Synteza peptydów na fazie stałej, określana najczęściej skrótem SPPS (solid-phase peptide synthesis), jest chemiczną metodą budowania peptydów aminokwas po aminokwasie, podczas gdy jeden koniec powstającego łańcucha pozostaje chemicznie związany z nierozpuszczalnym nośnikiem.
Zamiast izolować powstający peptyd po każdej reakcji, chemicy pozostawiają go przyłączonego do fazy stałej, wprowadzając i usuwając kolejne ciekłe odczynniki oraz roztwory przemywające. Powtarzające się cykle umożliwiają odsłonięcie reaktywnej grupy aminowej, przyłączenie kolejnego aminokwasu i usunięcie rozpuszczalnych składników, które nie są już potrzebne. Po zbudowaniu zaplanowanej sekwencji aminokwasowej peptyd można odłączyć od nośnika, a następnie poddać dalszej obróbce i analizie.
Taka organizacja procesu jest jednym z głównych powodów, dla których SPPS stała się tak ważną metodą w chemii peptydów. Faza stała upraszcza wykonywanie wielu powtarzalnych operacji chemicznych i umożliwiła automatyzację syntezy.
Wygoda syntezy na fazie stałej nie oznacza jednak gwarancji chemicznej doskonałości.
Przyłączenie powstającego peptydu do nośnika nie gwarantuje, że każdy łańcuch otrzyma wszystkie zaplanowane aminokwasy. Nie oznacza również, że materiał uwolniony na końcu procesu będzie chemicznie czysty lub będzie miał prawidłową strukturę.
Składanie łańcucha, odszczepianie i odzyskiwanie produktu, oczyszczanie, potwierdzanie tożsamości oraz końcowa charakterystyka strukturalna są odrębnymi częściami całego procesu.
Współczesne publikacje metodologiczne pokazują zarówno użyteczność SPPS, jak i konieczność modyfikowania standardowych metod w przypadku trudnych sekwencji. W jednej z opublikowanych metod wykorzystujących strategię Fmoc opisano na przykład rutynową syntezę, ale także zmodyfikowane podejście do sekwencji peptydowych podatnych na agregację. [1]
Zrozumienie SPPS wymaga więc czegoś więcej niż zapamiętania kolejnych etapów chemicznych. Trzeba również wiedzieć, jaki jest cel każdego etapu, co może podczas niego pójść nieprawidłowo i na jakie pytania analityczne nadal trzeba odpowiedzieć po jego zakończeniu.
Czym jest synteza peptydów na fazie stałej?
Powstający peptyd pozostaje przyłączony, a zmieniają się roztwory
W konwencjonalnej SPPS peptyd jest chemicznie przyłączony do niewielkich nierozpuszczalnych cząstek, nazywanych zwykle ziarnami żywicy, za pomocą odpowiedniego łącznika chemicznego.
Ziarna pozostają w układzie reakcyjnym, podczas gdy kolejne ciekłe odczynniki i roztwory przemywające są wprowadzane i usuwane.
Znacznie upraszcza to powtarzalną syntezę.
W klasycznej, etapowej syntezie w roztworze izolowanie i oczyszczanie rosnącego peptydu po każdym przyłączeniu aminokwasu może być uciążliwe. W SPPS powstający łańcuch pozostaje związany z nierozpuszczalną fazą. Dzięki temu rozpuszczalne nadmiary odczynników i wiele produktów ubocznych można usuwać poprzez przemywanie, podczas gdy peptyd związany z żywicą pozostaje na miejscu.
Określenie „faza stała” może jednak prowadzić do nieporozumień.
Nie oznacza ono, że tworzenie wiązań peptydowych zachodzi bez udziału cieczy czy rozpuszczalnika.
Żywica jest zwykle otoczona ciekłym środowiskiem reakcyjnym, a jej oddziaływanie z rozpuszczalnikiem może istotnie wpływać na przebieg syntezy. Odczynniki nadal muszą przemieszczać się w środowisku polimerowym lub wokół niego i docierać do reaktywnych miejsc rosnącego peptydu.
