Tahke faasi peptiidide süntees, mida tähistatakse enamasti lühendiga SPPS (solid-phase peptide synthesis), on keemiline meetod peptiidide ehitamiseks aminohape haaval, samal ajal kui kasvava ahela üks ots jääb keemiliselt seotuks lahustumatu kandjaga.
Selle asemel et kasvavat peptiidi pärast iga reaktsiooni eraldada, jätavad keemikud selle tahkele faasile seotuks, lisades ja eemaldades järjestikuseid vedelaid reaktiive ning pesulahuseid. Korduvad tsüklid võimaldavad paljastada reaktiivse aminorühma, liita järgmise aminohappe ja eemaldada lahustuvad komponendid, mida pole enam vaja. Pärast kavandatud aminohappejärjestuse ülesehitamist saab peptiidi kandjalt lahti ühendada ning seejärel edasi töödelda ja analüüsida.
Selline protsessi korraldus on üks peamisi põhjuseid, miks SPPS-ist on saanud peptiidikeemias nii oluline meetod. Tahke faas lihtsustab paljude korduvate keemiliste operatsioonide tegemist ja on võimaldanud sünteesi automatiseerimist.
Tahke faasi sünteesi mugavus ei täienda siiski keemilise täiuslikkuse garantiid.
Kasvava peptiidi kinnitamine kandjale ei garanteeri, et iga ahel saab kõik kavandatud aminohapped. See ei tähenda ka seda, et protsessi lõpus vabanev materjal on keemiliselt puhas või õige struktuuriga.
Ahela süntees, toote lõhustamine ja eraldamine, puhastamine, identiteedi kinnitamine ja lõplik struktuurne karakteriseerimine on kogu protsessi eraldi osad.
Kaasaegsed metoodilised publikatsioonid näitavad nii SPSS-i kasulikkust kui ka vajadust modifitseerida standardseid meetodeid keeruliste järjestuste korral. Ühes avaldatud meetodis, mis kasutatakse Fmoc-strateegiat, kirjeldatakse näiteks rutiinset sünteesi, aga ka modifitseeritud lähenemist agregatsioonitundlikele peptiidijärjestustele. [1]
SPPS-i mõistmine nõuab seega enamat kui lihtsalt keemiliste etappide meeldejätmist. Samuti on vaja teada iga etapi eesmärki, mis võib selle käigus valesti minna ja millistele analüütilistele küsimustele tuleb pärast selle lõppemist veel vastata.
Peptiidide süntees tahkel faasil on meetod, mida kasutatakse keemias peptiidide ja valkude laboratoorseks valmistamiseks, kus kasvavat peptiidahelat hoitakse kovalentselt seotuna lahustumatu tahke kandja (vaiguga), mis võimaldab reaktiive ja kõrvalsaadusi pärast igat reaktsioonietappi lihtsa filtreerimise teel eemaldada.
Moodustuv peptiid jääb seotuks ja lahused vahetuvad
Konventsionaalses SPPS-is on peptiid keemiliselt seotud väikeste vees lahustumatute osakestega, mida tavaliselt nimetatakse vaiguterakesteks, sobiva keemilise linkeri abil.
Terad jäävad reaktsioonisüsteemi, samal ajal kui järgmised vedelad reaktiivid ja pesulahused lisatakse ning eemaldatakse.
See lihtsustab oluliselt korduvat sünteesi.
Klassikalises astmelises lahussünteesis võib kasvava peptiidi eraldamine ja puhastamine pärast iga aminohappe liitmist olla tülikas. SPPS-is jääb moodustuv ahel seotuks lahustumatu faasiga. Tänu sellele saab lahustuvaid reaktiivide ülejääke ja paljusid kõrvalprodukte eemaldada pesemise teel, samal ajal kui vaiguga seotud peptiid jääb paigale.
Mõiste „tahke faas” võib siiski tekitada arusaamatusi.
See ei tähenda, et peptiidsidemete moodustumine toimuks ilma vedeliku või lahustita.
Vaik on tavaliselt ümbritsetud vedela reaktsioonikeskkonnaga ning selle koostoime lahustiga võib sünteesi käiku oluliselt mõjutada. Reaktiivid peavad endiselt liikuma polümeerikeskkonnas või selle ümber ja jõudma kasvava peptiidi reaktiivsete kohtadeni.
Peptiidi liitmine kandjale on tavaliselt kovalentse iseloomuga. See tähendab, et tekkiv molekul on kandjaga ühendatud linkerlüli kaudu keemilise sideme abil.
Seega ei ole peptiid lihtsalt osakeste vahele vangistatud, filtriga kinni peetud ega pinnal vabalt.
Selline keemiline ühend on sihilikult konstrueeritud nii, et tekkiv ahel püsib järgnevate reaktsioonide ja pesemisetappide ajal seotuna ning seda saab hiljem sobivates tingimustes vabastada.
Konventsionaalne süntees toimub C-otsast N-otsa suunas
Klassikaline lineaarne SPPS-strateegia algab tavaliselt aminohappest, mis moodustab valmis peptiidi C-otsa.
Ülejäänu kinnitatakse kanduri külge.
Pärast vastava reaktiivse aminorühma vabastamist viiakse sisse järgmine kaitstud aminohape ja seotakse keemiliselt moodustuva ahelaga. Selle protsessi kordamine pikendab peptiidi järk-järgult N-otsa suunas.
Seda suunda tasub rõhutada, kuna see erineb ribosoomide abil toimuvast bioloogilisest valgusünteesist.
Ribosomaalne süntees pikendab polüpeptiidi N-otsast C-otsa suunas. Tavapärane astmeline SPPS ehitab järjestust tavaliselt vastupidises suunas.
Lõplik aminohappejärjestus võib siiski olla identne. Erineb selle ülesehituse viis.
Siin on oluline mõiste „konventsionaalne”, kuna peptiidikeemia hõlmab ka spetsiaalseid strateegiaid, mis kasutavad alternatiivseid liitumiskohti, fragmentide kokkupanekut, ligeerimisreaktsioone ja muid kohandatud lahendusi.
Suuna kirjeldamine C-otsast N-otsani viitab seega tüüpilisele astmelisele SPPS-protsessile, mitte kõigile võimalikele tahke faasi peptiidikeemia meetoditele.
SPPS on vaid üks peptiidide sünteesi elementidest
Tahke faasi süntees ei ole ainus viis peptiidide saamiseks.
