Синтезата на пептиди в стационарна фаза, най-често описвана като SPPS (solid-phase peptide synthesis), е химична методология за изграждане на пептиди от аминокиселина в аминокиселина, докато единият край на образуващия се верига остава химически свързан с неразтворимото носител.
Вместо да изолират образувания пептид след всяка реакция, химиците го оставят свързан с постоянен слой, като въвеждат и отстраняват последователно течни реагенти и разтворители. Повторните цикли позволяват разкриването на реактивна аминогрупа, свързването на следващия аминокиселинен компонент и отстраняването на разтворимите компоненти, които вече не са необходими. След завършване на планираната последователност на аминокиселинните връзки пептидът може да бъде отстранен от носителя и след това подложен на допълнителна обработка и анализ.
Тази организация на процеса е една от основните причини, поради които SPPS се превърна в толкова важен метод в химията на пептидите. Стабилната фаза опростява извършването на много повтарящи се химични реакции и направи възможно автоматизацията на синтеза.
Удобството на синтеза в стайната фаза обаче не означава гаранция за химическа перфектност.
Присъединяването на възникващия пептид към носителя не гарантира, че всеки верижен фрагмент ще получи всички планирани аминокиселини. Също така не означава, че материалът, освободен в края на процеса, ще бъде химически чист или ще има правилна структура.
Сглобяването на веригата, отделянето и възстановяването на продукта, почистването, потвърждаването на идентичността и крайната структурна характеристика са отделни части от целия процес.
Съвременните методологични публикации показват както полезността на SPPS, така и необходимостта от модификация на стандартните методи при трудни последователности. В една от публикуваните методи, използващи Fmoc стратегията, например е описана рутинна синтеза, но също така е описан и модифициран подход към пептидни последователности, податливи на агрегация. [1]
Разбирането на SPPS изисква нещо повече от запомнянето на следващите химични стъпки. Необходимо е също така да се знае каква е целта на всеки етап, какво може да се обърка по време на него и какви аналитични въпроси трябва да бъдат отговорили след неговото завършване.
Какво представлява синтезата на пептиди на стайната фаза?
Нарастващият пептид остава свързан, а разтворимите вещества се променят
В конвенционалната СПСПС пептидът е химично свързан с малки неразтворими частици, които обикновено се наричат зърна на целулозата, чрез подходящ химичен свързващ агент.
Зърната остават в реактивната система, докато следващите течни реагенти и разтвори се вливат и отстраняват.
Това значително опростява повтарящата се синтеза.
При класическата, етапна синтеза в разтвор изолирането и филтрирането на растящия пептид след всяко добавяне на аминокиселина може да бъде затруднено. В SPPS образуваният верижен фрагмент остава свързан с неразтворимата фаза. Благодарение на това разтворимите излишъци от реагенти и многото странични продукти могат да бъдат отстранени чрез промиване, докато свързаният с полимер пептид остава на мястото си.
Терминът „статусна фаза” обаче може да доведе до недоразумения.
Това не означава, че образуването на пептидни връзки става без участието на течност или разтворител.
Графитът обикновено е заобиколен от течен реактивен слой и неговото взаимодействие с разтворителя може значително да повлияе на хода на синтеза. Реактивните вещества все още трябва да се движат в полимерния слой или около него и да достигат до активните места на растящия пептид.
Присъединяването на пептида към носителя обикновено е ковалентно. Това означава, че образуващата се молекула е свързана с носителя чрез свързващ елемент посредством химично свързване.
Пептидът не е следователно просто увит между частици, задържан от филтър или свободно увит върху повърхността.
Такова химично свързване е целенасочено проектирано така, че образуваният верижен съединител да остане свързан по време на следващите реакции и етапите на промиване, а по-късно да може да бъде отворен при подходящи условия.
Конвенционалната синтеза протича от C-края към N-края.
Класическата линейна стратегия на SPPS обикновено започва с аминокиселина, която в готовия пептид ще представлява нейната C-приставка.
Останалата част се свързва с носителя.
След откритото на съответната реактивна аминогрупа се въвежда следващ защитен аминокиселин и той химически се свързва с образуващия се верига. Повторното провеждане на този процес постепенно удължава пептида към N-края.
Заслужава да се подчертае този път, тъй като той се различава от биологичното синтезиране на протеини чрез рибосомите.
Синтезата на рибозомните части продължава полипептида от N-края към C-края. Конвенционалната последователна SPPS обикновено създава последователност в обратната посока.
Крайната последователност на аминокиселините обаче може да бъде идентична. Различава се начинът, по който тя се съставя.
Важно е тук определението „конвенционален”, тъй като химията на пептидите включва и специализирани стратегии, използващи алтернативни места за свързване, сливане на фрагменти, реакции на лигиране и други нестандартни решения.
Описанието на процеса от C до N-конца се отнася към типичния стъпалообразен процес на SPPS, а не към всички възможни методи на пептидната химия, използващи стайна фаза.
SPPS е само един от елементите на производството на пептиди
Синтезата в стационарна фаза не е единственият начин за получаване на пептиди.
Пептидите също могат да бъдат получени чрез химична синтеза в разтвор, биологични експресионни системи, ензимни реакции, свързване на фрагменти или комбинация от различни методи.
SPPS е особено полезна, когато е необходимо контролирано нанасяне на последователности и използване на защитени, модифицирани или по друг начин специализирани аминокиселинни строителни блокове.
