La synthèse des peptides en phase solide, plus communément appelée SPPS (solid-phase peptide synthesis), est une méthode chimique de synthèse des peptides d'un acide aminé à l'autre, tandis que l'extrémité du chaîne formée reste chimiquement liée à un support insoluble.
Au lieu d’isoler le peptide issu de chaque réaction, les chimistes le laissent lié à la phase solide, introduisant et éliminant des réactifs liquides successifs ainsi que des solutions de lavage. Les cycles répétés permettent de révéler le groupe aminique réactif, d’attacher un nouvel acide aminé et d’éliminer les composants solubles qui ne sont plus nécessaires. Une fois la séquence d’aminoacides prévue formée, le peptide peut être détaché du support et soumis à une autre manipulation et analyse.
Cette organisation du processus est l'un des principaux motifs pour lesquels SPPS est devenue une méthode si importante en chimie peptidique. La phase solide simplifie l'exécution de nombreuses opérations chimiques répétitives et a permis l'automatisation de la synthèse.
La facilité de synthèse à phase solide n'implique toutefois pas une garantie chimique d'excellence.
L’incorporation du peptide en cours de synthèse dans le support ne garantit pas que chaque chaîne recevra toutes les aminosynthèses prévues. Elle ne signifie pas non plus que le produit libéré à la fin du processus sera chimiquement pur ou aura une structure correcte.
Le montage du fil, le découplage et le recyclage du produit, la purification, la vérification de l’identité et la caractérisation structurelle finale sont des parties distinctes de l’ensemble du processus.
Les publications méthodologiques actuelles montrent à la fois l’utilité de l’SPPS et la nécessité de modifier les méthodes standard dans le cas de séquences difficiles. Dans une des méthodes publiées utilisant la stratégie Fmoc, on décrit notamment une synthèse routinière, mais aussi une approche modifiée pour les séquences peptidiques sensibles à l’agrégation. [1]
Comprendre l’SPPS nécessite donc quelque chose de plus que de se souvenir des étapes chimiques suivantes. Il faut également savoir quel est l’objectif de chaque étape, ce qui peut aller mal pendant cette étape et quelles questions analytiques doivent encore être posées après sa fin.
Qu’est-ce que la synthèse des peptides en phase solide ?
Le peptide en cours de formation reste lié et les solutions changent
Dans la SPPS classique, le peptide est chimiquement lié à de petites particules insolubles, généralement appelées des particules de résine, grâce à un intermédiaire chimique approprié.
Les grains restent dans l'appareil réactionnel tandis que les autres liquides et solutions filtrants sont introduits et éliminés.
Cela simplifie considérablement la synthèse répétitive.
Dans la synthèse classique en phase stoechiométrique, l'isolation et le purification du peptide en croissance après chaque ajout d'un acide aminé peuvent être fastidieuses. Dans le SPPS, la chaîne formée reste liée à la phase non soluble. Grâce à cela, les excès solubles de réactifs et de nombreux produits secondaires peuvent être éliminés par lavage, tandis que le peptide lié à la résine reste en place.
Le terme „ phase stable ” peut toutefois entraîner des malentendus.
Cela ne signifie pas que la formation de liaisons peptidiques se produit sans l'intervention de liquide ou de solvant.
La résine est généralement entourée d’un milieu réactif liquide, et son interaction avec le solvant peut avoir une influence significative sur le déroulement de la synthèse. Les agents réactifs doivent toujours se déplacer dans ou autour du milieu polymérique et atteindre les sites réactifs du peptide en croissance.
L'adhésion du peptide à un support est généralement de nature covalente. Cela signifie que la molécule ainsi formée est liée au support par un lien chimique.
Le peptide n’est donc pas simplement enfermé entre des particules, capturé par un filtre ou déposé à l’état liquide sur la surface.
Cette liaison chimique est conçue de manière à ce que la chaîne formée reste liée lors des réactions et des étapes de lavage suivantes, et puisse ensuite être libérée dans des conditions appropriées.
La synthèse classique se déroule à partir de la fin C vers la fin N.
La stratégie classique linéaire de SPPS commence généralement par un acide aminé qui constituera son extrémité C dans le peptide prêt à être utilisé.
Le reste est connecté au support.
Après l'obtention de la bonne réactivité de la groupement aminique, un autre acide aminé protégé est ajouté et chimiquement lié au chaîne formée. Cette procédure se répète progressivement pour allonger le peptide vers le côté N-terminal.
Il vaut la peine de souligner cette voie, car elle diffère de la synthèse biologique des protéines par les ribosomes.
La synthèse ribosomale prolonge le polypeptide depuis le N-terminus vers le C-terminus. L'étape SPPS classique construit généralement la séquence dans le sens inverse.
La séquence d'acides aminés finale peut toutefois être identique. La façon dont elle est construite diffère.
Il est important de préciser le terme „ conventionnel ”, car la chimie des peptides comprend également des stratégies spécialisées utilisant des sites d’adhérence alternatifs, la formation de fragments, des réactions de ligations et d’autres solutions non standard.
La description de la voie allant du C au N-terminus s’applique donc à un processus SPPS typique, et non à toutes les méthodes de chimie peptidique utilisant la phase solide.
L'SPPS n'est qu'un des éléments de la production de peptides
La synthèse en phase solide n’est pas le seul moyen de produire des peptides.
Les peptides peuvent également être obtenus par synthèse chimique dans un milieu réactionnel, par des systèmes d'expression biologiques, par des transformations enzymatiques, par la liaison de fragments ou par une combinaison de différentes méthodes.
