimerizace znamená změnu stereochemické konfigurace příslušného centra. To má analytický význam, protože epimer může mít stejnou nominální molekulovou hmotnost jako příslušný peptid, a zároveň se lišit svým prostorovým konfigurací.
Produkty obsahující aspartamid mohou vznikat v důsledku vedlejších reakcí závislých na sekvenci asparaginových restruktur. V závislosti na chemickém průběhu může vzniknout více než jeden typ takových produktů.
Neúplné odstranění ochranných skupin nastává tehdy, když skupina, která by měla být odstraněna, zůstává spojena s molekulou. Peptid tedy může mít nominálně očekávanou délku řetězce, ale stále má nesprávnou chemickou strukturu.
Modifikace spojené s odštěpením mohou nastat během konečného uvolňování peptidu nebo odstranění ochranných skupin. Správné vytvoření řetězce tedy nezaručuje, že peptid projde etapou odštěpení bez změn.
Neúplné reakce spojené s agregací mohou však nastat v situacích, kdy vznikající řetězce působí na sebe způsobem omezujícím přístup k reaktivním místům. Vstupování dostatečného množství činidla do reaktoru nezaručuje, že každé reaktivní místo je fyzicky dostupné a podléhá odpovídající reakci.
To jsou možné cesty vzniku znečištění.
To neznamená, že každá strana získaná metodou SPPS musí obsahovat všechny uvedené typy nesrovnalostí.
Jejich význam v konkrétní syntéze se stanovuje na základě znalostí o procesu, analytických studií a odpovídající kontroly kvality.
Přirozeně syntetizované peptidy vyžadují něco víc než jen reprodukci sekvence
Některé peptidy jsou strukturovně mnohem složitější, než by vyplývalo z samotné lineární sekvence aminokyselin.
Dobrým příkladem je epidermina.
Charakteristická struktura epidermis prokázala přítomnost mnoha prstenů obsahujících síru a neobvyklých zbytkových látek.[11]
Samotné reprodukce lineární řady aminokyselin by tedy nebylo dostatečným důkazem toho, že bylo získáno autentické zralé epidermon.
Toto rozlišení je důležité při interpretaci publikací nebo vyhledávání souvisejících s syntézou epiderminy v pevném stavu.
Publikace může popisovat lineární prekurzor, fragment, analog nebo jinou příbuznou strukturu, nikoli ověřenou úplnou syntézou kompletní dospělé molekuly.
Publikace Structural Analysis citovaná zde jako [11] popisuje vlastnosti samotné epidermis; není to zpráva o celkové syntéze pomocí metody SPPS.
Výrazy o úplné syntéze tedy je třeba hodnotit s ohledem na skutečnou cílovou strukturu molekuly a nikoli pouze na její lineární aminokyselinovou sekvenci.
Výkon, čistota a identita musí být prezentovány odděleně
Tři pojmy, které jsou často mylně považovány za jeden v diskusích o syntéze peptidů, jsou výkonnost, čistota a identita.
Velká hmotnost získaného produktu nemusí znamenat, že většina tohoto materiálu představuje zamýšlený peptid. Surový materiál může obsahovat značné množství znečištění.
Stejně tak vysoká čistota chromatografie automaticky nepotvrzuje všechny aspekty strukturalní identity.
I peptyd, jehož chemická struktura byla přesně charakterizována, tímto automaticky nezískává potvrzený biologický, terapeutický nebo klinický účinek.
Jde o samostatné otázky.
Spolehlivý popis syntézy by tedy měl uvádět, jaká byla cílová molekula, v jakém stádiu byla dosažena účinnost, zda zkoušený materiál byl surový nebo čištěný a jaké analytické údaje byly použity k potvrzení tvrzení o struktuře.
Tímto způsobem lze výsledky syntézy interpretovat a porovnávat spolehlivěji.
Jednotlivou procentní hodnotu nebo hmotnostní hodnotu nelze přeměnit na obecné tvrzení, že peptid je „vysoké kvality”, bez znalosti toho, co se skutečně měřilo.