Дори в рамките на един проект, който се отнася до конкретен пептид, не винаги е необходимо да се използва същата методология от началото до края.
Отделни фрагменти на пептида например могат да бъдат синтезирани върху смола, отделно почистени и след това свързани с друга химична методология. Други молекули може да се нуждаят от флдация, окисляване, циклолизация или допълнителни структурни преобразувания още след получаването на първоначалната линейна последователност.
Изборът на подходящия път зависи следователно от целевата молекула, нейната структурна сложност и аналитичните и качествени изисквания на проекта.
Процеса си струва да се разглежда като поредица от следващи въпроси.
Присъединяването към носителя определя началния момент и влияе върху по-късната химична структура на освобождаването на продукта. Все пак все още трябва да се определи дали присъединяването е станало правилно и дали е запазена стереохимичната цялостност.
Сглобяването на веригата има за цел да доведе до свързването на аминокиселините в планираната последователност. След това обаче трябва да се провери дали всички вериги реагират правилно и дали не са възникнали последователности с липсващи аминокиселини, съкратени или модифицирани продукти.
Отстраняването и отстраняването на защитните групи имат за цел да освободят пептида и да премахнат определени химични защитни елементи. Самото ефективно освобождаване на продукта обаче не казва кои други вещества се намират в суровия материал.
Процесът на филтрация служи за отделяне на желаното вещество от нежеланите съставки, но дори филтрираната фракция все още се нуждае от потвърждаване на идентичността и оценка на качеството.
Крайният структурен и аналитичен анализ обаче трябва да отговори на въпроса дали изолираният материал има химичните свойства, очаквани за целевия пептид, и дали използваните аналитични методи са подходящи за предвиденото приложение.
Тези стъпки са концептуални, а не лабораторна инструкция. Конкретните реагенти, апаратурата и условията на реакцията зависят от целевия пептид и изискват подходящо разработена и валидирана методология.
Привързване към смолата и сглобяване на веригата
Силиконът, свързващият агент и степента на свързване изпълняват различни функции
В дискусиите относно SPPS често се срещат три термина: смола, свързващ агент и степен на свързване, т.е. loading.
Те описват свързани помежду си, но различни свойства.
Жаждата е неразтворим материал, който служи като носител.
Свързващият протеин осигурява химично свързване между този носител и пептида или първата аминокиселинна останка. Неговата химия може да повлияе както на начина на свързване на пептида, така и на последващото му освобождаване.
Loading описва броя активни места за свързване спрямо количеството носител.
Тези понятия не са синоними.
Двете смоли могат да изглеждат физически много сходно, но в същото време да имат различни функционални групи, свързващи вещества или степен на свързване. Тези разлики могат да повлияят на наличието на реактивни места при свързване на веригата, на уплътняването на смолата и на химичната форма на крайния пептид след отделяне.
Друг важен елемент е планираната група на C-края.
Различни системи носител–реактор могат да бъдат подбрани например така, че да се получи пептид, завършен с карбоксилна или амидна група.
Това е важна химична разлика.
Промяната на терминалната група означава промяна в самата молекула, а не само в начина, по който тя е опакована или описана.
Сгъстяването влияе върху достъпа до свързаните вериги
Много от съединенията, използвани в SPPS, абсорбират разтворителя и се издигат във въздуха при контакт с подходящата течна среда.
Това променя полимерната среда и може да увеличи или намали пространството, през което разтворените реагенти трябва да се движат, за да достигнат до веригите от пептидни връзки, свързани с полимера.
Подуването не е следователно само физическа особеност.
Може да повлиява на наличността на реактивни групи по време на синтеза.
Систематичното изследване на носителите на база полистирен и PEG показа, че характеристики като вид свързващ компонент и степента на свързване на смолата имат съществено влияние върху пружиняването при използваните в проучването по-екологични разтворители. Също така беше установено, че пружиняването може да се променя при отстраняването на защитните групи и при удължаването на пептидния протеин. [2]
Това показва, че поведението на смолата не винаги може да се счита за нейна постоянна характеристика.
На практика това зависи от взаимодействието между смолата, разтворителя, свързващия агент, свързания пептид и текущия етап на синтеза.
Доброто разпръскване или благоприятният ход на реакцията за една комбинация от смола, разтворител и пептид не означава, че друга комбинация ще се държи по същия начин.
Самият етап на свързване също изисква контрол на качеството
Първият етап на свързването може да изглежда прост, тъй като пептидният протеин тепърва започва да се образува.
Въпреки това, грешката, направена на този етап, може да остане налична по време на цялата по-нататъшна синтеза.
Ако първата остатъчна част бъде свързана неправилно или по време на този процес нейната стереохимична конфигурация се промени, правилното добавяне на всички следващи остатъци не е необходимо да поправи първоначалния проблем.
В изследване от 1992 г. е разработена аналитична методика, предназначена специално за измерване на рацемизацията, протичаща по време на свързването на защитени аминокиселини с неподвижни носители. [3]
Значението на тази работа надхвърля самата използвана аналитична методология.
Това показва, че стереохимичната чистота може да изисква контрол още преди началото на повтарящите се цикли на удължаване на веригата.
Също така количеството материал, първоначално прикачено към носителя, също изисква правилното му тълкуване.
Нивото на номиналното свързване на целулозата, измервано експериментално, количеството сурово вещество, възстановено след отцепване, и крайната ефективност на изолирания и почистения пептид са различни величини.