SPPS est particulièrement utile lorsque la synthèse séquentielle doit être contrôlée et que des blocs constructifs d'acides aminés sécurisés, modifiés ou spécialisés doivent être utilisés.
Même dans le cadre d'un projet concernant un peptide spécifique, il n'est pas toujours nécessaire d'utiliser la même méthode de bout en bout.
Des fragments spécifiques du peptide peuvent par exemple être synthétisés sur une résine, séparément purifiés puis combinés par une autre méthode chimique. D’autres molécules peuvent nécessiter une folding, un oxydation, une cyclisation ou des transformations structurelles supplémentaires dès lors que la séquence linéaire initiale est obtenue.
Le choix de la voie appropriée dépend donc de la molécule cible, de sa complexité structurelle ainsi que des exigences analytiques et qualitatives du projet.
On devrait considérer le processus comme une série de questions successives.
L’adhésion au support définit le point de départ et influe sur la chimie ultérieure de libération du produit. Toutefois, il reste à déterminer si cette adhérence s’est produite correctement et si l’intégrité stéréochimique a été préservée.
Le montage de la chaîne doit permettre l'adhésion des acides aminés dans l'ordre prévu. Cependant, il faut ensuite vérifier si tous les chaînes ont réagi correctement et si des séquences dépourvues d'aminoacides, des produits abrégés ou modifiés n'ont pas été formés.
Le déshadrage et l’élimination des groupes protecteurs doivent libérer le peptide et éliminer certains mécanismes de protection chimiques. Cependant, le simple déshadrage du produit ne révèle pas quelles autres substances se trouvent dans le matériau brut.
Le prétraitement consiste à séparer le matériau désiré des composants indésirables, mais même la fraction prétraitée nécessite encore une confirmation de l'identité et une évaluation de la qualité.
La caractérisation structurelle et analytique finale doit cependant répondre à la question de savoir si le matériau isolé présente les propriétés chimiques attendues pour le peptide cible et si les méthodes analytiques utilisées sont appropriées pour l'application prévue.
Il s’agit de phases conceptuelles et non d’une instruction de laboratoire. Les réactifs spécifiques, l’équipement et les conditions de réaction dépendent du peptide cible et nécessitent une méthode élaborée et validée.
Attachement à la résine et montage du fil
La résine, le liant et le degré de fusion remplissent des fonctions différentes
Lors des discussions concernant les SPPS, trois termes apparaissent souvent : la résine, le liant et le taux d'adhérence, c'est-à-dire le loading.
Elles décrivent des propriétés liées mais différentes.
La résine est un matériau insoluble qui constitue le support.
Le couplage assure une liaison chimique entre ce support et le peptide ou la première résiduelle d'un acide aminé. Sa chimie peut influer à la fois sur la façon dont le peptide s'attache et sur sa libération ultérieure.
Loading décrit quant à lui le nombre de points d'attache réactifs par rapport à la quantité de support.
Ces termes ne sont pas synonymes.
Deux résines peuvent avoir une apparence physique très similaire tout en présentant des groupes fonctionnels, des liaisons ou un degré d'additionnement différents. Ces différences peuvent influer sur l'accès aux sites réactifs lors de la formation de la chaîne, sur la réticulation de la résine et sur la forme chimique du peptide final après déshydrolyse.
Un autre élément important est le groupe prévu à la fin de la ligne C.
Des arrangements différents entre le support et le lien peuvent être choisis, par exemple de manière à obtenir un peptide terminé par une groupement carboxyle ou amidonique.
C’est une différence chimique importante.
Le changement de groupe terminal signifie un changement de la molécule elle-même, et non seulement un changement dans la manière dont elle est emballée ou décrite.
Le frottement affecte l’accès aux chaînes connectées
De nombreuses substances utilisées dans les SPPS absorbent le solvant et se gonflent au contact du milieu liquide approprié.
Cela modifie l'environnement polymérique et peut augmenter ou réduire l'espace que les agents de dissolution doivent parcourir pour atteindre les chaînes peptidiques liées à la matière plastique.
Le gonflement n’est donc pas uniquement une curiosité physique.
Il peut influer sur l'accessibilité des groupes réactifs lors de la synthèse.
Des études systématiques des supports à base de polystyrène et de PEG ont montré que des propriétés telles que le type de liaison et le degré d’adjonction de résine influençaient considérablement le gonflement dans les solvants plus écologiques étudiés. Il a également été constaté que le gonflement pouvait varier lors de l’élimination des groupes protecteurs et au fur et à mesure que le chaîne peptidique se prolongeait. [2]
Cela montre que les propriétés de la résine ne peuvent pas toujours être considérées comme étant constantes.
En pratique, cela dépend de la collaboration de la résine, du solvant, du connecteur, du peptide associé et de l’étape de synthèse actuelle.
Un bon renforcement ou un bon déroulement de la réaction pour une combinaison de résine, de solvant et de peptide ne signifie donc pas que toute autre combinaison se comportera de la même manière.
L'étape même de l'intégration nécessite également une inspection de qualité.
La première étape de l’adhésion peut sembler simple, car le chaînon peptidique ne vient que de se former.
Un défaut introduit à ce stade peut toutefois rester présent lors de toute la synthèse ultérieure.
Si la première résiduelle est insérée incorrectement ou si sa configuration stéréochimique change lors de ce processus, l'ajout correct des résiduelles suivantes n'est pas forcément nécessaire pour réparer le problème initial.