Peptiide võib saada ka keemilise sünteesi teel lahuses, bioloogiliste ekspressioonisüsteemide, ensümaatiliste muundamiste, fragmentide ligeerimise või erinevate meetodite kombinatsioonide kaudu.
SPPS on eriti kasulik, kui on vaja kontrollitud järjestuse koostamist ning kaitstud, modifitseeritud või muul viisil spetsialiseeritud aminohapete ehitusplokkide kasutamist.
Isegi ühe konkreetset peptiidi puudutava projekti raames ei pea alati algusest lõpuni sama meetodit kasutama.
Peptiidi üksikuid fragmente saab näiteks sünteesida vaigul, eraldi puhastada ja seejärel mõne muu keemilise meetodi abil ühendada. Teised molekulid võivad pärast esialgse lineaarse jada saamist vajada voltumist, oksüdeerimist, tsükliseerimist või täiendavaid struktuurseid muundumisi.
Õige tee valik sõltub seega sihtmolekulist, selle struktuursest keerukusest ning projekti analüütilistest ja kvaliteedinõuetest.
Protsessi tasub vaadelda kui järjestikuste küsimuste seeriat.
Kandjaga ühendamine määrab alguspunkti ja mõjutab toote vabanemise hilisemat keemiat. Siiski tuleb veel kindlaks teha, kas ühendamine toimus õigesti ja kas stereokeemiline terviklikkus on säilinud.
Ahela süntees peab viima aminohapete liitumiseni kavandatud järjekorras. Seejärel tuleb aga kontrollida, kas kõik ahelad reageerisid õigesti ning kas ei ole tekkinud puuduvate aminohapetega järjestusi, lühenenud või modifitseeritud saadusi.
Kaitserühmade lõhustamine ja eemaldamine peavad peptiidi vabanema ja eemaldama teatud keemilised kaitsed. Toote edukas vabanemine ei ütle aga midagi selle kohta, millised muud ained on toormaterjalis.
Puhastamine on mõeldud soovitud materjali eraldamiseks soovimatutest komponentidest, kuid isegi puhastatud fraktsioon vajab endiselt identiteedi kinnitamist ja kvaliteedi hindamist.
Lõplik strukturaalne ja analüütiline iseloomustus peab aga vastama küsimusele, kas eraldatud materjalil on sihtpeptiidilt oodatud keemilised omadused ja kas kasutatud analüütilised meetodid on kavandatud kasutusotstarbeks sobivad.
Need on kontseptuaalsed etapid, mitte laborijuhend. Konkreetsed reaktiivid, aparatuur ja reaktsioonitingimused sõltuvad sihtpeptiidist ning nõuavad vastavalt välja töötatud ja valideeritud meetodit.
Vaigu külge ühendamine ja ketikokkupanek
Vaik, sideaine ja asendusaste täidavad erinevaid funktsioone
SPPS-i aruteludes esineb sageli kolm terminit: vaik, linker ja asendusaste ehk *loading*.
Need kirjeldavad seotud, kuid erinevaid omadusi.
Vaik on lahustumatu kandematerjal.
Linker tagab keemilise sideme selle kandja ja peptiidi või esimese aminohappejäägi vahel. Selle keemiline olemus võib mõjutada nii peptiidi sidumise viisi kui ka selle hilisemat vabanemist.
Laadung seegegen kirjeldab reaktiivsete kinnituskohtade arvu kandja koguse suhtes.
Need mõisted ei ole sünonüümid.
Kaks vaiku võivad füüsiliselt välja näha väga sarnased, kuid samal ajal omada erinevaid funktsionaalrühmi, linkreid ehk sidemeid või asendusastet. Need erinevused võivad mõjutada reaktiivsete saitide kättesaadavust ahela kokkupanekul, vaigu paisumist ja lõpliku peptiidi keemilist vormi pärast lõhustamist.
Teine oluline element on kavandatud rühm C-lõpus.
Erinevaid kandja-linker süsteeme saab valida näiteks nii, et saada karboksüül- või amiidrühmaga lõpep peptiid.
See on oluline keemiline erinevus.
Terminalrühma muutmine tähendab molekuli enda muutmist, mitte ainult selle pakendamise või kirjeldamise viisi.
Paisumine mõjutab juurdepääsu kinnitatud ahelatele
Paljud tahke faasi peptiidisünteesis (SPPS) kasutatavad vaigud imavad sobiva vedela keskkonnaga kokkupuutel lahustit ja paisuvad.
See muudab polümeerset keskkonda ja võib suurendada või vähendada ruumi, mida lahustunud reaktiivid peavad läbima, et jõuda vaiguga seotud peptiidahelateni.
Paisumine ei ole seega pelgalt füüsikaline uudishimu.
See võib mõjutada reaktiivsete rühmade kättesaadavust sünteesi ajal.
Polüstüreenil ja PEG-il põhinevate kandjate süstemaatiline uurimine näitas, et sellised omadused nagu linker tüüp ja vaigu asendusaste mõjutasid oluliselt paisumist uuritud keskkonnasõbralikumates lahustites. Samuti leiti, et paisumine võib muutuda kaitsegruppide eemaldamise käigus ja peptiidahela pikenedes. [2]
See näitab, et vaigu käitumist ei saa alati käsitleda selle püsiva omadusena.
Praktikas sõltub see vaigu, lahusti, linkeri, seotud peptiidi ja sünteesi praeguse etapi koostoimest.
Seega ei tähenda hea paisumine või soodne reaktsioonikäik ühe vaigu, lahusti ja peptiidi kombinatsiooni puhul, et teine kombinatsioon käituks identselt.
Ka see liitumisetapp nõuab kvaliteedikontrolli.
Ühendamise esimene etapp võib tunduda lihtne, kuna ahelpeptiid alles hakkab moodustuma.
Selles etapis tehtud viga võib aga kogu järgneva sünteesi vältel püsima jääda.
Kui esimene jääk kinnitatakse valesti või kui selle stereokeemiline konfiguratsioon selle protsessi käigus muutub, ei pruugi kõigi järgnevate jääkide õige lisamine algset probleemi parandada.
1992. aasta uuringus töötati välja analüütiline meetod, mis on ette nähtud spetsiaalselt tahketele kandjatele kaitstud aminohapete sidumise ajal toimuva ratsemise mõõtmiseks. [3]
Selle töö tähendus ulatub kaugemale pelgalt kasutatud analüütilisest meetodist.