Те не трябва да се считат за заместващи показатели за успеха на синтеза.
По-дългите вериги може да станат по-рядко достъпни
С нарастването на пептидния ред самата свързана молекула започва да влияе върху своята химична среда.
Съседните вериги могат да взаимодействат помежду си чрез водородни връзки, хидрофобни взаимодействия и други межфазови сили. Някои последователности могат да показват особено силна тенденция към такива взаимодействия.
Това може да ограничи достъпа до реактивните групи.
В такъв случай присъединяването на следващия аминкинеин може да стане по-трудно, дори ако в системата е въведена привидно достатъчно голяма доза свързващ агент.
В проучване, свързано с трудни за агрегиране последователности, бяха сравнени различни методи за свързване и бяха анализирани получените сурови продукти. Резултатите подкрепят принципа, че процесът трябва да бъде адаптиран към конкретната последователност, вместо да се предполага наличието на една стратегия за свързване, която винаги е най-добрата. [4]
Това също така обяснява защо само увеличаването на степента на полимеризация на смолата или количеството на реагента автоматично не решава всички проблеми.
Ако основният проблем е ограничен достъп до активните места, от по-важно значение от въпроса за количеството добавен реагент става въпросът дали действително е достигнал до подходящите места и дали реакцията е протичала ефективно, без да се образуват нежелани странични продукти в неприемливо количество.
Защита, премахване на защитни групи и свързване
Охранителни групи контролират мястото на реакцията
Аминокиселините съдържат химични групи, способни да участват в различни реакции.
При контролираното натрупване на пептид химиците обикновено искат определена аминогрупа да реагира с конкретен блок, съдържащ карбоксилна група, докато другите потенциално реактивни места остават временно неактивни.
Точно за това служат охранителните групи.
Временно блокират избраните активни места, като позволяват на друго място да участва в планираната реакция.
В широко използваната стратегия на SPPS, базирана на Fmoc, крайната аминогрупа на растящия верижен фрагмент остава защитена между следващите етапи на свързването. Когато трябва да бъде свързан следващият аминокиселинен фрагмент, временната защита се отстранява, разкривайки аминогрупата.
Реактивните странични вериги могат да имат отделни защитни групи, проектирани така, че да останат непокътнати по време на повтарящите се цикли на изграждане на основната верига.
Целта е контролирана селективност.
Съответният блок, съдържащ карбоксилна група, трябва да се свърже с подходяща аминогрупа, вместо да води до неконтролирано разклоняване или други конкурентни реакции.
Ортональгеността означава възможността за избирателно отстраняване на защитите
Ортонаталната стратегия на защитните групи позволява да се премахне една защитна група при условия, при които другите необходими мерки за сигурност остават достатъчно непроменени.
Това дава възможност на химика да контролира откриването на различни реактивни места на отделните етапи на синтеза.
FMOC и Boc са добре познати определения в химията на пептидите, но те не обозначават различни видове пептидни връзки или различни крайни структури на пептида.
Тези групи са защитни механизми, свързани с различни стратегии за синтеза и различни методи за тяхното унищожаване.
Постоянната химична структура, използвана при изграждането на пептид, следователно трябва да бъде разграничена от окончателната му структура.
Опазването също не осигурява пълна защита срещу всички възможни нежелани реакции.
Изследванията върху образуването на аспартимид например показват, че стратегията за защита, съседните аминокиселинни остатъци и условията за отстраняване на защитните групи могат да повлияят на образуването на замърсявания дори при добре познатите методи на SPPS. [5] [6]
Стратегията на защитните групи следователно ограничава определени нежелани реакции, но не елиминира необходимостта от контрол на процеса или крайната аналитична характеристика.
Свързването създава още едно амидно свързване на скелета на пептида.
Реакцията на свързване води до образуването на следващ амиден връзък в структурата на пептида.
Аминокиселинен блок, съдържащ карбоксилна група, обикновено се активира химически, за да може ефективно да реагира с откритата аминогрупа на растящия пептид, свързан с протеина.
След завършване на свързването, разтворимият излишък от материал може да бъде отстранен чрез промиване.
Новоприсъединеният аминнокинеин става последната остатъчна част от растящия верижен протеин. След това може да се открие неговата аминогрупа и да започне следващият цикъл на свързване.
Теоретично повторното изпълнение на тази последователност позволява да се контролира последователността на аминокиселините чрез контрол на последователността на въвеждането на конструктивните блокове.
В практиката обаче има едно много важно предупреждение:
Планираният химичен процес трябва действително да протича правилно във всеки цикъл.
Ако едно свързване е непълно, част от веригите може да не получи планирания остатък.
Ако те останат свързани с целулозата и реагират правилно в следващия цикъл, могат да се получат делеционови последователности – частици на пептид, лишаващи се от един или няколко планирани аминокиселини.
Други вериги могат да останат съкратени.
Процесът на промиване премахва разтворимите реагенти и страничните продукти, но не елиминира избирателно всички неправилно структурирани вериги, които все още са ковалентно свързани с носителя.
Малките загуби могат да се натрупват в много цикли.
Повторящият се характер на SPPS води до значим математически проблем.
Малката несъвършенство на отделен етап може да изглежда незначително, но след много повторения нейните последици могат да се натрупват.
Рассмотрим простой математический пример.