Dans une étude de 1992, une méthode analytique a été développée spécifiquement pour mesurer la racemisation qui se produit lors de l'adhésion des acides aminés protégés aux supports fixes. [3]
La signification de cette étude va au-delà de la méthode analytique utilisée elle-même.
Elle montre que la qualité stéréochimique peut nécessiter des contrôles avant même le début des cycles de rallongement répétés.
La quantité de matière initialement attachée au support nécessite également une interprétation appropriée.
Le taux nominal de polymérisation de la résine, le chargement mesuré empiriquement, la quantité de matière brute récupérée après déshydrogénation et la performance finale du peptide isolé et purifié sont des valeurs différentes.
Ils ne doivent pas être considérés comme des indicateurs alternatifs du succès de la synthèse.
Les chaînes plus longues peuvent devenir plus difficiles à trouver
Au fur et à mesure que le chaînon peptidique s'allonge, la molécule elle-même commence à influencer son environnement chimique.
Les chaînes voisines peuvent interagir entre elles par des liaisons hydrodynamiques, des interactions hydrophobes et d'autres forces interatomiques. Certaines séquences peuvent présenter une tendance particulièrement forte à ces interactions.
Cela peut limiter l'accès aux groupes réactifs.
Dans de telles situations, l'incorporation d'un nouvel acide aminé peut devenir plus difficile, même si une quantité apparemment suffisante d'agent de liaison est introduite dans le système.
Dans une étude portant sur des séquences difficiles à agréguer, différentes méthodes de séquençage ont été comparées et les produits bruts obtenus ont été analysés. Les résultats soutiennent l’idée que le processus devrait être adapté à la séquence spécifique, plutôt que d’admettre l’existence d’une seule stratégie de séquençage qui soit toujours optimale. [4]
Cela explique également pourquoi un simple augmentation du taux d’adhésion de la résine ou de la quantité d’agent réducteur ne résout pas automatiquement tous les problèmes.
Si le problème fondamental est un accès limité aux sites réactifs, la question de savoir si l’agent ajouté a bien atteint les sites concernés et si la réaction s’est effectuée efficacement sans formation d’une quantité indésirable de produits secondaires devient plus importante que celle-ci.
Protection, suppression des groupes de protection et association
Les groupes de protection contrôlent l'endroit où se produit la réaction
Les acides aminés contiennent des groupes chimiques capables de participer à diverses réactions.
Lors de la synthèse contrôlée du peptide, les chimistes souhaitent généralement que le groupe aminé en question réagisse avec un bloc spécifique contenant un groupe carboxyle, tandis que les autres sites potentiellement réactifs restent temporairement inactifs.
C’est précisément ce que les groupes de protection servent à faire.
Ils bloquent temporairement les points de réaction sélectionnés, permettant à un autre point de participer à la réaction prévue.
Dans la stratégie SPPS couramment utilisée, basée sur Fmoc, le groupe aminé final de la chaîne en croissance reste protégé entre les étapes successives d’addition. Lorsque le prochain acide aminé doit être ajouté, la protection provisoire est éliminée, révélant ainsi le groupe aminé.
Les chaînes latérales réactives peuvent comporter des groupes protecteurs distincts, conçus de manière à rester intacts lors des cycles de construction répétés du fil conducteur principal.
L’objectif est une sélection contrôlée.
Un bloc approprié contenant une groupement carboxyle devrait s’associer à un groupe aminé approprié, plutôt que de mener à une dérivation incontrôlée ou à d’autres réactions concurrentes.
L’orthogonalité permet de supprimer les protections de manière sélective.
La stratégie orthogonale des groupes de protection permet de supprimer une seule équipe de protection dans des conditions où les autres dispositifs de sécurité nécessaires restent suffisamment intacts.
Cela permet au chimiste de révéler de manière contrôlée différents sites réactifs à différents stades de la synthèse.
Les termes Fmoc et Boc sont bien connus en chimie peptidique, mais ils ne signifient pas différents types de liaisons peptidiques ni différentes structures finales du peptide.
Il s’agit de groupes protecteurs liés à différentes stratégies de synthèse et à différentes méthodes de leur élimination.
La voie chimique temporaire utilisée lors de la construction du peptide doit donc être distinguée de sa structure définitive.
Les mesures de sécurité ne garantissent pas non plus une protection totale contre toutes les réactions secondaires possibles.
Des études sur la formation de l'aspartimide montrent par exemple que la stratégie de protection, les restes aminés voisins et les conditions d'élimination des groupes protecteurs peuvent influer sur la formation de contaminants, même dans les méthodes SPPS bien connues [5] [6].
La stratégie des groupes de protection limite donc certaines réactions indésirables, mais elle n’élimine pas la nécessité de contrôler le processus ni la caractérisation analytique finale.
La phosphorylation crée une nouvelle liaison amidique au squelette peptidique.
La réaction d'adhérence conduit à la formation d'un nouvel lien amidique dans le schème peptidique.
Le bloc d'acides aminés contenant une groupement carboxyle est généralement activé chimiquement afin de pouvoir réagir efficacement avec le groupe aminé libre du peptide en croissance lié à la matière vivante.
Après l'étape de liaison, l'excès de matière soluble peut être éliminé par un lavage.
L'aminoacide nouvellement ajouté devient alors la dernière ressource du chaîne en croissance. Puis on peut révéler son groupe aminique et commencer un nouveau cycle de liaison.
Théoriquement, la répétition de cette séquence permet de contrôler l’ordre des acides aminés en contrôlant l’ordre d’introduction des blocs constructifs.
En pratique, toutefois, il existe une réserve très importante :
La réaction chimique prévue doit effectivement se dérouler correctement dans chaque cycle.