See näitab, et stereokeemiline kvaliteet võib vajada kontrolli juba enne korduvate ahela pikendamise tsüklite algust.
Ka kandjale algselt kinnitatud materjali kogus vajab õiget tõlgendamist.
Vaigu niminaalne asendusaste, eksperimentaalselt mõõdetud laadimine, pärast lõhustamist taastatud lähteaine kogus ning eraldatud ja puhastatud peptiidi lõplik saagis on erinevad suurused.
Neid ei tohiks käsitleda sünteesi edukuse asendatavate näitajatena.
Pikemad ahelad võivad muutuda raskemini kättesaadavaks
Peptiidahela pikenedes hakkab külge seotud molekul ise mõjutama oma keemilist keskkonda.
Naaberahelad võivad omavahel suhelda vesiniksidemete, hüdrofoobsete interaktsioonide ja muude molekulidevaheliste jõudude kaudu. Mõned järjestused võivad näidata eriliselt tugevat kalduvust sellisteks interaktsioonideks.
See võib piirata juurdepääsu reaktiivsetele rühmadele.
Sellises olukorras võib järgmise aminohappe liitmine muutuda raskemaks, isegi kui süsteemi on lisatud näiliselt piisavas koguses sidestusreaktiivi.
Raskete, agregatsioonile kalduvate järjestuste uuringus võrreldi erinevaid sidumismeetodeid ja analüüsiti saadud toorprodukte. Tulemused toetavad põhimõtet, et protsessi tuleks kohandada konkreetsele järjestusele, selle asemel et eeldada ühesuguse sidumisstrategia alati parimat toimimist. [4]
See selgitab ka seda, miks vaigu asendusaste või reaktiivi koguse suurendamine iseenesest ei lahenda automaatselt kõiki probleeme.
Kui peamiseks probleemiks on piiratud juurdepääs reaktiivsetele kohtadele, muutub lisatud reaktiivi koguse küsimusest olulisemaks küsimus, kas see on tegelikult jõudnud õigetesse kohtadesse ja kas reaktsioon kulges tõhusalt ilma lubamatu hulga kõrvalsaaduste tekketa.
Turvamine, kaitsepiirete eemaldamine ja haakimine
Kaitserühmad kontrollivad reaktsioonikohta
Aminohapped sisaldavad keemilisi rühmi, misvad osaleda erinevates reaktsioonides.
Kontrollitud peptiidien sünteesi ajal soovivad keemikud tavaliselt, et kindel aminorühm reageeriks kindla karboksüülrühma sisaldava plokiga, samal ajal kui teised potentsiaalselt reaktiivsed kohad jäävad ajutiselt passiivseks.
Just selleks kaitsegrupid ongi.
Need blokeerivad ajutiselt valitud reaktiivsed kohad, võimaldades teisel kohal kavandatud reaktsioonis osaleda.
Üldiselt kasutatavas Fmoc-põhises SPPS-i strateegias jääb kasvava ahela viimane aminorühm järjestikuste liitmisetappide vahel kaitstuks. Kui järgmine aminohape soovitakse lisada, eemaldatakse ajutine kaitse, paljastades aminorühma.
Reaktiivsetel külgahelatel võivad olla eraldi kaitserühmad, mis on loodud jääma puutumatuks põhiahela korduva sünteesi tsüklite ajal.
Eesmärk on kontrollitud selektiivsus.
Sobiv karboksüülrühma sisaldav plokk peaks ühinema vastava aminorühmaga, selle asemel et põhjustada kontrollimatut hargnemist või muid konkureerivaid reaktsioone.
Ortogonaalsus tähendab turvameetmete valikulise eemaldamise võimalust
Ortogonaalne kaitsegruppide strateegia võimaldab eemaldada ühe kaitsegrupi tingimustes, kus teised vajalikud kaitsemeetmed jäävad piisaval määral puutumatuks.
See annab keemikule võimaluse sünteesi eri etappides erinevaid reaktiivseid kohti kontrollitult paljastada.
Fmoc ja Boc on peptiidikeemias hästi tuntud terminid, kuid need ei tähista erinevat tüüpi peptiidsidemeid ega peptiidi erinevaid lõppstruktuure.
Need on kaitserühmad, mis on seotud erinevate sünteesistrateegiate ja nende eemaldamise erinevate meetoditega.
Seetõttu tuleb peptiidi ehitamisel kasutatavat ajutist keemilist teed eristada selle lõplikust struktuurist.
Turvameetmed ei taga samuti täielikku kaitset kõigi võimalike kõrvaltoimete eest.
Aspartamiidi tekke uuringud näitavad näiteks, et kaitsestrateegia, naabruuses olevad aminohappejäägid ja kaitserühmade eemaldamise tingimused võivad mõjutada lisandite teket isegi hästituntud SPPS-i meetodites. [5] [6]
Kaitsegruppide strateegia piirab seega teatud soovimatuid reaktsioone, kuid ei kaota protsessi kontrollimise ega lõpliku analüütilise iseloomustuse vajadust.
Sidestamine loob peptiidahela järgmise amiidsideme
Sidestusreaktsioon viib uue amiidsideme moodustumiseni peptiidi selgroos.
Karboksüülrühma sisaldav aminohappeplokk on tavaliselt keemiliselt aktiveeritud, et see saaks tõhusalt reageerida vaiguga seotud kasvava peptiidi vaba aminohrühmaga.
Pärast sidestusreaktsiooni lõppu saab lahustuva materjali ülejäägi eemaldada pesemise teel.
Äsja liitunud aminohape muutub siis kasvava ahela lõpusrühmaks. Seejärel saab selle rühma aminorühma vabastada ja alustada järgmist sidestustsüklit.
Teoreetiliselt võimaldab selle järjestuse kordamine kontrollida aminohapete järjekorda, kontrollides ehitusplokkide sisestamise järjekorda.
Praktikas on siiski üks väga oluline reservatsioon:
kavandatud keemiline reaktsioon peab igas tsüklis tõepoolest korrektselt toimuma.
Kui üks sidurdamine on mittetäielik, võib osa ahelatest jääda plaanitud jäägita.
Kui need jäävad vaigule seotuks ja reageerivad järgmises tsüklis õigesti, võivad tekkida deletsioonijärjestused ehk peptiidmolekulid, millest puudub üks või mitu kavandatud aminohapet.