Ако синтеза на пептида изисквал 50 етапа на свързване, а всеки от тях сам по себе си имал 99% вероятности за успешно завършване, теоретичният процент на молекулите, които успешно преминават през всичките 50 етапа, би бил около 60,5%.
Това е само илюстрация.
Това предполага, че всички етапи се държат идентично и независимо един от друг. Тя не отчита проблемите с отстраняването на защитните групи, нежеланите реакции, загубите при отцепването и почистването, агрегацията или много други реални фактори.
Поради това този резултат не трябва да се тълкува като прогноза за реалната производителност на производството.
Примерът показва само защо дори много високата ефективност на отделните етапи не гарантира химически прост суров продукт след няколко десетки повторения.
Ето защо мониторинга на синтеза и контрола на замърсяванията са важни по време на целия процес на синтезиране на пептид, а не едва след добавянето на последния аминнокиселинен остатък.
Автоматизацията, отоплението и други технологични решения могат да ускорят синтеза, но скоростта на процеса винаги трябва да се оценява заедно с качеството на продукта.
Проучването на SPPS с помощта на микроволнови лъчи анализира зависимостта на остатъчната реакция от вида и образуването на аспартимид, показвайки защо условията на реакцията все още трябва да бъдат адаптирани към свойствата на конкретната последователност. [7]
Отцеждането и възстановяването на суровото съдържание
Отцепването освобождава продукта от носителя
След построяването на планираната последователност на пептидите обикновено трябва да бъдат химически отделени от носителя.
Този етап се нарича „склеяне“, т.е. откъсване.
Откъсването прекъсва целенасочено разработеното химично свързване между пептида и носителя.
В зависимост от използваната стратегия, отцепването може да се извърши едновременно с отстраняването на части или всички групи на защитните вериги на страничните мембрани. В други процеси пептидът или неговият фрагмент може да бъде освободен при спазване на някои предпазни мерки, ако са планирани по-нататъшни химични реакции.
Подходящата химична реакция на отделянето зависи от свързващия агент и целта на молекулата.
Условията, които ефективно отделят един пептид, могат да увредят химически чувствителната група в друг.
Затова дезакилирането описва химическия цел, а не един универсален набор от реагенти или условия, подходящи за всички пептиди.
По същия начин правилното структуриране на скелета на пептида не доказва, че всички защитни групи са били след това ефективно отстранени.
Сглобяването на веригата и окончателното отстраняване на защитните елементи отговарят на различни химични въпроси и изискват отделно оценяване.
Условията за обезвреждане могат да повлияят на профила на замърсяването
Отделянето не трябва да бъде химически безвреден процес.
Отстраняването на защитните групи и откъсването на свързването на пептида с носителя може да доведе до образуването на реактивни химични форми, способни да модифицират пептида или другите компоненти на сместа.
Ето защо в разработените методи могат да се използват така наречените скавегери – вещества, които улавят определени нежелани реактивни продукти и влияят върху образуването на странични продукти.
В проучване от 2019 г. различни скавагери бяха анализирани при отделянето на екзенат от пептидната смола и беше показано, че изборът им влияе върху качеството на суровия продукт и наблюдавания профил на замърсяванията. [8]
Не трябва да се прави извод от това, че може да се разработи универсален рецепт за отстраняване на отлаганията.
Проучването показва обаче, че условията на този етап могат да повлияят на качеството на продукта и поради това трябва да бъдат оценени за конкретен пептид и използваната система на защитни групи.
Правилният процес на отцепване има следователно няколко измерения.
Пептидът трябва да бъде подходящо отделен, необходимите защитни групи трябва да бъдат отстранени, целевият материал трябва да бъде възстановен, а нежеланите химични реакции трябва да бъдат контролирани.
Рециклирането на суровия продукт не е крайното пречистване
След обезвреждането се извършва процес, който позволява отделянето на материала, съдържащ пептид, от постоянната смола и останалите части от компонентите на реактивната смес.
При това може да се използват разликите в разтворимостта, лесното разтваряне или други химични свойства.
Въпреки това, възстановяването на видимия отломък или фракция, съдържаща пептид, не доказва, че материалът се състои само от желаната продукция.
На този етап обикновено се говори за суров пептид.
Той може да съдържа целевата молекула заедно с делециозни секвенции, съкратени вериги, химически модифицирани пептиди, непълно дезасистирани структури, материали, получени от реактиви и други замърсявания.
Значението на отделните замърсители зависи от последователността, условията на синтеза и предназначението на приложението.
В едно от изследванията хроматографският раздел беше комбиниран със спектрометрия на масовите разделители, за да се характеризират суровите продукти SPPS и да се присвоят отделните пикове на хроматограмата на определените пептиди. [9]
Това показва защо информацията, получена чрез сепаративни и структурни методи, взаимно се допълва.
Хроматографията може да покаже наличието на множество компоненти, докато спектрометрията на масовите разделители може да предостави допълнителна информация, която помага да се определи какво може да представляват някои от тях.
Прочистването и потвърждаването на самоличността отговарят на различни въпроси
Чистенето има за цел да обогати или изолира целевата молекула от другите съставки.
Идентифицирането отговаря обаче на въпроса дали изолираният материал действително има очакваните химични свойства.
Тези въпроси частично се допълват, но не са едни и същи.
Добър разпределен хроматографски пик не представлява автоматично пълно доказателство за структурата на молекулата.
По същия начин, постигането на очакваната молекулна маса само по себе си не е пълен показател за чистотата или структурната точност.