Často kladené otázky
1. Proč v SPPS používá fázi stálou?
Stálá fáze udržuje vznikající peptid na nosiči, zatímco rozpustné činidla, vedlejší produkty reakce a přechytávací roztoky mohou být mnohokrát znovu aplikovány a odstraněny. To výrazně zjednodušuje opakované vytváření řetězce a umožňuje automatizaci syntézy peptidů, jako je tomu v současných metodách automatizované průtokové syntézy. [10] Nosič však nezaručuje, že každá reakce proběhne ideálně, ani neodstraní nesprávně sestavený řetězec spojený s živicí od správného. Jeho hlavní výhodou je zlepšení řízení procesu. Chemická selektivita, kompletnost reakce, čistota a struktura identity nadále vyžadují samostatnou analýzu.
2. Eliminuje syntéza v pevném stavu potřebu čištění?
Ne. Nesprávné peptidové řetězce mohou zůstat vázány na živici během syntézy a poté být uvolněny společně s cíleným produktem. Výzkumy analyzující surové produkty SPPS pomocí chromatografie a hmotnostní spektrometrie ukazují, že praní během syntézy a konečné čištění plní různé funkce. [9] Praní především odstraňuje rozpustné složky obklopující živici, zatímco čištění po odstraňování odděluje požadovaný peptid od nežádoucích peptidových a nepeptidových látek. SPPS zjednodušuje průběžné operace, ale nezaručuje konečnou čistotu.
3. Znamená „stálá fáze” to, že se rozpouštědlo nepoužívá?
Ne. V konvenční SPPS je nerozpustný nosič obvykle obklopený kapalnými činidly a rozpouštědly. Ty mají vliv na fyzikální prostředí pryskyřice, a to mimo jiné na stupeň jejího zkvašení a snadnost pronikání činidel do připojených řetězů. Experimentální studie prokázaly rozpuštědlové zkvašení pryskyřic a změny spojené s chemikáliemi vazby, stupně zkvašení a prodloužení řetězce. [2] Pryskyřice a rozpouštědlo tedy společně vytvářejí prostředí reakce.
4. V kterém směru roste peptid během SPPS?
Konvenční etapová SPPS obvykle vytváří peptid od jeho C-koncového konce směrem k N-konci. První aminokyselina, která má tvořit C-koncový konec připravené molekuly, je připojována k nosiči, a další zbytky prodlužují odkrytý koncový aminový řetězec. Publikované metody založené na Fmoc ukazují tento typický vzor. [1] Existují však specializované strategie využívající stálou fázi, které mohou probíhat jinak.
5. Platí pro pryskyřici a spojovací materiál totéž?
Ne. Pryskynec je nerozpustným nosičem, zatímco spojovací prostředek představuje chemické spojení mezi nosičem a rostoucím peptidem. Funkčnost spojovacího prostředku může nezávisle na samotném polymeru ovlivňovat připojení, zachování pryskynece a následné uvolňování peptidu. Výzkumy nosičů používaných při syntéze peptidů ukazují, proč samotné označení typu pryskynece nemusí stačit k popisu chování celého systému.[2]
6. Zvyšuje větší stupeň příměsí pryskyřice vždy výrobu?
Ne. Vyšší loading znamená větší počet potenciálních míst pro připojení na danou množství nosiče, ale nemusí vést k získání většího množství správně strukturovaného a regenerovatelného peptidu. Úroveň přilnutí může měnit lokální molekulární prostředí a experimentálně byl označován za jeden z faktorů ovlivňujících zpevnění živice. [2] Pokud jsou připojené řetězce příliš přitvrděny nebo silně vzájemně působí, dostupnost reaktivních míst může být snížena. Loading by proto měl být analyzován společně s vlastnostmi živice, zachováním sekvence, výkonností reakce a kvalitou konečného produktu.