Teised ketid võivad jääda lühendatuks.
Pesemine eemaldab lahustuvad reagendid ja kõrvalsaadused, kuid ei kõrvalda selektiivselt kõiki valesti ehitatud ahelaid, mis on endiselt kovalentselt kandjaga seotud.
Väikesed kahjud võivad mitme tsükli vältel koguneda.
SPPS-i korduv olemus viib olulise matemaatilise probleemini.
Ühe etapi väike ebatäiuslikkus võib tunduda ebaoluline, kuid paljude korduste järel võivad selle tagajärjed kumuleeruda.
Vaatleme lihtsat matemaatilist näidet.
Kui peptiidi süntees eeldaks 50 sidumisetappi ja iga etapi õnnestumise tõenäosus oleks sõltumatult 99%, oleks kõigi 50 etapi edukalt läbimise teoreetiline osakaal umbes 60,5%.
See on vaid illustratsioon.
See eeldab, et kõik etapid käituvad identselt ja sõltumatult. See ei võta arvesse kaitsegruppide eemaldamise probleeme, kõrvalreaktsioone, kadusid eraldamisel ja puhastamisel, agregatsiooni ega paljusid muid reaalseid tegureid.
Seetõttu ei tohiku seda tulemust tõlgendada tegeliku tootlikkuse prognoosina.
Näide näitab vaid seda, miks isegi üksikute etappide väga kõrge saagis ei garanteeri keemiliselt lihtsat toorprodukti mitmekümne kordumise järel.
Seetõttu on sünteesi monitooring ja saasteainete kontroll olulised kogu peptiidi sünteesimise protsessi vältel, mitte alles pärast viimase aminohappe lisamist.
Automatiseerimine, küte ja muud tehnoloogilised lahendused võivad sünteesi kiirendada, kuid protsessi kiirust tuleks alati hinnata koos toote kvaliteediga.
Mikrolainetega toetatud SPPS-i uuringus analüüsitijäägipõhist ratsemiseerumist ja aspartiimiidi moodustumist, mis näitab, miks reaktsioonitingimusi tuleb endiselt kohandada konkreetse sekundaarstruktuuri omadustega. [7]
Toorprodukti eraldamine ja taaskasutamine
Lõhestamine vabastab toote kandjalt
Pärast kavandatud järjestuse sünteesimist tuleb peptiid tavaliselt kandjast keemiliselt eraldada.
Seda etappi nimetatakse cleavage'iks ehk lõhestumiseks.
Lõhustamine katkestab spetsiaalselt kavandatud keemilise sideme peptiidi ja kandja vahel.
Sõltuvalt kasutatavast strateegiast võib lõhustumine toimuda samaaegselt külgahelate osalise või täieliku kaitserühma eemaldamisega. Teistes protsessides võib peptiid või selle fragment vabastada mõningate kaitsete säilitamisega, kui plaanitakse edasisi keemilisi muundamisi.
Sobiv vabanemiskeemia sõltub sidemest ja sihtmolekulist.
Tingimused, mis vabastavad tõhusalt ühe펩tiidi, võivad keemiliselt kahjustada teise sees olevat tundlikku rühma.
Seepärast kirjeldab lõhustamine keemilist eesmärki, mitte ühte universaalset reaktiivide või tingimuste komplekti, mis sobib kõigile peptiididele.
Samuti ei tõenda peptiidi karkassi korrektne ehitus seda, et kõik kaitserühmad eemaldati seejärel edukalt.
Ahela kokkupanek ja lõplik kaitsegruppide eemaldamine vastavad erinevatele keemilistele küsimustele ja nõuavad eraldi hinnangut.
Lõhustumistingimused võivad mõjutada lisandite profiili
Eraldumine ei pea olema keemiliselt inertne etapp.
Kaitsegruppide eemaldamine ja peptiidi kandjast vabastamine võib viia reaktiivsete keemiliste vormide tekkeni, mis on võimelised modifitseerima peptiidi või segu teisi komponente.
Seetõttu võib väljatöötatud meetodites kasutada nn püüdureid ehk aineid, mis seovad teatud soovimatuid reaktiivseid saadusi ja mõjutavad kõrvalsaaduste teket.
2019. aasta uuringus analüüsiti erinevaid püüdeseadmeid (scavengereid) eksenatiidi peptiidvaigult eraldamisel ja näidati, et nende valik mõjutas toorsaaduse kvaliteeti ja täheldatud lisandite profiili. [8]
Selle põhjal ei tohiks luua universaalset eraldamise retsepti.
Uuring näitab aga, et selle etapi tingimused võivad mõjutada toote kvaliteeti ja seetõttu tuleks neid hinnata konkreetse peptiidi ja kasutatud kaitserühmade süsteemi jaoks.
Seega on õigel eraldumisprotsessil mitu mõõdet.
Peptiid tuleb sobivalt eraldada, vajalikud kaitserühmad eemaldada, sihtmaterjal kätte saada ja soovimatuid keemilisi muutusi kontrolli all hoida.
Tooraine kättesaamine ei ole lõplik puhastamine
Pärast lõhustamist viiakse läbi protsess, mis võimaldab eraldada peptiidi sisaldava materjali tahkest vaigust ja reaktsioonisegu ülejäänud komponentidest.
Selle juures võib kasutada lahustuvuse, lenduvuse või muude keemiliste omaduste erinevusi.
Nähtava sademe või peptiide sisaldava fraktsiooni kättesaadmine ei tõesta siiski, et materjal koosneb ainult soovitud saadusest.
Selles etapis räägitakse tavaliselt toorpeptiidist.
See võib sisaldada sihtmolekuli koos deletsioonijärjestuste, lühendatud ahelate, keemiliselt modifitseeritud peptiidide, mittetäielikult deblokeeritud struktuuride, reaktiividest pärinevate materjalide ja muude lisanditega.
Üksikute saasteainete tähendus sõltub järjestusest, sünteesitingimustest ja kavandatud kasutusotstarbest.
Ühes uuringus ühendati kromatograafiline eraldamine mass spectrometry-ga, et iseloomustada toor-SPPS-saadusi ja määrata üksikud kromatograafilised piigid kindlatele peptiididele. [9]
See näitab, miks eraldus- ja struktuurimeetodite abil saadud teave täiendab üksteist.