Близките по генетична връзка варианти на последователността, стереоизомерите или химически модифицираните форми могат да бъдат трудни за разграничаване или отделяне.
Методът за филтрация следователно трябва да бъде оценен по отношение на действителната смес, получена при дадения синтез, а не да бъде считан за достатъчен само защото е доказал своята ефективност при друг пептид.
Ако крайната молекула също изисква образуване на дисиарчни мостици, циклизация или друга трансформация след завършването на свързването на веригата, възникват нови аналитични въпроси относно правилността на връзките, структурната еднакост и дали действително е получена желаната зрела форма на молекулата.
Предимства, ограничения и източници на замърсяване
Защо SPPS е толкова широко използвана?
Една от най-важните предимства на SPPS е възможността за запазване на образувания пептид върху носителя по време на многократното подмяна на течните реагенти.
Това опростява повтарящите се химични операции и позволява автоматизацията им.
Химиците могат да въвеждат планирана последователност от аминокиселинни строителни блокове, а ако това е позволено от химията на процеса, също и някои нестандартни аминокиселини и други модификации.
Съвременните автоматични системи показват докъде може да се развие тази концепция.
В изследване от 2020 г. относно автоматизираната синтеза на протеини беше описано получаването на вериги от протеини, съдържащи до 164 аминокиселинни остатъци. След последващо почистване и флдаж бяха получени функционални материали. [10]
Това е впечатляващ пример за технически възможности.
Това обаче не означава, че всяка последователност с дължина 164 остатъчни парчета — нито всеки дълъг пептид или протеин — може да бъде получена с такава лекота.
Това също така не означава, че пречистването и структурната характеристика стават ненужни.
Проучването показва по-скоро какви резултати могат да бъдат постигнати с добре разработена система за подходящо подбрани молекули.
Автоматизацията контролира изпълнението на процеса.
Той обаче не може да превърне неподходящата химична структура в подходяща.
Затова ефективността на апаратурата, последователността на пептида и самото съдържание на молекулата трябва да бъдат анализирани заедно.
Как се образуват типичните замърсявания?
По време на SPPS може да има няколко различни пътя, водещи до образуването на замърсявания. Разбирането им помага да се обясни защо крайните аналитични изследвания все още са необходими.
Делецийна последователност или съкратен продукт може да се образува, когато планираното свързване на аминокиселина не успее или когато растежът на веригата бъде прекъснат. Тъй като неправилният верижен фрагмент може да остане свързан с полимеразата, последващото промиване не е необходимо за неговото отстраняване.
Епимеризацията означава промяна в стереохимичната конфигурация на съответния център. Това има особено аналитично значение, тъй като епимерът може да има същата номинална молекулна маса като съответния пептид, но в същото време да има различна пространствена конфигурация.
Продуктите, свързани с аспартимид, могат да се образуват в резултат на реакции, които зависят от последователността на страничните продукти, включващи остатъците на аспартамата. В зависимост от химичния процес може да се образува повече от един вид такъв продукт.
Непълното отстраняване на защитните групи се случва, когато групата, която трябва да бъде отстранена, остава свързана с молекулата. Пептидът може следователно да има номинално очакваната дължина на веригата, но все още да има неправилна химична структура.
Модификациите, свързани с дезацептирането, могат да възникнат по време на окончателното отделяне на пептида или отстраняването на защитните групи. Правилното изграждане на веригата не гарантира, че пептидът ще премине през дезацептиращия етап без промени.
Непълните реакции, свързани с агрегацията, обаче могат да възникнат, когато образуващите се вериги взаимодействат помежду си по начин, който ограничава достъпа до реактивните места. Вкарването на достатъчно количество реагент в реакционната камера не гарантира, че всяко реактивно място е физически достъпно и подлежи на подходяща реакция.
Те са възможни пътеки за образуване на замърсявания.
Това не означава, че всяка партия, получена чрез SPPS, трябва да съдържа всички посочени видове нередности.
Их значение в конкретната синтеза се определя въз основа на познанията за процеса, аналитичните изследвания и подходящия контрол на качеството.
Направените естествени пептиди изискват нещо повече от възпроизвеждане на последователността.
Някои пептиди са структурно много по-сложни, отколкото би могло да се предположи въз основа на самата линейна последователност на аминокиселините.
Добър пример е епидермисът.
Структурната характеристика на епидермиса показа наличието на множество пръстени, съдържащи сяра, както и на необичайни остатъци. [11]
Само възпроизвеждането на линейната последователност на аминокиселините не би било достатъчен доказателство, че е получена автентична зрела епидермис.
Това разграничение е важно при интерпретирането на публикации или изследвания, свързани със синтеза на епидермиса в стайна фаза.
Публикацията може да описва линейен прекурсор, фрагмент, аналог или друга свързана структура, а не проверената цялостна синтеза на пълнозряла молекула.
Структурната публикация, цитирана тук като [11], описва характеристиките на самата епидермиса; не е доклад за нейното цялостно синтезиране чрез SPPS метод.
Твърденията за цялостната синтеза трябва да се оценяват спрямо действителната целната структура на молекулата, а не само спрямо нейното линейно аминокиселинно съдържание.
Производителността, чистотата и идентичността трябва да бъдат представяни поотделно
Три понятия, които често се бъркат в дискусиите за синтеза на пептиди, са ефективност, чистота и идентичност.