Przyłączenie peptydu do nośnika ma zazwyczaj charakter kowalencyjny. Oznacza to, że powstająca cząsteczka jest połączona z nośnikiem poprzez łącznik za pomocą wiązania chemicznego.
Peptyd nie jest więc po prostu uwięziony pomiędzy cząstkami, zatrzymany przez filtr czy luźno osadzony na powierzchni.
Takie połączenie chemiczne jest celowo projektowane w taki sposób, aby powstający łańcuch pozostawał związany podczas kolejnych reakcji i etapów przemywania, a później mógł zostać uwolniony w odpowiednich warunkach.
Konwencjonalna synteza przebiega od C-końca w kierunku N-końca
Klasyczna liniowa strategia SPPS zazwyczaj rozpoczyna się od aminokwasu, który w gotowym peptydzie będzie stanowił jego C-koniec.
Reszta ta zostaje przyłączona do nośnika.
Po odsłonięciu odpowiedniej reaktywnej grupy aminowej wprowadza się kolejny zabezpieczony aminokwas i chemicznie przyłącza do powstającego łańcucha. Powtarzanie tego procesu stopniowo wydłuża peptyd w kierunku N-końca.
Warto podkreślić ten kierunek, ponieważ różni się on od biologicznej syntezy białek przez rybosomy.
Synteza rybosomalna wydłuża polipeptyd od N-końca w kierunku C-końca. Konwencjonalna etapowa SPPS zazwyczaj buduje sekwencję w przeciwnym kierunku.
Końcowa sekwencja aminokwasów może być jednak identyczna. Różni się sposób jej zbudowania.
Istotne jest tutaj określenie „konwencjonalna”, ponieważ chemia peptydów obejmuje również wyspecjalizowane strategie wykorzystujące alternatywne miejsca przyłączenia, składanie fragmentów, reakcje ligacji i inne niestandardowe rozwiązania.
Opis kierunku od C- do N-końca odnosi się więc do typowego etapowego procesu SPPS, a nie do wszystkich możliwych metod chemii peptydów wykorzystujących fazę stałą.
SPPS jest tylko jednym z elementów wytwarzania peptydów
Synteza na fazie stałej nie jest jedynym sposobem otrzymywania peptydów.
Peptydy mogą być również otrzymywane poprzez syntezę chemiczną w roztworze, biologiczne systemy ekspresyjne, przemiany enzymatyczne, ligację fragmentów lub kombinacje różnych metod.
SPPS jest szczególnie użyteczna, gdy potrzebne jest kontrolowane składanie sekwencji oraz wykorzystanie zabezpieczonych, zmodyfikowanych lub w inny sposób specjalistycznych aminokwasowych bloków budulcowych.
Nawet w ramach jednego projektu dotyczącego konkretnego peptydu nie zawsze trzeba stosować tę samą metodę od początku do końca.
Poszczególne fragmenty peptydu mogą na przykład zostać zsyntetyzowane na żywicy, osobno oczyszczone, a następnie połączone inną metodą chemiczną. Inne cząsteczki mogą wymagać fałdowania, utleniania, cyklizacji lub dodatkowych przemian strukturalnych już po uzyskaniu początkowej liniowej sekwencji.
Wybór odpowiedniej drogi zależy więc od docelowej cząsteczki, jej złożoności strukturalnej oraz wymagań analitycznych i jakościowych projektu.
Proces warto rozpatrywać jako serię kolejnych pytań.
Przyłączenie do nośnika wyznacza punkt początkowy i wpływa na późniejszą chemię uwalniania produktu. Nadal trzeba jednak ustalić, czy przyłączenie nastąpiło prawidłowo i czy zachowana została integralność stereochemiczna.
Składanie łańcucha ma doprowadzić do przyłączania aminokwasów w zaplanowanej kolejności. Następnie trzeba jednak sprawdzić, czy wszystkie łańcuchy zareagowały prawidłowo i czy nie powstały sekwencje z brakującymi aminokwasami, produkty skrócone lub zmodyfikowane.
Odszczepianie i usuwanie grup ochronnych mają uwolnić peptyd oraz usunąć określone zabezpieczenia chemiczne. Samo skuteczne uwolnienie produktu nie mówi jednak, jakie inne substancje znajdują się w surowym materiale.