Kromatograafia võib näidata paljude komponentide esinemist, samas kui massスペktromeetria võib anda lisateavet, mis aitab kindlaks teha, mis mõned neist võivad olla.
Identiteedi puhastamine ja kinnitamine vastavad erinevatele küsimustele
Puhastamise eesmärk on rikastada või eraldada sihtmolekul teistest komponentidest.
Identifitseerimine aga vastab küsimusele, kas eraldatud materjalil on tõepoolest oodatud keemilised omadused.
Need küsimused kattuvad osaliselt, kuid ei ole samad.
Hästi eraldunud kromatograafiline piik ei anna iseenesest täielikku tõendit molekuli struktuuri kohta.
Samamoodi ei ole oodatud molekulmassi saavutamine iseenesest täielik hinnang puhtusele ega struktuursele õigsusele.
Tihedalt seotud järjestuse variandid, stereoisomeerid või keemiliselt modifitseeritud vormid võivad olla raskesti eristatavad või eraldatavad.
Puhastusmeetodit tuleks seetõttu hinnata lähtuvalt konkreetse sünteesi käigus tegelikult tekkinud segust, mitte pidada seda piisavaks pelgalt seetõttu, et see on osutunud toimivaks mõne teise peptiidi puhul.
Kui lõppmolekul nõuab ahela koostamise järel ka disulfiidsildade moodustamist, tsükliseerimist või muud transformatsiooni, tekivad täiendavad analüütilised küsimused ühenduste õigsuse, struktuurse homogeensuse ja selle kohta, kas soovitud küps molekulikuju ka tegelikult saadi.
Eelised, piirangud ja saasteallikad
Miks SPPS on nii laialdaselt kasutusel?
Üks SPPS-i peamisi eeliseid on võime hoida kasvavat peptiidi kandjal vedelate reaktiivide korduva vahetamise ajal.
See lihtsustab korduvaid keemilisi operatsioone ja võimaldab automatiseerimist.
Keemikud saavad sisse viia plaanipärase aminohappelistest ehitusplokkidest koosneva jada ja, kui protsessi keemia seda võimaldab, ka teatud ebatavalisi aminohappeid ja muid modifikatsioone.
Kaasaegsed automaatsed süsteemid näitavad, kaugele saab seda kontseptsiooni thendada.
2020. aasta automatiseeritud voolusünteesi uuringus kirjeldati kuni 164 aminohappejääki sisaldavate valguahelate saamist. Pärast hilisemat puhastamist ja voltumist saadi funktsionaalsed materjalid. [10]
See on muljetavaldav näide tehnilistest võimalustest.
See ei tähenda siiski, et iga 164 jäägi pikkusega järjestust – ega ka iga pikka peptiidi või valku – saaks saada sama hõlpsasti.
See ei tähenda ka seda, et puhastamine ja struktuurne iseloomustus muutuksid tarbetuks.
Uuring näitab pigem, milliseid tulemusi on võimalik saavutada hoolikalt välja töötatud süsteemi abil sobivalt valitud molekulide jaoks.
Automatisatsioon kontrollib protsessi täitmist.
See ei suuda siiski muuta sobimatut keemiat sobivaks.
Seetõttu tuleb aparatuuri jõudlust, peptiidi jada ja molekuli enda käitumist analüüsida koostoimes.
Kuidas tekivad tüüpilised saasteained?
Tahke faasi peptiidsünteesi (SPPS) ajal võib saasteainete tekkeks olla mitu erinevat teed. Nende mõistmine aitab selgitada, miks lõplikud analüütilised uuringud on endiselt vajalikud.
Deletsioonijada või lühendatud produkt võib tekkida siis, kui plaanitud aminohappe liitmine ebaõnnestub või kui ahela kasv katkeb. Kuna ebaõige ahel võib vaiguga seotuks jääda, ei pruugi hilisem pesemine seda eemaldada.
Epimerisatsioon tähendab vastava tsentri stereokeemilise konfiguratsiooni muutumist. Sellel on eriline analüütiline tähendus, kuna epimeeril võib olla sama nominaalne molekulmass mis õigel peptiidil, erinedes samas ruumilise konfiguratsiooni poolest.
Aspartiimidiga seotud produktid võivad tekkida aspartaatjääke hõlmavate järjestusspetsiifiliste kõrvalreaktsioonide tulemusena. Sõltuvalt keemilisest kulust võib tekkida rohkem kui ühte tüüpi selline toode.
Kaitsegruppide mittetäielik eemaldamine toimub siis, când rühm, mis oleks tulnud eemaldada, jääb molekuliga seotuks. Seega võib peptiidil olla nominaalselt oodatud ahela pikkus, kuid sellel on siiski vale keemiline struktuur.
Lõhustamisega seotud modifikatsioone võib esineda peptiidi lõplikul vabastamisel või kaitserühmade eemaldamisel. Seega ei taga ahela õige ehitus, et peptiid läbib lõhustamisetapi muutumatult.
Mittetäielikud agregatsiooniga seotud reaktsioonid võivad aga esineda siis, kunagi moodustuvad ahelad omavahel selliselt vastastikku mõjutavad, et see piirab juurdepääsu reaktiivsetele kohtadele. Piisava koguse reaktiivi lisamine reaktsioonianumasse ei taga, et iga reaktiivne koht on füüsiliselt kättesaadav ja reageerib vastavalt.
Need on võimalikud saasteainete tekkeviisid.
See ei tähenda, et iga SPPS-meetodil saadud partii peaks sisaldama kõiki loetletud tüüpi kõrvalekaldeid.
Nende tähendus konkreetses sünteesis määratakse protsessiteadmiste, analüütiliste uuringute ja asjakohase kvaliteedikontrolli alusel.
Keerulised looduslikud peptiidid nõuavad enamat kui lihtsalt järjestuse taasesitamist
Mõned peptiidid on struktuuriliselt palju keerukamad, kui tuleneks pelgalt aminohapete lineaarsest järjestusest.
Heaks näiteks on epidermiin.
Epidermiini struktuurne karakteristika näitas mitmete väävlit sisaldavate ringide ja ebatavaliste jääkide olemasolu. [11]
Seega ei piisaks pelgalt aminohapete lineaarse järjestuse taasesitamisest tõendina, et saadud on autentne küps epidermiin.
See eristus on oluline epidermiini tahkefaasilise sünteesi teemaliste publikatsioonide või otsingute tõlgendamisel.