Голямата маса на възстановения продукт не означава непременно, че по-голямата част от този материал представлява целевия пептид. Суровият материал може да съдържа значителни количества замърсители.
По същия начин високата хроматографска чистота не потвърждава автоматично всички аспекти на структурната идентичност.
Дори и пептидът, чиято химична структура е точно определена, не получава автоматично потвърдено биологично, терапевтично или клинично приложение.
Това са отделни въпроси.
Поверителният опис на синтеза трябва да посочва коя цел е била постигната, на какъв етап е била измерена ефективността, дали анализираният материал е суров или пречистен и какви аналитични данни са използвани за потвърждаване на твърденията относно структурата.
Благодарение на това резултатите от синтеза могат да бъдат интерпретирани и сравнени по по-верен начин.
Необезпособен процентен показател или маса не трябва да се превръща в общо заключение, че пептидът е „висококачествен”, без да се знае какво всъщност е измерено.
Често задавани въпроси
1. Защо в SPPS се използва постоянна фаза?
Стабилната фаза задържа образувания пептид върху носителя, докато разтворимите реагенти, страничните продукти от реакцията и преминаващите разтворими разтвори могат да бъдат многократно въвеждани и отстранявани. Това значително опростява повторното нанасяне на веригата и позволява автоматизацията на синтеза на пептиди, като пример за това са съвременните методи за автоматизирана преносима синтеза. [10] Но носителят не гарантира, че всяка реакция ще протича идеално, нито отстранява неправилно структуриран верижен полимер свързан с полимер от правилния. Неговата основна предимство е в ускоряването на процеса. Химичната селективност, пълнотата на реакцията, чистотата и структурната идентичност все още изискват отделно оценяване.
2. Премахва ли синтезата на постоянна фаза необходимостта от пречистване?
Не. Неправилните пептидни вериги могат да останат свързани с целулозата по време на синтеза и след това да бъдат освободени заедно с желания продукт. Проучвания, анализиращи суровите продукти SPPS чрез хроматография и масовия спектрометър, показват, че промиването по време на синтеза и крайното почистване изпълняват различни функции. [9] Промиването премахва предимно разтворимите компоненти, обграждащи целулозата, докато филтрирането след отделянето има за цел да отделя желания пептид от нежеланите пептидни и непептидни съставки. SPPS опростява междинните операции, но не гарантира крайната чистота.
3. Значи ли „стабилна фаза”, че не се използва разтворител?
Не. В стандартната SPPS неразтворимият носител обикновено е заобиколен от течни реагенти и разтворители. Разтворителите влияят върху физическата среда на смолата, включително върху степента на раздуване и лесността с която реагентите могат да достигнат свързаните вериги. Експерименталните изследвания показват зависимост на разтворителя от опъването на смолата и промените, свързани с химията на свързващия елемент, степента на свързване и удължаването на веригата. [2] Следователно смолата и разтворителят заедно образуват среда за реакция.
4. В коя посока расте пептид по време на SPPS?
Конвенционалната последователна SPPS обикновено формира пептид от остатъка на C-концето му към N-концето. Първият аминнокиселинен остатък, който трябва да формира C-концето на готовата молекула, се свързва към носителя, а следващите остатъци удължават открития край на аминокиселиненя ред. Публикуваните методи, базирани на Fmoc, показват този типичен модел. [1] Въпреки това съществуват специализирани стратегии, използващи стайна фаза, които могат да протичат по различен начин.
5. Използват ли се смола и свързващ агент едно и също?
Не. Химикалният свързващ компонент е химично свързване между носителя и растящия пептид. Функционалността на свързващия компонент може независимо от самия полимер да влияе върху свързването, поведението на химикалния свързващ компонент и последващото отделяне на пептида. Проучванията на носителите, използвани при синтеза на пептиди, показват защо самото определяне на типа на химикалния свързващ компонент може да не е достатъчно за описание на поведението на цялата система. [2]
6. Доколко по-високият процент на полимеризация на смолата винаги увеличава производството?
Не. По-високият loading означава повече потенциални места за свързване за определено количество носител, но не винаги води до получаване на повече правилно структурирани и възстановими пептиди. Степента на свързване може да промени локалната молекулярна среда и е експериментално показан като един от факторите, влияещи върху разтягането на целулозата. [2] Ако свързаните вериги са прекомерно стеснителни или силно взаимодействат помежду си, наличността на реактивни места може да се влоши. Следователно, loadingът трябва да се анализира заедно с характеристиките на целулозата, поведението на последователността, ефективността на реакцията и качеството на крайния продукт.
7. Защо аминокиселините се защищават по време на нанасянето на пептида?
Охранителните групи временно възпрепятстват избраните реактивни групи да участват в реакциите, докато се формира конкретно свързване. Това позволява контролирано, поетапно свързване на веригата. Това обаче не премахва всички странични реакции. Изследвания върху модели на системи показват например, че стратегията на охранителните групи и заобикалящата ги последователност могат да повлияят на образуването на аспартимид. [5] Следователно охранителните групи осигуряват химическа селективност, но цялата стратегия за защита и разблокиране все още изисква внимателно планиране и оценка.
8. Какво означава ортогоналната защита на функционалните групи?
Ортональгеността означава възможността за отстраняване на една защитна група при условия, които оставят останалите необходими защити в достатъчна степен непроменени. Това позволява разкриването на определени места на реактивиране по планираните етапи на синтеза. Установените методи на SPPS се основават на контролирано отстраняване и отпускане на защити, вместо едновременното разкриване на всички защитни групи. [1] Реалната съвместимост на прилаганите защити все пак продължава да зависи от целевата молекула и условията на реакцията.