7. Proč jsou aminokyseliny během syntézy peptidu zabezpečeny?
Ochranné skupiny dočasně znemožňují vybraným reaktivním skupinám účastnit se reakcí, zatímco dochází k vytvoření konkrétního vazebného bodu. To umožňuje kontrolovaný, postupný řetězcový syntetický proces. Avšak ochrana neodstraňuje všechny vedlejší reakce. Výzkumy na modelových systémech například ukázaly, že strategie ochranných skupin a okolní sekvence mohou ovlivňovat vznik aspartimidu. [5] Ochranné skupiny tedy zajišťují chemickou selektivitu, ale celá strategie zajištění a odstraňování vazeb stále vyžaduje pečlivé plánování a hodnocení.
8. Co znamená ortogonalní ochrana funkčních skupin?
Ortogonalita znamená možnost odstranění jedné ochranné skupiny za podmínek, které ponechávají ostatní nezbytné zabezpečení dostatečně nedotčené. To umožňuje odhalit určité reaktiva na plánovaných fázích syntézy. Uznávané metody SPPS se opírají o kontrolované odhalování a demontáž ochranných skupin namísto simultánního odhalování všech reaktivních skupin. [1] Skutečná shoda použitých zabezpečení však stále závisí na cílové molekule a podmínkách reakce.
9. Platí, že Fmoc a Boc označují různé typy peptidů?
Ne. Fmoc a Boc jsou ochranné skupiny a související syntetické strategie, nikoli různé typy peptidového skeletu. Rozdíly v chemickém odstranění těchto skupin ovlivňují způsob syntézy, ale dočasnou ochrannou chemii nelze zaměňovat s konečnou strukturou cílového peptidu. Publikované metody založené na Fmoc ukazují jeden z běžně používaných variant SPPS, ale to neznamená, že každý peptid musí být syntetizován touto metodou. [1]
10. Mohou již první fáze připojení způsobit znečištění?
Ano. Fáze připojování může ovlivnit stereochemickou kvalitu ještě před zahájením opakovaného prodlužování řetězce. Provedeny byly analytické metody určené speciálně k detekci racemizace během připojování zajištěných aminokyselin k živicím. [3] To však neznamená, že každé připojení způsobuje významnou racemizaci. Spíše to ukazuje, že samotné připojení je chemicky významným krokem, během kterého mohou nastat měřitelná změny, které je třeba zohlednit při celkovém hodnocení kvality.
11. Proč jsou některé sekvence peptidů označovány jako složité?
Některé rostoucí peptidy interagují mezi sebou nebo s sousedními peptidy způsobem omezujícím přístup k reaktivním místům. Voda, hydrofobní interakce a agregace mohou ztížit pozdější vazbu. Výzkum sekvencí citlivých na agregaci ukazuje, že změna způsobu agregace může ovlivnit složení surového produktu. [4] Obtíže syntézy tedy závisí na vlastnostech molekuly a podmínkách reakce, nikoli pouze na délce peptidu.
12. Má rychlejší syntéza vždy lepší produkt?
Ne. Rychlost syntézy a kvalita produktu jsou samostatnými parametry. Ohřev, mikrovlnné podávání podpory a automatizace mohou zkrátit dobu procesu, ale urychlení reakcí může také změnit rovnováhu mezi požadovanými a vedlejšími reakcemi. Výzkumy syntézy podporované mikrovlnou energií prokázaly závislost na druhu zbytku racemizinu a tvorbu aspartimidu, což naznačuje potřebu vhodné kontroly podmínek. [7] Krátší doba syntézy je prospěšná pouze tehdy, pokud získaný materiál splňuje také požadované chemické a analytické kritéria.