Publikatsioon võib kirjeldada lineaarset prekursorit, fragmenti, analoogi või muud seotud struktuuri, mitte aga kontrollitud täielikku sünteesi täielikust küpsest molekulist.
Siin viidatud [11] strukturaalne publikatsioon kirjeldab epidermiini enda omadusi; see ei ole aruanne selle täissünteesi kohta SPPS meetodil.
Väiteid täissünteesi kohta tuleb seega hinnata sihtmolekuli tegeliku struktuuri, mitte pelgalt selle lineaarse aminohappejärjestuse alusel.
Jõudlust, puhtust ja identiteeti tuleb esitada eraldi
Kolm mõistet, mida peptiidide sünteesi aruteludes sageli segamini aetakse, on saagis, puhtus ja identsus.
Taastatud toote suur mass ei tähenda tingimata, et suurem osa sellest materjalist on soovitud peptiid. Toormaterjal võib sisaldada märkimisväärsel hulgal lisandeid.
Samaväärselt kõrge kromatograafiline puhtus ei kinnita automaatselt struktuurilise identsuse kõiki aspekte.
Isegi peptiid, mille keemiline struktuur on täpselt kindlaks tehtud, ei saa sellega automaatselt kinnitatud bioloogilist, terapeutilist ega kliinilist rakendust.
Need on eraldi teemad.
Põhjalik sünteesi kirjeldus peaks seega näitama, milline oli sihtmolekul, millises etapis määrati saagis, kas analüüsitud materjal oli puhastamata või puhastatud ning milliseid analüütilisi andmeid kasutati struktuuriväidete kinnitamiseks.
Tänu sellele saab sünteesi tulemusi tõlgendada ja võrrelda usaldusväärsemalt.
Üksikut protsendimäära või massiväärtust ei tohiks ilma teadmiseta selle kohta, mida tegelikult mõõdeti, muuta üldiseks väiteks, et peptiid on „kõrge kvaliteediga”.
Korduma kippuvad küsimused
1. Miks kasutatakse SPPS-is tahket faasi?
Tahke faas hoiab kasvavat peptiidi kandjal, samas kui lahustuvad reaktiivid, reaktsiooni kõrvalsaadused ja pesulahused on mitmekordselt sisse viidavad ja eemaldatavad. See lihtsustab oluliselt korduvat ahela koostamist ja võimaldab peptiidide sünteesi automatiseerimist, mille näiteks on tänapäevased automatiseeritud voolusünteesi meetodid. [10] Kandja ei taga siiski, et iga reaktsioon kulgeb ideaalselt, ega eralda valesti ehitatud vaiguga seotud ahelat õigest. Selle peamine eelis on protsessi juhtimise tõhustamine. Keemiline selektiivsus, reaktsiooni täielikkus, puhtus ja struktuurne identsus vajavad siiski eraldi hindamist.
2. Kas tahke faasi süntees välistab vajaduse puhastamise järele?
Ei. Valepeptiidahelad võivad sünteesi ajal vaigule seotuks jääda ja seejärel koos soovitud tootega vabastada. Uuringud, milles analüüsitakse tahkefaasilise peptiidsünteesi (SPPS) toorsaadusi kromatograafia ja mass spectrometry abil, näitavad, et sünteesijärgne pesu ja lõplik puhastamine täidavad erinevaid funktsioone. [9] Pesemine eemaldab eelkõige vaiki ümbritsevad lahustuvad komponendid, samas kui vaigult eraldamise järgne puhastamine peab eraldama soovitud peptiidi soovimatutest peptiidsetest ja mittepeptiidsetest komponentidest. SPPS lihtsustab vaheoperatsioone, kuid ei garanteeri lõplikku puhtust.
3. Kas „tahke faas” tähendab, et lahustit ei kasutata?
Ei. Konventsionaalses tahke faasi peptiidide sünteesis (SPPS) on lahustumatu kandja tavaliselt ümbritsetud vedelate reaktiivide ja lahustitega. Lahustid mõjutavad vaigu füüsilist keskkonda, muu hulgas selle paisumisastet ja seda, kui kergesti reaktiivid pääsevad kinnitunud ahelateni. Eksperimentaalsed uuringud on näidanud lahustist sõltuvat vaikude paisumist ning muutusi, mis on seotud linkerkeemia, substitutsiooni astme ja ahela pikendamisega. [2] Vaik ja lahusti moodustavad seega üheskoos reaktsioonikeskkonna.
4. Millises suunas peptiid SPPS-i käigus kasvab?
Konventsionaalne astmeline SPPS ehitab peptiidi tavaliselt selle C-otsa jäägist N-otsa suunas. Esimene aminohape, millest peab saama valmis molekuli C-ots, seotakse kandjaga ja järgmised jäägid pikendavad ahela vaba aminorühma. Avaldatud Fmoc-põhised meetodid näitavad seda tüüpilist skeemi. [1] Siiski on olemas spetsiaalsed tahke faasi strateegiad, mis võivad kulgeda teisiti.
5. Kas vaik ja ühendusdetail tähendavad sama asja?
Ei. Vaik on lahustumatu kandja, samas kui linker on keemiline ühendus kandja ja kasvava peptiidi vahel. Linkeri funktsionaalsus võib sõltumatult polümeerist endast mõjutada seondumist, vaigu käitumist ja peptiidi hilisemat vabastamist. Peptiidsünteesis kasutatavate kandjate uuringud näitavad, miks ainuüksi vaigu tüübi määramisest ei pruugi kogu süsteemi käitumise kirjeldamiseks piisata. [2]
6. Kas vaigu suurem asendusaste suurendab alati tootmist?
Ei. Suurem laadumine tähendab suuremat hulka võimalikke kinnituskohti teatud hulga kandja kohta, kuid see ei pruugi viia suurema koguse õigesti ehitatud ja taastatava peptiidi saamiseni. Asendusaste võib muuta kohalikku molekulaarset keskkonda ja seda on eksperimentaalselt näidatud kui ühte vaigu paisumist mõjutavat tegurit. [2] Kui seotud ahelad on liiga tihedad või interakteeruvad tugevalt omavahel, võib reaktiivsete kohtade kättesaadavus halveneda. Seetõttu tuleb laadimist analüüsida koos vaigu omaduste, järjestuse käitumise, reaktsiooni saagise ja lõpptoote kvaliteediga.