9. Амират ли Fmoc и Boc различни видове пептиди?
Не. Fmoc и Boc са защитни групи и свързаните с тях синтетични стратегии, а не различни видове пептиден скелет. Разликите в химичния им процес на отстраняване влияят върху начина на провеждане на синтеза, но временната защитна химия не трябва да се бърка с окончателната структура на целевия пептид. Опубликованите методи, базирани на Fmoc, показват един от най-често използваните варианти на SPPS, но това не означава, че всеки пептид трябва да бъде получен чрез тази методология. [1]
10. Може ли вече първият етап на свързването да доведе до замърсяване?
Да. Стъпката на свързване може да повлияе на стереохимичната стабилност още преди началото на многократно удължаване на веригата. Разработени са аналитични методи, предназначени специално за определяне на рацемизацията при свързването на защитени аминокиселини с смоли. [3] Това не означава, че всяко свързване води до значителна рацемизация. Вместо това показва, че самото свързване е химически значим етап, по време на който могат да възникнат измерими промени, които трябва да бъдат взети под внимание при цялостната оценка на качеството.
11. Защо някои пептидни последователности се определят като трудни?
Някои нарастващи пептидни вериги взаимодействат помежду си или със съседни вериги по начин, който ограничава достъпа до реактивни места. Водородните връзки, хидрофобните взаимодействия и агрегационните поведения могат да затруднят последващото свързване. Проучванията на секвенции, податливи на агрегация, показват, че промяната в начина на свързване може да повлияе на състава на крайния продукт. [4] Трудността на синтеза следователно зависи от свойствата на молекулата и условията на реакцията, а не само от дължината на пептида.
12. Значи ли по-бързото синтезиране винаги по-добър продукт?
Не. Скоростта на синтеза и качеството на продукта са отделни параметри. Отоплението, подпомагането с микроволнови лъчи и автоматизацията могат да съкратят времето на процеса, но ускоряването на реакциите може също да промени баланса между желаните и страничните реакции. Проучванията върху синтеза с микроволново подпомагане показват зависимост от вида на остатъчната реакция и образуването на аспартимид, което предполага необходимостта от подходящ контрол на условията. [7] По-краткият период на синтеза е благоприятен само когато полученият материал отговаря и на необходимите химични и аналитични критерии.
13. Значи ли обезвъздушаването просто отстраняването на зърната от смолата?
Не. Отстраняването е химичен процес, който води до разкъсване на проектираното свързване между пептида и носителя. Отстраняването на зърната от целулоза чрез филтрация е обаче физическа операция, която сама по себе си не потвърждава правилното протичане на химичния процес на отстраняване. Освобождаването на пептида може да се случи едновременно с отстраняването на защитните групи и други реакции. Проучванията на scavenger-ите, използвани по време на отстраняването, показват, че този етап може да повлияе на профила на замърсяването. [8]
14. Значи ли високата ефективност на суровия продукт висока чистота на пептида?
Не. Производителността на суровия материал описва количеството възстановена материя преди отстраняването на всички нежелани компоненти. Този материал може да съдържа целевия пептид заедно с делециозни секвенции, модифицирани структури, останали защитни групи и други замърсявания. Проучванията на суровите смесвания SPPS с помощта на хроматография и масова спектрометрия показват защо възстановената маса, чистотата и молекулярната идентичност изискват отделно тълкуване. [9] Поради това достоверно представяната производителност трябва да посочва етапа, на който е измерена, както и дали материалът вече е бил пречистен.
15. Може ли SPPS да осигурява получаване на дълги вериги от пептиди?
Да. Прецизно разработените методи на SPPS могат да позволят получаването на много дълги вериги. В изследванията върху автоматизираната поточна синтеза се получаваха вериги, съдържащи дори 164 остатъчни групи, които след това се пречистваха и фалдираха преди функционалната оценка. [10] Това показва възможностите на съвременната пептидна синтеза, но не означава, че всяка последователност с подобна дължина може да бъде получена с еднаква ефективност. Дължината е само един от факторите; значение имат също така зависимостта от последователността, страничните реакции, изискванията за фалдиране и трудността при почистването.
16. Значи ли изграждането на епидермиална последователност извършването на нейната пълна синтеза?
Не. Зрелата епидермиса съдържа необичайни структурни елементи, включително пръстени, съдържащи сяра, които надхвърлят само линейната последователност на аминокиселините. Това е доказано в структурни изследвания. [11] Получаването на линейна последователност, прекурсор или фрагмент не означава автоматично синтеза на пълна зрела молекула. Твърдението за синтеза на цялата молекула изисква аналитични данни, потвърждаващи повторението на планираните връзки и други важни структурни елементи.
17. Доколко очакваната маса на молекулата потвърждава пълната правилност на структурата?
Не. Получаването на очакваната молекулна маса представлява ценна информация, но самата маса не потвърждава всички аспекти на структурата на пептида и не изключва всички значими примеси. Две молекули могат да имат еднаква номинална маса, но да имат различен стереохимия или определен структурен модел. Проучванията, включващи разделянето на епимерични пептиди, показват защо стереохимичните разлики може да изискват аналитични методи, способни да различават структури, които не могат да бъдат разграничени единствено въз основа на измерването на масата. [12] Крайният профил трябва следователно да бъде проектиран с включване на реалистични примеси и алтернативни структури, които могат да възникнат по време на конкретната синтеза.