Si un lien n’est pas complet, une partie des chaînes peut ne pas recevoir le reste prévu.
Si elles restent liées à la résine et réagissent correctement lors du prochain cycle, des séquences délecionales peuvent se former, c'est-à-dire des molécules de peptide dépourvues d'un ou plusieurs acides aminés prévus.
D'autres chaînes peuvent rester raccourcies.
Le lavage élimine les agents solubles et les produits secondaires, mais ne élimine pas sélectivement tous les chaînes non correctement structurées qui restent encore covalement liées au support.
Des pertes minimes peuvent s’accumuler au fil de nombreux cycles.
Le caractère répétitif du SPPS conduit à un problème mathématique important.
Une petite imperfection d'un seul parcours peut sembler insignifiante, mais après de nombreuses répétitions, ses effets peuvent s'accumuler.
Examinons un exemple mathématique simple.
Si la synthèse du peptide nécessiterait 50 étapes de liaison, et que chacune d’elles aurait indépendamment une probabilité de succès de 99%, le taux théorique de molécules qui franchiraient avec succès toutes les 50 étapes serait d’environ 60,5%.
C’est seulement une illustration.
Elle suppose que toutes les étapes se déroulent de la même manière et indépendamment les unes des autres. Elle ne prend pas en compte les problèmes de retrait des groupes protecteurs, les réactions secondaires, les pertes lors de l’extraction et du nettoyage, l’agglomération ni de nombreux autres facteurs réels.
Il ne faut donc pas interpréter ce résultat comme une prévision de la performance réelle de la production.
Cet exemple montre simplement pourquoi même une très forte performance des étapes individuelles ne garantit pas un produit brut chimiquement simple après plusieurs dizaines de répétitions.
C’est pourquoi le suivi de la synthèse et le contrôle des contaminants sont importants tout au long du processus de synthèse du peptide, et non seulement après l’ajout de l’ultime acide aminé.
L’automatisation, le chauffage et d’autres solutions technologiques peuvent accélérer la synthèse, mais la vitesse du processus doit toujours être évaluée en parallèle avec la qualité du produit.
Une étude sur la SPPS assistée par des micro-ondes a analysé la ressemblance dépendante du type de la reste racémisation et la formation d'aspartimide, montrant pourquoi les conditions de réaction doivent toujours être adaptées aux propriétés de la séquence spécifique. [7]
Séparation et récupération du produit brut
Le décapage libère le produit du support
Après la construction de la séquence peptidique prévue, il faut généralement séparer chimiquement le peptide du support.
Cette étape est appelée cleavage, c’est-à-dire la déconnexion.
La déshydrolyse interrompt la liaison chimique intentionnellement conçue entre le peptide et le support.
Selon la stratégie utilisée, l’affétation peut se produire simultanément avec l’élimination de certaines ou de toutes les parties protectrices des chaînes latérales. Dans d’autres processus, le peptide ou un fragment de celui-ci peut être libéré tout en conservant certaines protections, si d’autres transformations chimiques sont prévues.
La chimie de libération correspondante dépend du ligand et de la molécule cible.
Les conditions qui libèrent efficacement un peptide peuvent endommager la partie chimiquement sensible d'un autre.
C’est pourquoi l’affélation décrit un objectif chimique, et non un ensemble universel d’agents réactifs ou de conditions appropriées pour tous les peptides.
De même, la structure correcte du squelette du peptide ne prouve pas que toutes les parties protectrices aient ensuite été efficacement éliminées.
Le montage du fil et l’élimination finale des protections répondent à différents besoins chimiques et nécessitent une évaluation séparée.
Les conditions de dégazage peuvent influer sur le profil des polluants
Le décapage n’a pas besoin d’être une étape chimiquement neutre.
La suppression des groupes protecteurs et le détachement du peptide du support peuvent entraîner la formation de formes chimiques réactives capables de modifier le peptide ou d'autres composants de la composition.
C’est pourquoi des techniques telles que les scavengers peuvent être utilisées dans les méthodes élaborées ; ces derniers captent les produits réactifs indésirables et influencent la formation des produits secondaires.
Une étude de 2019 a analysé différents scavengers lors du déshydrogénation de l’exenatide à partir de la résine peptidique et a montré que leur choix influençait la qualité du produit brut ainsi que le profil des contaminants observé [8].
Il ne faut pas fonder cette approche sur une recette universelle de désintoxication.
L’étude montre cependant que les conditions de cette étape peuvent influer sur la qualité du produit et doivent donc être évaluées pour chaque peptide et le système de groupements protecteurs utilisé.
Un processus de déshumidation correct comporte donc plusieurs dimensions.
Le peptide doit être correctement dégradé, les groupes protecteurs requis doivent être éliminés, le matériau cible doit être récupéré et les transformations chimiques indésirables doivent être contrôlées.
La récupération du produit brut n’est pas un processus de purification final
Après l'extraction, un processus est réalisé pour séparer le matériau contenant le peptide de la résine solide ainsi que les autres composants de la réaction.
On peut également exploiter les différences de solubilité, de volatilité ou d'autres propriétés chimiques.
Le rétablissement de la matière visible ou de la fraction contenant le peptide ne prouve cependant pas que le matériau soit constitué uniquement du produit désiré.
À ce stade, on parle généralement de peptide pur.
Il peut contenir la molécule cible ainsi que des séquences dérypétiques, des chaînes abrégées, des peptides chimiquement modifiés, des structures partiellement désoxygénées, des matières issues d’agents réactifs et d’autres contaminants.