Oczyszczanie służy oddzieleniu pożądanego materiału od niepożądanych składników, ale nawet oczyszczona frakcja nadal wymaga potwierdzenia tożsamości i oceny jakości.
Końcowa charakterystyka strukturalna i analityczna ma natomiast odpowiedzieć na pytanie, czy wyizolowany materiał ma właściwości chemiczne oczekiwane dla docelowego peptydu i czy zastosowane metody analityczne są odpowiednie dla zamierzonego zastosowania.
Są to etapy koncepcyjne, a nie instrukcja laboratoryjna. Konkretne odczynniki, aparatura i warunki reakcji zależą od docelowego peptydu i wymagają odpowiednio opracowanej oraz zwalidowanej metody.
Przyłączenie do żywicy i składanie łańcucha
Żywica, łącznik i stopień podstawienia pełnią różne funkcje
W dyskusjach dotyczących SPPS często pojawiają się trzy terminy: żywica, łącznik i stopień podstawienia, czyli loading.
Opisują one powiązane, ale różne właściwości.
Żywica jest nierozpuszczalnym materiałem stanowiącym nośnik.
Łącznik zapewnia chemiczne połączenie pomiędzy tym nośnikiem a peptydem lub pierwszą resztą aminokwasową. Jego chemia może wpływać zarówno na sposób przyłączenia peptydu, jak i na późniejsze jego uwalnianie.
Loading opisuje natomiast liczbę reaktywnych miejsc przyłączenia w odniesieniu do ilości nośnika.
Pojęcia te nie są synonimami.
Dwie żywice mogą wyglądać fizycznie bardzo podobnie, a jednocześnie mieć odmienne grupy funkcyjne, łączniki lub stopień podstawienia. Różnice te mogą wpływać na dostępność reaktywnych miejsc podczas składania łańcucha, pęcznienie żywicy oraz chemiczną postać końcowego peptydu po odszczepieniu.
Kolejnym ważnym elementem jest planowana grupa na C-końcu.
Różne układy nośnik–łącznik mogą być dobierane na przykład w taki sposób, aby otrzymać peptyd zakończony grupą karboksylową albo amidową.
Jest to istotna różnica chemiczna.
Zmiana grupy terminalnej oznacza zmianę samej cząsteczki, a nie tylko sposobu jej zapakowania czy opisania.
Pęcznienie wpływa na dostęp do przyłączonych łańcuchów
Wiele żywic stosowanych w SPPS pochłania rozpuszczalnik i pęcznieje po kontakcie z odpowiednim ciekłym środowiskiem.
Zmienia to środowisko polimerowe i może zwiększać lub zmniejszać przestrzeń, przez którą rozpuszczone odczynniki muszą się przemieszczać, aby dotrzeć do związanych z żywicą łańcuchów peptydowych.
Pęcznienie nie jest więc wyłącznie ciekawostką fizyczną.
Może wpływać na dostępność reaktywnych grup podczas syntezy.
Systematyczne badanie nośników opartych na polistyrenie i PEG wykazało, że takie właściwości jak rodzaj łącznika i stopień podstawienia żywicy istotnie wpływały na pęcznienie w badanych bardziej ekologicznych rozpuszczalnikach. Stwierdzono również, że pęcznienie może zmieniać się podczas usuwania grup ochronnych oraz w miarę wydłużania łańcucha peptydowego. [2]
Pokazuje to, że zachowania żywicy nie zawsze można traktować jako jej stałej właściwości.
W praktyce zależy ono od współdziałania żywicy, rozpuszczalnika, łącznika, przyłączonego peptydu oraz aktualnego etapu syntezy.
Dobre pęcznienie lub korzystny przebieg reakcji dla jednej kombinacji żywicy, rozpuszczalnika i peptydu nie oznaczają więc, że inna kombinacja będzie zachowywała się identycznie.
Sam etap przyłączenia również wymaga kontroli jakości
Pierwszy etap przyłączenia może wydawać się prosty, ponieważ łańcuch peptydowy dopiero zaczyna powstawać.