Резюме
Синтезата на пептидите в стационарна фаза промени химията на пептидите, позволявайки поддържането на растящия верижен фрагмент върху неразтворимо носител по време на многократното въвеждане, провеждането на реакции и отстраняването на разтворимите реагенти. Това улеснява последователното изграждане на последователности и представлява практическа основа за автоматичната синтеза.
Очевидното опростеност на този метод обаче не трябва да заблуждава за химията, протичаща на всеки етап.
Силиконът, свързващият агент и степента на свързване оказват влияние върху съществените свойства на синтетичната среда. Разтворимостта зависи от разтворителя и влияе върху достъпа до веригите, свързани със силикона. Защитените групи контролират кои функционални групи могат да реагират, а свързващите реакции изграждат скелета на пептидния остатък. [1] [2]
Всеки от тези етапи също има своите ограничения.
Първоначалното свързване може да повлияе на стереохимичната структура. [3] Трудните последователности могат да увеличават и ограничават достъпа до реактивните вещества. [4] Химичната защита и отстраняването на защитните групи може да благоприятства образуването на странични реакции, като например образуването на аспартимид. [5] [6] Ускорените условия на синтеза могат да променят степента на рацемизация или профила на замърсяването. [7] Условията за отстраняване могат допълнително да повлияят на състава на суровия продукт. [8]
Ето защо правилното изграждане на веригата не е равносилно на получаване на чист и правилно идентифициран пептид.
Рециклирането на суровия продукт, пречистването и структурната характеристика остават отделни етапи. Кроматометрията може да предостави информация за състава на сместа и чистотата, докато спектрофотометрията с масови спектроскопи и други аналитични методи предоставят информация за идентичността. Никой единствен аналитичен резултат не трябва да потвърждава всички аспекти на структурата на пептида. [9] [12]
Съвременната автоматизирана потокова синтеза показва, че при подходящи условия SPPS може да се използва дори за много дълги вериги. [10] В същото време структурно сложните пептиди, като епидермином, показват защо самото възпроизвеждане на линейна аминокиселинна последователност може да не е достатъчно, ако зрелият фрагмент съдържа допълнителни пръстени, нестандартни остатъци или определен тип връзки. [11]
Най-добре SPPS може да се разбира не като еднакво действие, а като последователност от отделни химични и аналитични етапи.
Присъединяването определя началния пункт. Повторяващите се цикли на затваряне, отваряне и свързване изграждат планирания модел. Отделянето освобождава продукта. Очистването отделя целевата молекула от нежеланите съставки. Крайният анализ позволява след това да се установи дали изолираният материал действително има приписаната му структура и качество.
Разделянето на тези етапи позволява да се избегнат няколко често срещани недоразумения: успешната синтеза не потвърждава автоматично чистотата, високата ефективност не потвърждава автоматично идентичността, а очакваната молекулна маса сама по себе си не доказва пълната структурна точност.
Препратки
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Синтез на пептиди на твърда фаза: От стандартни процедури до синтеза на трудни последователности. Природопротоколи, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K. & Willway, H. (2020). Изследване на параметрите, които влияят върху омекването на смолата при зелени разтворители. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Адамсън, Дж. Г., Хоанг, Т., Кривичи, А., и Лажой, Г. А. (1992). Използване на реагент на Марфи за количествено определяне на рацемирането при свързването на аминокиселини към твърди носители за пептидна синтеза. Аналитична биохимия, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Оценка на комбинираното използване на Oxyma и HATU при агрегиране на пептидни последователности. Журнал за пептидна наука, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Мерглер, М., Дик, Ф., Сакс, Б., Вайлер, П. и Вохер, Т. (2003). Проблемът с аспартимида в SPPS, базиран на Fmoc. Част I. Журналът за пептидна наука, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Мерглер, М., Дик, Ф., Сакс, Б., Стахелин, К., и Ворхер, Т. (2003). Проблемът с аспартимида в SPPS, базиран на Fmoc. Част II. Журналът за пептидна наука, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Паласек, С. А., Кокс, З. Дж. и Колинс, Дж. М. (2007). Ограничаване на рацемизацията и образуването на аспартимид при синтеза на пептиди в твърда фаза по метода Fmoc, подсилен с микровълнова енергия. Списание „Journal of Peptide Science“, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-бензендемитаноил (1,4-BDMT) като отстраняващ агент при разцепванията на зелени пептидни смоли. RSC напредва, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- Маккелоп, К., Дейвидсън, У., Хансен, Г., Фрийман, Д. и Палай, П. (1991). Описанието на суровите продукти от пептидната синтеза на твърда фаза чрез масспектрометрия с му-HPLC/бърз атомен взрив. Пептидни изследвания, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E. & Pentelute, B. L. (2020). Синтез на протеини чрез автоматична флуидна химия. Наука, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: Серийно изследване на хетеродричен тетрацикличен 21-пептиден амиден антибиотик. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Миязава, Т., Отомацу, Т., Ямада, Т. и Кувата, С. (1992). Изследвания на рацемирацията при пептидната синтеза чрез отделяне на защитени епимерични пептиди чрез обратна флуктуационна високоефективна течна хроматография. Международен журнал за пептидни и протеинови изследвания, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x