7. Miks aminohapped peptiidi sünteesil kaitstakse?
Kaitserühmad takistavad ajutiselt teatud reaktiivsete rühmade osalemist reaktsioonides konkreetse sideme moodustumise ajal. See võimaldab ahela kontrollitud, astmelist sünteesi. Kaitse aga ei välista kõiki kõrvalreaktsioone. Uuringud mudelsüsteemidega on näidanud näiteks, et kaitserühmade strateegia ja ümbritsev järjestus võivad mõjutada aspartimiidi teket. [5] Kaitserühmad tagavad seega keemilise selektiivsuse, kuid kogu kaitsmise ja eemaldamise strateegia nõuab siiski hoolikat planeerimist ja hindamist.
8. Mida tähendab funktsionaalrühmade ortogonaalne kaitse?
Ortogonaalsus tähendab võimalust eemaldada üks kaitserühm tingimustes, mis jätavad teised vajalikud kaitsekihid piisavalt puutumatuks. See võimaldab paljastada spetsiifilisi reaktsioonivõimelisi kohti sünteesi planeeritud etappides. Väljakujunenud SPPS-i meetodid põhinevad pigem kontrollitud kaitsmisel ja dekaitsmisel kui kõigi reaktsioonivõimeliste rühmade üheaegsel paljastamisel. [1] Kasutatud kaitserühmade tegelik sobivus sõltub siiski sihtmolekulist ja reaktsioonitingimustest.
9. Kas Fmoc ja Boc tähendavad erinevat tüüpi peptiide?
Ei. Fmoc ja Boc on kaitserühmad ja nendega seotud sünteesistrateegiad, mitte peptiidahela eri tüübid. Erinevused nende eemaldamise keemias mõjutavad sünteesi läbiviimise viisi, kuid ajutist kaitserühma keemiat ei tohiks segi ajada sihtpeptiidi lõpliku struktuuriga. Avaldatud Fmoc-põhised meetodid näitavad ühte levinumat SPPS-i varianti, kuid see ei tähenda, et iga peptiid peaks olema saadud selle meetodiga. [1]
10. Kas juba esimene liitumisetapp võib tuua kaasa reostuse?
Jah. Liitmise etapp võib mõjutada stereokeemilist kvaliteeti juba enne korduva ahela pikendamise algust. On välja töötatud analüütilised meetodid, mis on ette nähtud spetsiaalselt ratsemise määramiseks kaitstud aminohapete liitmisel vaikude külge. [3] See ei tähenda, et iga liitmine põhjustaks olulist ratsemisust. Kuid see näitab, et liitmine ise on keemiliselt oluline etapp, mille käigus võivad ilmneda mõõdetavad muutused, mida tuleb üldises kvaliteedihinnangus arvesse võtta.
11. Miks mõningaid peptiidijärjestusi nimetatakse rasketeks?
Mõned kasvavad peptiidahelad interakteeruvad omavahel või naaberahelatega viisil, mis piirab juurdepääsu reaktiivsetele kohtadele. Vesiniksidemed, hüdrofoobsed koostoimed ja agregatsioonilaadne käitumine võivad raskendada hilisemat sidestamist. Agregatsioonitundlike järjestuste uuringud näitavad, et sidestusviisi muutmine võib mõjutada toorprodukti koostist. [4] Seega sõltub sünteesi keerukus molekuli omadustest ja reaktsioonitingimustest, mitte pelgalt peptiidi pikkusest.
12. Kas kiirem süntees tähendab alati paremat toodet?
Ei. Sünteesi kiirus ja toote kvaliteet on eraldiseisvad parameetrid. Kuumutamine, mikrolaineahju tugi ja automatiseerimine võivad protsessi aega lühendada, kuid reaktsiooni kiirendamine võib muuta ka tasakaalu soovitud ja kõrvalreaktsioonide vahel. Mikrolaineahju abil läbi viidud sünteesi uuringud on näidanud jääktüübist sõltuvat ratsemiseerumist ja aspartiimidi moodustumist, mis viitab tingimuste asjakohase kontrolli vajadusele. [7] Lühem sünteesiaeg on kasulik ainult siis, kui saadud materjal vastab ka nõutavatele keemilistele ja analüütilistele kriteeriumidele.
13. Kas eraldamine tähendab lihtsalt vaiguterade eemaldamist?
Ei. Eraldamine on keemiline protsess, mis viib peptiidi ja kandja vahelise kavandatud sideme katkemiseni. Vaiguterade eemaldamine filtreerimise teel on aga füüsilise eraldamise operatsioon ja see üksi ei kinnita eraldamiskeemia õiget kulgu. Peptiidi vabanemine võib toimuda samaaegselt kaitserühmade eemaldamise ja teiste reaktsioonidega. Eraldamise ajal kasutatavate püüdjate (scavenger'ite) uuringud näitavad, et see etapp võib mõjutada lisandite profiili. [8]
14. Kas toorprodukti kõrge saagikus tähendab peptiidi kõrget puhtust?
Ei. Toores saagis kirjeldab tagastatud materjali kogust enne kõigi soovimatute komponentide eemaldamist. See materjal võib sisaldada sihtpeptiidi koos deletsioonijärjestuste, modifitseeritud struktuuride, allesjäänud kaitserühmade ja muude lisanditega. SPPS-i toorsegude uuringud kromatograafia ja mass spectrometry abil näitavad, miks saadud mass, puhtus ja molekulaarne identiteet nõuavad eraldi tõlgendamist. [9] Usaldusväärselt esitatud saagis peaks seega näitama etappi, milles see mõõdeti, ja seda, kas materjal oli juba puhastatud.
15. Kas SPPS võimaldab saada pikki peptiidahelaid?
Jah. Hoolikalt välja töötatud SPPS-meetodid võivad võimaldada saada väga pikki ahelaid. Automatiseeritud voolusünteesi uuringutes on saadud ahelaid, mis sisaldavad kuni 164 jääki, mida seejärel enne funktsionaalset hindamist puhastati ja volditi. [10] See näitab kaasaegse peptiidisünteesi võimalusi, kuid ei tähenda, et mis tahes sarnase pikkusega järjestust saaks sama saagisega. Pikkus on vaid üks tegur; olulised on ka järjestusesõltuv agregeerumine, kõrvalreaktsioonid, voltimisnõuded ja puhastamise keerukus.