Błąd wprowadzony na tym etapie może jednak pozostać obecny podczas całej późniejszej syntezy.
Jeżeli pierwsza reszta zostanie przyłączona nieprawidłowo albo podczas tego procesu zmieni się jej konfiguracja stereochemiczna, prawidłowe dodanie wszystkich kolejnych reszt nie musi naprawić początkowego problemu.
W badaniu z 1992 r. opracowano metodę analityczną przeznaczoną specjalnie do pomiaru racemizacji zachodzącej podczas przyłączania zabezpieczonych aminokwasów do nośników stałych. [3]
Znaczenie tej pracy wykracza poza samą zastosowaną metodę analityczną.
Pokazuje ona, że jakość stereochemiczna może wymagać kontroli jeszcze przed rozpoczęciem powtarzających się cykli wydłużania łańcucha.
Również ilość materiału początkowo przyłączonego do nośnika wymaga właściwej interpretacji.
Nominalny stopień podstawienia żywicy, loading zmierzony eksperymentalnie, ilość surowego materiału odzyskanego po odszczepieniu oraz końcowa wydajność wyizolowanego i oczyszczonego peptydu są różnymi wielkościami.
Nie należy traktować ich jako zamiennych wskaźników powodzenia syntezy.
Dłuższe łańcuchy mogą stawać się trudniej dostępne
W miarę wydłużania łańcucha peptydowego sama przyłączona cząsteczka zaczyna wpływać na swoje środowisko chemiczne.
Sąsiednie łańcuchy mogą oddziaływać ze sobą poprzez wiązania wodorowe, oddziaływania hydrofobowe i inne siły międzycząsteczkowe. Niektóre sekwencje mogą wykazywać szczególnie silną tendencję do takich oddziaływań.
Może to ograniczać dostęp do reaktywnych grup.
W takiej sytuacji przyłączenie kolejnego aminokwasu może stać się trudniejsze, nawet jeżeli do układu wprowadzono pozornie wystarczającą ilość odczynnika sprzęgającego.
W badaniu dotyczącym trudnych, podatnych na agregację sekwencji porównano różne metody sprzęgania i przeanalizowano otrzymane produkty surowe. Wyniki wspierają zasadę, że proces powinien być dostosowywany do konkretnej sekwencji, zamiast zakładać istnienie jednej strategii sprzęgania, która zawsze jest najlepsza. [4]
Wyjaśnia to również, dlaczego samo zwiększenie stopnia podstawienia żywicy lub ilości odczynnika nie rozwiązuje automatycznie wszystkich problemów.
Jeżeli podstawowym problemem jest ograniczony dostęp do reaktywnych miejsc, ważniejsze od pytania o ilość dodanego odczynnika staje się pytanie, czy rzeczywiście dotarł on do odpowiednich miejsc i czy reakcja zaszła wydajnie bez powstawania niedopuszczalnej ilości produktów ubocznych.
Zabezpieczanie, usuwanie grup ochronnych i sprzęganie
Grupy ochronne kontrolują miejsce zachodzenia reakcji
Aminokwasy zawierają grupy chemiczne zdolne do uczestniczenia w różnych reakcjach.
Podczas kontrolowanego składania peptydu chemicy chcą zazwyczaj, aby określona grupa aminowa reagowała z konkretnym blokiem zawierającym grupę karboksylową, podczas gdy inne potencjalnie reaktywne miejsca pozostają czasowo nieaktywne.
Właśnie temu służą grupy ochronne.
Tymczasowo blokują wybrane miejsca reaktywne, pozwalając innemu miejscu uczestniczyć w zaplanowanej reakcji.
W powszechnie stosowanej strategii SPPS opartej na Fmoc końcowa grupa aminowa rosnącego łańcucha pozostaje zabezpieczona pomiędzy kolejnymi etapami przyłączania. Gdy ma zostać dołączony następny aminokwas, tymczasową ochronę usuwa się, odsłaniając grupę aminową.
Reaktywne łańcuchy boczne mogą posiadać osobne grupy ochronne, zaprojektowane tak, aby pozostały nienaruszone podczas powtarzających się cykli budowania głównego łańcucha.