La signification des différentes polluants dépend de la séquence, des conditions de synthèse et de l'utilisation prévue.
Dans une étude, le chromatogramme a été combiné avec la spectrométrie de masse afin de caractériser les produits SPPS crus et d’attribuer les différents points de chromatogramme aux peptides spécifiques [9].
Cela montre pourquoi les informations obtenues grâce aux méthodes séparatrices et structurelles se complètent mutuellement.
La chromatographie peut révéler l’existence de nombreux composants, tandis que la spectrométrie de masse peut fournir des informations supplémentaires permettant de déterminer ce qu’il peut s’agir de certains d’entre eux.
La vérification et l’authentification de l’identité répondent à différentes questions.
Le purification vise à enrichir ou à isoler la molécule cible parmi les autres composants.
L'identification répond plutôt à la question de savoir si le matériau isolé présente réellement les propriétés chimiques attendues.
Ces questions se recoupent en partie, mais elles ne sont pas identiques.
Un pic chromatographique bien réparti ne constitue pas automatiquement une preuve complète de la structure de la molécule.
De même, obtenir la masse moléculaire attendue ne constitue pas en soi une évaluation complète de la pureté ni de la validité structurelle.
Les variantes de séquence, les isomères stéréosomériques ou les formes modifiées chimiquement peuvent être difficiles à distinguer ou à séparer.
La méthode de purification doit donc être évaluée en fonction de la véritable composition issue de la synthèse en question, et ne doit pas être considérée comme suffisante uniquement parce qu'elle a fonctionné pour un autre peptide.
Si la molécule finale nécessite également la formation de ponts disarsiques, de cyclisations ou d’autres transformations après la fin de la polymérisation, de nouvelles questions analytiques se posent quant à la validité des liaisons, à l’homogénéité structurelle et au fait que l’on ait effectivement obtenu la forme mature souhaitée de la molécule.
Avantages, limitations et sources de polluants
Pourquoi la SPPS est-elle si largement utilisée ?
L’un des avantages les plus importants du SPPS est la possibilité de conserver le peptide généré sur le support lors d’une succession d’interchanges de réactifs liquides.
Cela simplifie les opérations chimiques répétitives et permet une automatisation.
Les chimistes peuvent introduire une séquence planifiée de blocs constructifs d'acides aminés, et, si la chimie du procédé le permet, certains acides aminés non standard et d'autres modifications.
Les systèmes automatisés modernes montrent à quel point cette conception peut être développée.
Dans une étude sur la synthèse de flux automatisée de 2020, on a décrit la production de chaînes de protéines contenant jusqu’à 164 résidus d’acides aminés. Après un prétraitement et un folding ultérieurs, des matériaux fonctionnels ont été obtenus. [10]
C’est un exemple impressionnant des possibilités techniques.
Cela ne signifie toutefois pas que toute séquence de 164 résidus — ni tout peptide ou protéine longue — puisse être obtenue avec la même facilité.
Cela ne signifie pas non plus que le nettoyage et la caractérisation structurelle deviennent inutiles.
L’étude montre plutôt quels résultats peuvent être obtenus grâce à un système élaboré avec soin pour des molécules bien choisies.
L’automatisation contrôle la réalisation du processus.
Il n’est toutefois pas capable de transformer une chimie inappropriée en une chimie appropriée.
C’est pourquoi la performance de l’appareil, la séquence du peptide et la structure de la molécule elle-même doivent être analysées ensemble.
Comment se forment les polluants typiques ?
Lors de l'SPPS, plusieurs voies différentes peuvent conduire à la formation de polluants. Leur compréhension aide à expliquer pourquoi les analyses finales restent nécessaires.
Une séquence délaçante ou un produit abrégé peut se produire lorsque l'association prévue d'un acide aminé échoue ou lorsque la croissance du brin est interrompue. Comme le brin défectueux peut rester attaché à la résine, un lavage ultérieur n'est pas nécessaire pour le retirer.
L'épimérisation signifie une modification de la configuration stéréochimique du centre correspondant. Cette modification est d'une importance analytique particulière, car un épimère peut avoir la même masse moléculaire nominale que le peptide homologue, tout en présentant une configuration spatiale différente.
Les produits liés à l’aspartame peuvent être produits par des réactions secondaires dépendantes de la séquence des résidus d’aspartate. Selon le déroulement chimique, plus d’un type de produit peut être produit.
L’élimination incomplète des groupes protecteurs se produit lorsque le groupe qui doit être éliminé reste lié à la molécule. Le peptide peut donc avoir la longueur de chaîne nominalement attendue, mais il possède toujours une structure chimique incorrecte.
Les modifications liées à la déshéprésion peuvent se produire lors de la libération finale du peptide ou lors de l’élimination des groupes protecteurs. La bonne structure du peptide ne garantit donc pas qu’il passe par cette étape sans modification.
Les réactions incomplètes liées à l’agrégation peuvent toutefois se produire lorsque les chaînes formées interagissent entre elles de manière à limiter l’accès aux sites réactifs. L’introduction d’une quantité suffisante d’agent réactif dans le réactif ne garantit pas que chaque site réactif soit physiquement accessible et susceptible de réagir correctement.
Il s’agit de voies possibles de formation des polluants.
Cela ne signifie pas que chaque partie reçue par le biais de la SPPS doit contenir tous les types d’incohérences mentionnés ci-dessus.
La signification de ces éléments dans une synthèse particulière est déterminée sur la base des connaissances du processus, des analyses analytiques et d’une bonne qualité de contrôle.