13. Má odstraňování odbarvení pouze za následek odstranění zrn pryskyřice?
Ne. Odstraňování je chemický proces vedoucí k roztržení navrženého spojení mezi peptidem a nosičem. Odstranění granulí pryskyřice pomocí filtrace je však fyzikální operací rozdělení a samo o sobě nepotvrzuje správný průběh chemického procesu odstraňování. Uvolňování peptidu může probíhat současně s odstraňováním ochranných skupin a dalšími reakcemi. Výzkumy scavengerů používaných během odstraňování ukazují, že tento krok může ovlivňovat profil znečištění. [8]
14. Má vysoká účinnost surového produktu v souvislosti s vysokou čistotou peptidu nějaký význam?
Ne. Účinnost tvrdé metody popisuje množství získaného materiálu před odstraněním všech nežádoucích látek. Tento materiál může obsahovat cílový peptid spolu s delečními sekvencemi, modifikovanými strukturami, zbývajícími ochrannými skupinami a dalšími znečišťujícími látkami. Výzkumy tvrdých směsí SPPS pomocí chromatografie a hmotnostní spektrometrie ukazují, proč požadovaná hmotnost, čistota a molekulární identita vyžadují zvláštní interpretaci. [9] Spolehlivě uvedená účinnost by tedy měla ukazovat na krok, v němž byla hmotnost měřena, a zda byl materiál již čištěn.
15. Dokáže SPPS poskytovat přístup k dlouhým peptidovým řetězům?
Ano. Přesně vypracované metody SPPS mohou umožňovat získávání velmi dlouhých řetězců. V rámci studií automatizované průtokové syntézy bylo získáváno řetězce obsahující až 164 restů, které byly následně před hodnocením funkční čistoty podrobeny čištění a fázování. [10] To ukazuje možnosti současné syntézy peptidů, ale neznamená, že každou sekvenci s podobnou délkou lze získat s stejnou účinností. Délka je pouze jedním z faktorů; význam mají také sekvenčně závislá agregace, vedlejší reakce, požadavky na fázování a obtížnost čištění.
16. Znamená vytvoření sekvence epiderminy její úplné syntézu?
Ne. Zralá epidermis obsahuje atypické strukturalní prvky, včetně prstenů obsahujících síru, které přesahují samotnou lineární řadu aminokyselin. To bylo prokázáno v strukturálních studiích. [11] Získání lineární sekvence, prekurzora nebo fragmentu tedy automaticky neznamená syntézu kompletní zralé molekuly. Pro tvrzení o syntéze kompletní molekuly jsou potřebné analytické údaje potvrzující reprodukci zamýšlených vazeb a dalších významných strukturalních prvků.
17. Dokazuje očekávaná molekulová hmotnost plnou správnost struktury?
Ne. Získání očekávané hmotnosti molekuly představuje cenné informace, ale sama hmotnost nepotvrzuje všechny aspekty struktury peptidu a nevylučuje všechny významné znečištění. Dvě molekuly mohou mít stejnou nominální hmotnost a zároveň se lišit stereochemie nebo určitým strukturálním uspořádáním. Výzkumy zahrnující rozdělení epimeryčních peptidů ukazují, proč mohou být rozdíly v stereochemii vyžadovat analytické metody schopné rozlišit struktury, které nelze odlišit pouze na základě hmotnostního měření. [12] Konečnou charakterizaci je tedy třeba navrhnout s přihlédnutím k realistickým znečišťujícím látkám a alternativním strukturám, které mohou vzniknout během konkrétní syntézy.
Souhrn
Syntéza peptidů v pevném stavu změnila chemickou strukturu peptidů a umožnila udržení rostoucího řetězce na nerozpustném nosiči během opakovaného vkládání, provádění reakcí a odstraňování rozpustných činidel. To usnadňuje postupný sestavování sekvencí a představuje praktickou základnu pro automatickou syntézu.
Zjevná jednoduchost této metody by však neměla skrývat chemikálie, které probíhají v každém kroku.
Kopolymer, lanko a stupeň polymerizace ovlivňují významné vlastnosti syntetického prostředí. V závislosti na rozpouštědle dochází k zesílení, které ovlivňuje dostupnost řetězců spojených s polymerem. Ochranné skupiny kontrolují, které funkční skupiny mohou reagovat, zatímco vazebné reakce vytvářejí strukturu peptidu z části na část. [1] [2]
Každý z těchto kroků má také své limity.