16. Kas epidermiini järjestuse ülesehitamine tähendab selle täieliku sünteesi läbiviimist?
Ei. Küps epidermiin sisaldab ebatüüpilisi struktuurseid elemente, sealhulgas väävlit sisaldavaid ringe, mis ulatuvad kaugemale pelgalt aminohapete lineaarsest järjestusest. Seda on tõestatud struktuuriuuringutes. [11] Lineaarse järjestuse, prekursorite või fragmendi saamine ei tähenda seega automaatselt täieliku küpse molekuli sünteesi. Väide täieliku sünteesi kohta nõuab analüütilisi andmeid, mis kinnitavad kavandatud sidemete ja muude oluliste struktuursete elementide taastamist.
17. Kas eeldatav molekulmass kinnitab struktuuri täielikku õigsust?
Ei. Oodatud molekulmassi saamine on väärtuslik teave, kuid mass üksi ei kinnita peptiidi struktuuri kõikipekte ega välista kõiki olulisi lisandeid. Kahel molekulil võib olla sama nominaalne mass, kuid samas võivad need erineda stereokeemia või spetsiifilise struktuuripaigutuse poolest. Epimeerseid peptiide hõlmavad uuringud näitavad, miks stereokeemilised erinevused võivad nõuda analüütilisi meetodeid, mis suudavad eristada struktuure, mida ei saa eristada pelgalt massi mõõtmise teel. [12] Lõplik iseloomustus tuleks seega kavandada, võttes arvesse realistlikke lisandeid ja alternatiivseid struktuure, mis võivad konkreetse sünteesi käigus tekkida.
Kokkuvõte
Tahke faasi peptiidide süntees muutis peptiidikeemiat, võimaldades kasvavat ahelat hoida lahustumatul kandjal lahustuvate reaktiivide korduva lisamise, reaktsioonideläbiviimise ja eemaldamise ajal. See hõlbustab järjestuse astmelist ehitamist ja on automaatse sünteesi praktiliseks aluseks.
Selle meetodi näiv lihtsus ei tohiks siiski varjutada igas etapis toimuvat keemiat.
Vaik, linker ja asendusaste mõjutavad sünteesikeskkonna olulisi omadusi. Lahustist sõltuv paisumine mõjutab ligipääsu vaiguga seotud ahelatele. Kaitserühmad kontrollivad, millised funktsionaalrühmad saavad reageerida, samas kui sidestusreaktsioonid ehitavad peptiidi selgroogu jääk haaval. [1] [2]
Igal neist etappidest on samuti oma piirangud.
Esialgne ühendus võib mõjutada stereokeemilist kvaliteeti. [3] Rasked järjestused võivad agregeeruda ja piirata reaktiivide juurdepääsu. [4] Kaitserühmade lisamise ja eemaldamise keemia võib soodustada kõrvalreaktsioone, näiteks aspartimiidi moodustumist. [5] [6] Kiirendatud sünteesitingimused võivad muuta ratsemise astet või lisandite profiili. [7] Eraldustingimused võivad täiendavalt mõjutada toorsaaduse koostist. [8]
Seepärast ei võrdu ahela õige ülesehitamine puhta ja õigesti identifitseeritud peptiidi saamisega.
Toorprodukti kättesaadamine, puhastamine ja struktuurne karakteriseerimine jäävad eraldiseisvateks etappideks. Kromatograafia võib anda teavet segu koostise ja puhtuse kohta, samas kui mass spectrometry ja muud analüütilised meetodid annavad teavet identiteedi kohta. Ükski analüütiline tulemus ei pea kinnitama peptiidi struktuuri kõiki aspekte. [9] [12]
Kaasaegne automatiseeritud voolusüntees näitab, et sobivalt välja töötatud tingimuste korral saab SPPS-i rakendada isegi väga pika ahela korral. [10] Samas näitavad struktuurselt keerulised peptiidid, nagu epidermiit, miks pelgalt lineaarse aminohappejärjestuse taastamisest ei pruugi piisata, kui küps molekul sisaldab täiendavaid ringe, ebatüüpilisi jääke või kindlat sidemete paigutust. [11]
SPPS-i on kõige parem mõista mitte üksiku reaktsioonina, vaid eraldiseisvate keemiliste ja analüütiliste etappide järjestusena.
Ühendamine määrab alguspunkti. Korduvad kaitsmise, kaitsest vabastamise ja sidumise tsüklid ehitavad kavandatud ahela. Äralõikamine vabastab toote. Puhastamine eraldab sihtmolekuli soovimatutest komponentidest. Lõplik iseloomustamine võimaldab seejärel kindlaks teha, kas eraldatud materjalil on tõepoolest sellele omistatud struktuur ja kvaliteet.
Nende etappide eristamine aitab vältida mitmeid sagedasi arusaamatusi: edukas süntees ei kinnita automaatselt puhtust, kõrge saagis ei kinnita automaatselt identsust ning oodatud molekulmass üksi ei tõenda täielikku struktuurilist õigsust.
Viited
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Tahke faasi peptiidsüntees: Standardsetest protseduuridest raskete järjestuste sünteesini. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K., & Willway, H. (2020). Investigation of parameters that affect resin swelling in green solvents. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Use of Marfey’s reagent to quantitate racemization upon anchoring of amino acids to solid supports for peptide synthesis. Analytical Biochemistry, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluation of combined use of Oxyma and HATU in aggregating peptide sequences. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Aspartimiidiprobleem Fmoc-põhises SPPS-is. I osa. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Aspartiimiidiprobleem Fmoc-põhises SPPS-is. II osa. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J. ja Collins, J. M. (2007). Ratsemiseerumise ja aspartimiidi tekke piiramine mikrolaineahjus kiirendatud Fmoc-tahkfaasi peptiidisünteesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benseendimetaantiool (1,4-BDMT) püünisainena peptiidide vaigu keskkonnasõbralikumaks eraldamiseks. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). The characterization of crude products from solid-phase peptide synthesis by mu-HPLC/fast atom bombardment mass spectrometry. Peptiidide uuringud, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E., & Pentelute, B. L. (2020). Synthesis of proteins by automated flow chemistry. Teadus, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: Sequencing of a heterodetic tetracyclic 21-peptide amide antibiotic. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Racemisatsiooni uuringud peptiidide sünteesis kaitstud epimeersete peptiidide eraldamise teel faasivastase kõrgsurve vedelikkromatograafia abil. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x