Les peptides naturels composés nécessitent quelque chose de plus que la reproduction d'une séquence.
Certains peptides sont structuriquement beaucoup plus complexes que ce qui découlerait de la séquence linéaire des acides aminés elle-même.
Un bon exemple est l'épidermine.
La structure structurale de l'épiderme a révélé la présence de nombreux anneaux contenant de l'ammoniac ainsi que d'inconnus restes [11].
Le simple reconstitution de la séquence linéaire des acides aminés ne serait donc pas une preuve suffisante que l'épidermine mature authentique a été obtenue.
Cette distinction est importante lors de l’interprétation des publications ou des recherches concernant la synthèse de l’épiderme à phase fixe.
La publication peut décrire un précurseur linéaire, un fragment, un analogue ou une autre structure proche, et non une synthèse complète vérifiée de la molécule mature complète.
La publication structurelle citée ici sous la référence [11] décrit la physiopathologie de l’épidermide elle-même ; elle n’est pas un rapport sur sa synthèse totale par la méthode SPPS.
Les affirmations concernant la synthèse totale doivent donc être évaluées en fonction de la structure finale réelle de la molécule, et non seulement de sa séquence linéaire d'acides aminés.
La performance, la pureté et l’identité doivent être présentées séparément.
Trois concepts souvent confondus dans les discussions sur la synthèse des peptides sont la performance, la pureté et l'identité.
La grande masse de produit récupéré ne signifie pas nécessairement que la plupart de ce matériau est du peptide destiné. Le matériau brut peut contenir de fortes quantités de contaminants.
Une pureté chromatographique aussi élevée ne confirme pas automatiquement tous les aspects de l’identité structurelle.
Même un peptide dont la structure chimique a été précisément caractérisée ne signifie pas automatiquement qu'il présente une application biologique, thérapeutique ou clinique confirmée.
Ce sont des questions distinctes.
Un descriptif fiable de la synthèse devrait donc indiquer quelle était la molécule cible, à quel stade la performance a été mesurée, si le matériau analysé était brut ou purifié, et quels données analytiques ont été utilisées pour confirmer les conclusions concernant la structure.
Grâce à cela, les résultats de la synthèse peuvent être interprétés et comparés de manière plus fiable.
Une valeur en pourcentage ou une valeur en masse ne doit pas être transformée en une déclaration générale selon laquelle un peptide est „ de haute qualité ”, sans connaître ce qui a réellement été mesuré.
Questions fréquemment posées
1. Pourquoi la phase constante est-elle utilisée dans SPPS ?
La phase solide maintient le peptide en suspension sur le support, tandis que les réactifs solubles, les produits secondaires de la réaction et les solutions de lavage peuvent être réintroduits et éliminés à plusieurs reprises. Cela simplifie considérablement le dépôt répétitif de la chaîne et permet l’automatisation de la synthèse des peptides, comme le montrent les méthodes modernes de synthèse automatisée par flux. [10] Toutefois, le support ne garantit pas que chaque réaction se déroule parfaitement, ni ne sépare correctement un chaîne mal formée liée à la résine de celle qui l’est. Son principal avantage est d’améliorer la conduite du processus. La sélectivité chimique, la complétude de la réaction, la pureté et l’identité structurelle nécessitent encore une évaluation distincte.
2. L’étape de synthèse en phase solide élimine-t-elle la nécessité de purification ?
Non. Des chaînes peptidiques anormales peuvent rester attachées à la résine lors de la synthèse, puis être libérées avec le produit final. Des études analysant les produits SPPS crus par chromatographie et spectrométrie de masse montrent que le lavage lors de la synthèse et le nettoyage final remplissent des fonctions différentes. [9] Le lavage élimine principalement les composants solubles entourant la résine, tandis que le nettoyage après séparation vise à séparer le peptide souhaité des composants peptidiques et non peptidiques indésirables. Les SPPS simplifient les opérations intermédiaires mais ne garantissent pas une pureté finale.
3. La „ phase solide ” signifie-t-elle que le solvant n’est pas utilisé ?
Non. Dans une SPPS conventionnelle, un support insoluble est généralement entouré d’agents solvants et de solvants. Les solvants influencent l’environnement physique de la résine, notamment le degré de gonflement de celle-ci et la facilité avec laquelle les solvants peuvent atteindre les chaînes adjacentes. Les études expérimentales ont montré que le gonflement de la résine dépend du solvant, ainsi que des modifications liées à la chimie du lien, au degré de polymérisation et à l’allongement de la chaîne. [2] La résine et le solvant constituent donc ensemble un milieu réactionnel.
4. Dans quel sens croît le peptide lors de l’SPPS ?
La SPPS classique construit généralement le peptide à partir de sa partie C-terminale vers le N-terminus. Le premier acide aminé qui doit constituer le C-terminus de la molécule finale est lié au support, tandis que les autres réserves allongent le bout aminé de la chaîne. Les méthodes publiées basées sur Fmoc montrent ce schéma typique. [1] Cependant, il existe des stratégies spécialisées utilisant une phase solide qui peuvent se dérouler différemment.