První připojení může ovlivnit stereochemickou kvalitu. [3] Obtížné sekvence mohou agregovat a omezovat dostupnost činidel. [4] Chemické postupy zajištění a odstraňování ochranných skupin mohou podporovat vedlejší reakce, jako je tvorba aspartimidu. [5] [6] Zrychlené podmínky syntézy mohou měnit stupeň racemizace nebo profil znečištění. [7] Podmínky odstraňování mohou navíc ovlivnit složení surového produktu. [8]
Proto správné sestavení řetězce neznamená získání čistého a správně identifikovaného peptidu.
Obnova surového produktu, čištění a strukturaální charakteristika zůstávají samostatnými fázemi. Kromatografie může poskytnout informace o složení směsi a čistotě, zatímco hmotnostní spektrometrie a další analytické metody poskytují informace o identitě. Žádný jediný analytický výsledek nemusí potvrzovat všechny aspekty struktury peptidu. [9] [12]
Moderní automatizovaná toková syntéza ukazuje, že za odpovídajících podmínek lze SPPS použít i u velmi dlouhých řetězců. [10] Současně strukturálně složité peptidy, jako je epidermina, ukazují, proč samotné replikace lineárního aminokyselinového řetězce nemusí být dostatečné, pokud zralá molekula obsahuje další kruhy, atypické zbytky nebo konkrétní strukturu vazeb. [11]
SPPS je nejlépe chápáno nikoli jako jediný proces, ale jako sérii samostatných chemických a analytických kroků.
Spojení určuje počáteční bod. Opakovací cykly zajištění, odpojování a spojování vytvářejí plánovaný řetězec. Odpojování uvolňuje produkt. Čištění odděluje cílovou částici od nežádoucích látek. Konečná charakteristika pak umožňuje určit, zda izolovaný materiál skutečně má danou strukturu a kvalitu.
Oddělení těchto etap umožňuje vyhnout se několika častým nedorozuměním: úspěšná syntéza automaticky nezaručuje čistotu, vysoká účinnost automaticky nezaručuje identitu a očekávaná molekulová hmotnost sama o sobě neprokazuje plnou strukturální správnost.
Odkazy
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Syntéza peptidů ve pevných fázích: Od standardních postupů k syntéze složitých sekvencí. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K. a Willway, H. (2020). Prozkoumání parametrů ovlivňujících zrážení pryskyřice v zelených rozpouštědlech. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Použití Marfeyova činidla k kvantifikaci racemizace při navázání aminokyselin na pevnou bázi pro syntézu peptidů. Analytická biochemie, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Hodnocení kombinovaného použití Oxymy a HATU při agregaci peptidových sekvencí. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Problém aspartimidu v SPPS založeném na Fmoc. Část I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Problém aspartimidu v SPPS založeném na Fmoc. Část II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Omezování racemizace a tvorby aspartimidu při mikrovlnné syntéze pektidů na pevných bázi s Fmoc. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzendimetanethiol (1,4-BDMT) jako prostředek k neutralizaci fragmentací zelenější peptidové pryskynečné hmoty. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). Charakterizace surových produktů z pektidu získaného syntézou pektidu v pektidu pomocí hmotnostní spektrometrie s mu-HPLC/rychlým atomovým bombardováním. Peptidová výzkumná skupina, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E. a Pentelute, B. L. (2020). Syntéza proteinů pomocí automatizované chemie plynů. Věda, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: sekvenování heterodetického tetracyklického 21-peptidového amidového antibiotika. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Studie racemizace při syntéze peptidů prostřednictvím separace chráněných epimerních peptidů pomocí reverzní fáze s vysokou výkonností kapalinové chromatografie. Mezinárodní časopis pro peptidové a proteinové výzkum, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x