5. Est-ce que la résine et le connecteur signifient la même chose ?
Non. La résine est un support insoluble, tandis que le connecteur est une liaison chimique entre le support et le peptide en croissance. La fonctionnalité du connecteur peut, indépendamment du polymère lui-même, influer sur l’adhérence, le maintien de la résine et le libération ultérieure du peptide. Les études sur les supports utilisés dans la synthèse des peptides montrent pourquoi l’identification de la nature de la résine peut ne pas suffire à décrire le comportement de l’ensemble du système. [2]
6. L’augmentation du taux d’adsorption de la résine augmente-t-elle toujours la production ?
Non. Une charge plus élevée signifie un plus grand nombre de sites d’adhérence possibles par unité de charge supportable, mais cela ne doit pas nécessairement conduire à une plus grande quantité de peptide correctement structuré et réversible. Le taux d’adsorption peut modifier l’environnement moléculaire local et a été expérimenté comme un facteur qui contribue à la fragilisation de la résine. [2] Si les chaînes adjacentes sont trop compactes ou fortement liées entre elles, la disponibilité des sites réactifs peut être réduite. Il convient donc d’analyser la charge en combinaison avec les propriétés de la résine, la séquence, la performance de la réaction et la qualité du produit final.
7. Pourquoi les acides aminés sont-ils protégés lors de la synthèse du peptide ?
Les groupes protecteurs empêchent temporairement les groupes réactifs sélectionnés de participer aux réactions pendant que se forme un lien spécifique. Cela permet une formation contrôlée et graduelle de la chaîne. Toutefois, la protection n’élimine pas toutes les réactions secondaires. Des études sur des systèmes modèles ont montré, par exemple, que la stratégie des groupes protecteurs ainsi que la séquence environnante peuvent influer sur la formation d’aspartimide. [5] Les groupes protecteurs assurent donc une sélection chimique, mais toute la stratégie de protection et de déprotection nécessite toujours une planification minutieuse et une évaluation rigoureuse.
8. Qu’est-ce que la protection orthogonale des groupes fonctionnels ?
L’orthogonalité signifie la possibilité d’éliminer une seule groupement protecteur dans des conditions qui laissent les autres protections nécessaires suffisamment intactes. Cela permet de révéler des sites réactifs spécifiques à des étapes de synthèse planifiées. Les méthodes SPPS établies reposent sur un contrôle régulier de la protection et du déprotection, plutôt que de révéler simultanément toutes les groupements protecteurs. [1] Cependant, la conformité réelle des protections appliquées dépend toujours de la molécule cible et des conditions de réaction.
9. Les mots Fmoc et Boc signifient-ils différents types de peptides ?
Non. Fmoc et Boc sont des groupes protecteurs et des stratégies synthétiques associées à ces derniers, et non des types différents de structure peptidique. Les différences dans la chimie de leur élimination affectent la façon dont la synthèse se déroule, mais la chimie protectrice temporaire ne doit pas être confondue avec la structure finale du peptide cible. Les méthodes publiées basées sur Fmoc montrent l’un des variantes les plus couramment utilisées de SPPS, mais cela ne signifie pas que chaque peptide doit être obtenu par cette méthode. [1]
10. Peut-on déjà prévoir une pollution lors de la première phase de l’intégration ?
Oui. L’étape d’addition peut influer sur la qualité stéréochimique avant même le début de l’allongement multiple du chaînon. Des méthodes analytiques ont été développées spécifiquement pour détecter la racemisation lors de l’addition d’aminoacides protégés aux résines. [3] Cela ne signifie pas que chaque addition provoque une racemisation importante. Cela montre cependant que l’addition elle-même est une étape chimiquement significative, au cours de laquelle des changements mesurables peuvent se produire, ce qui nécessite une prise en compte dans l’évaluation globale de la qualité.
11. Pourquoi certaines séquences peptidiques sont-elles qualifiées de difficiles ?
Certaines chaînes peptidiques en croissance interagissent entre elles ou avec des chaînes voisines de manière à limiter l’accès aux sites réactifs. Les liaisons hydrodynamiques, les interactions hydrophobes et les comportements rappelant l’agrégation peuvent rendre plus difficile la liaison ultérieure. Les études des séquences sensibles à l’agrégation montrent que le mode de liaison peut influer sur la composition du produit fini. [4] La difficulté de la synthèse dépend donc des propriétés de la molécule et des conditions de réaction, et non seulement de la longueur du peptide.
12. L’augmentation de la synthèse signifie-t-elle toujours un produit de meilleure qualité ?
Non. La vitesse de synthèse et la qualité du produit sont des paramètres distincts. Le chauffage, l’aide par micro-ondes et l’automatisation peuvent raccourcir le temps de processus, mais l’accélération des réactions peut également modifier l’équilibre entre les réactions souhaitées et les réactions secondaires. Les études de synthèse assistée par micro-ondes ont montré une dépendance de la fraction résiduelle sur la réaction et la formation d’aspartimide, ce qui indique la nécessité d’une bonne maîtrise des conditions. [7] Un temps de synthèse plus court est avantageux uniquement si le matériau obtenu répond également aux critères chimiques et analytiques requis.
13. La décapage signifie-t-il simplement l’élimination des grains de résine ?
Non. Le décollement est un processus chimique qui conduit à la rupture du lien entre le peptide et le support. L’élimination des particules de résine par filtration est en revanche une opération physique de séparation et elle ne prouve pas en soi le bon déroulement de la chimie du décollement. L’allégation d’un décollement peut se produire simultanément avec l’élimination des groupes protecteurs et d’autres réactions. Les études des décolleurs utilisés lors du décollement montrent que cette étape peut influer sur le profil des polluants. [8]
14. La haute performance du produit brut signifie-t-elle une haute pureté du peptide ?
Non. La performance brute décrit la quantité de matière récupérée avant de supprimer tous les composants indésirables. Cette matière peut contenir le peptide cible ainsi que les séquences déliées, les structures modifiées, les groupes protecteurs restants et d'autres contaminants. Les études des mélanges SPPS bruts utilisant la chromatographie et la spectrométrie de masse montrent pourquoi la masse récupérée, la pureté et l'identité moléculaire nécessitent une interprétation distincte. [9] Une performance représentative doit donc indiquer l'étape à laquelle elle a été mesurée et si le matériau a déjà été purifié.
15. SPPS permet-il d’obtenir des chaînes peptidiques longues ?
Oui. Les méthodes SPPS soigneusement élaborées peuvent permettre d’obtenir des chaînes très longues. Dans les recherches sur la synthèse automatique en flux, des chaînes contenant jusqu’à 164 résidus ont été obtenues, qui ont ensuite été traitées pour leur purification et leur fonctionnalisation avant leur évaluation fonctionnelle. [10] Cela montre les possibilités de la synthèse peptidique moderne, mais cela ne signifie pas que toute séquence d’une longueur similaire puisse être obtenue avec la même efficacité. La longueur est seulement un facteur ; l’agrégation dépendante de la séquence, les réactions secondaires, les exigences de fonctionnalisation et la difficulté de purification sont également importantes.
16. La construction d’une séquence d’épidermine signifie-t-elle la synthèse complète de cette dernière ?
Non. L’épiderme mature contient des éléments structurels atypiques, notamment des anneaux contenant de l’ammoniac qui dépassent la simple séquence linéaire des acides aminés. Cela a été démontré dans des études structurantes. [11] La réalisation d’une séquence linéaire, d’un précurseur ou d’un fragment ne signifie donc pas automatiquement la synthèse d’une molécule mature complète. La prétention d’une synthèse complète nécessite des données analytiques confirmant la reconstitution des liaisons prévues et d’autres éléments structurels importants.
17. La masse moléculaire attendue confirme-t-elle la structure complète et correcte ?
Non. L’obtention de la masse moléculaire attendue constitue une information précieuse, mais la masse elle-même ne confirme pas tous les aspects de la structure du peptide et n’exclut pas toutes les impuretés importantes. Deux molécules peuvent avoir la même masse nominale et présenter simultanément une structure stéréochimique différente ou un certain arrangement structurel. Les études portant sur la séparation des peptides épimériques montrent pourquoi les différences stéréochimiques peuvent nécessiter des méthodes analytiques capables de distinguer des structures qui ne peuvent pas être différenciées uniquement par la mesure de la masse. [12] La caractérisation finale doit donc être conçue en tenant compte des impuretés réalistes et des structures alternatives qui peuvent se produire lors d’une synthèse spécifique.
Résumé
La synthèse des peptides à phase solide a modifié la chimie des peptides, permettant de maintenir la chaîne en croissance sur un support insoluble lors de plusieurs applications, de réactions et de retrait des agents solubles. Cela facilite la construction séquentielle des séquences et constitue une base pratique pour la synthèse automatique.
La simplicité apparente de cette méthode ne doit cependant pas masquer la chimie qui se déroule à chaque étape.
La résine, le liguant et le degré d’additionnalité influencent les propriétés environnementales de la synthèse. Le gonflement dépendant du solvant affecte l’accès aux chaînes liées à la résine. Les groupes protecteurs contrôlent les groupes fonctionnels susceptibles de réagir, tandis que les réactions d’adhésion construisent le squelette peptidique de la ressemblance. [1] [2]
Chacun de ces étapes présente également ses limites.
L'adhérence initiale peut influer sur la qualité stéréochimique. [3] Les séquences difficiles peuvent aggraver et limiter l'accès aux réactifs. [4] La chimie de la fixation et de la suppression des groupes protecteurs peut favoriser les réactions secondaires, telles que la formation d'aspartimide. [5] [6] Les conditions de synthèse accélérées peuvent modifier le taux de racemisation ou le profil des impuretés. [7] Les conditions de déshydrogénation peuvent également influer sur la composition du produit brut. [8]
C’est pourquoi une construction correcte de la chaîne n’est pas synonyme d’obtention d’un peptide pur et correctement identifié.
Le retrait du produit brut, la purification et la caractérisation structurelle restent des étapes distinctes. La chromatographie peut fournir des informations sur la composition de la mixture et la pureté, tandis que la spectrométrie de masse et d'autres méthodes analytiques fournissent des informations sur l'identité. Aucun seul résultat analytique ne doit confirmer tous les aspects de la structure du peptide. [9] [12]
La synthèse procédurale automatisée moderne montre que, dans des conditions bien définies, les SPPS peuvent être appliquées même à des chaînes très longues. [10] En même temps, les peptides structuriquement complexes, tels que l’épidermine, montrent pourquoi la reconstitution de la séquence linéaire d’acides aminés peut ne suffire pas si la molécule mature contient des anneaux supplémentaires, des restes atypiques ou un certain arrangement de liaisons. [11]
Il est préférable de considérer l’SPPS non comme une seule réaction, mais comme une séquence de phases chimiques et analytiques distinctes.
L'attachement constitue le point de départ. Les cycles répétés de sécurisation, de déverrouillage et de connexion construisent un lien planifié. Le déverrouillage libère le produit. Le nettoyage élimine les éléments indésirables. La caractérisation finale permet ensuite de déterminer si le matériau isolé présente effectivement la structure et la qualité attribuées.
La séparation de ces étapes permet d’éviter plusieurs erreurs courantes : une synthèse réussie ne confirme pas automatiquement la pureté, une haute performance ne confirme pas automatiquement l’identité, et la masse moléculaire attendue ne prouve pas en soi la pleine validité de la structure.
Références
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