Celem jest kontrolowana selektywność.
Odpowiedni blok zawierający grupę karboksylową powinien połączyć się z odpowiednią grupą aminową, zamiast prowadzić do niekontrolowanego rozgałęziania lub innych konkurencyjnych reakcji.
Ortogonalność oznacza możliwość selektywnego usuwania zabezpieczeń
Ortogonalna strategia grup ochronnych pozwala usunąć jedną grupę ochronną w warunkach, w których inne potrzebne zabezpieczenia pozostają w wystarczającym stopniu nienaruszone.
Daje to chemikowi możliwość kontrolowanego odsłaniania różnych miejsc reaktywnych na poszczególnych etapach syntezy.
Fmoc i Boc są dobrze znanymi określeniami w chemii peptydów, ale nie oznaczają różnych rodzajów wiązań peptydowych ani różnych końcowych struktur peptydu.
Są to grupy ochronne związane z różnymi strategiami syntezy i różnymi metodami ich usuwania.
Tymczasową drogę chemiczną stosowaną podczas budowania peptydu należy więc odróżnić od jego ostatecznej struktury.
Zabezpieczenia nie stanowią również pełnej ochrony przed wszystkimi możliwymi reakcjami ubocznymi.
Badania nad powstawaniem aspartimidu pokazują na przykład, że strategia zabezpieczania, sąsiednie reszty aminokwasowe oraz warunki usuwania grup ochronnych mogą wpływać na powstawanie zanieczyszczeń nawet w dobrze poznanych metodach SPPS. [5] [6]
Strategia grup ochronnych ogranicza więc określone niepożądane reakcje, ale nie eliminuje potrzeby kontroli procesu ani końcowej charakterystyki analitycznej.
Sprzęganie tworzy kolejne wiązanie amidowe szkieletu peptydu
Reakcja sprzęgania prowadzi do utworzenia kolejnego wiązania amidowego w szkielecie peptydu.
Blok aminokwasowy zawierający grupę karboksylową jest zazwyczaj aktywowany chemicznie, aby mógł skutecznie reagować z odsłoniętą grupą aminową rosnącego peptydu związanego z żywicą.
Po zakończeniu sprzęgania rozpuszczalny nadmiar materiału można usunąć przez przemywanie.
Nowo przyłączony aminokwas staje się wtedy końcową resztą rosnącego łańcucha. Następnie można odsłonić jego grupę aminową i rozpocząć kolejny cykl sprzęgania.
Teoretycznie powtarzanie tej sekwencji pozwala kontrolować kolejność aminokwasów poprzez kontrolowanie kolejności wprowadzania bloków budulcowych.
W praktyce istnieje jednak bardzo ważne zastrzeżenie:
zaplanowana reakcja chemiczna musi rzeczywiście przebiec prawidłowo w każdym cyklu.
Jeżeli jedno sprzęganie jest niepełne, część łańcuchów może nie otrzymać zaplanowanej reszty.
Jeżeli pozostaną one przyłączone do żywicy i prawidłowo zareagują w kolejnym cyklu, mogą powstać sekwencje delecyjne, czyli cząsteczki peptydu pozbawione jednego lub kilku zaplanowanych aminokwasów.
Inne łańcuchy mogą pozostać skrócone.
Przemywanie usuwa rozpuszczalne odczynniki i produkty uboczne, ale nie eliminuje selektywnie wszystkich nieprawidłowo zbudowanych łańcuchów, które nadal są kowalencyjnie związane z nośnikiem.
Niewielkie straty mogą się kumulować w wielu cyklach
Powtarzalny charakter SPPS prowadzi do istotnego problemu matematycznego.
Niewielka niedoskonałość pojedynczego etapu może wydawać się nieistotna, ale po wielu powtórzeniach jej skutki mogą się kumulować.
Rozważmy prosty przykład matematyczny.
Jeżeli synteza peptydu wymagałaby 50 etapów sprzęgania, a każdy z nich miałby niezależnie 99% prawdopodobieństwa prawidłowego zakończenia, teoretyczny odsetek cząsteczek, które pomyślnie przeszłyby wszystkie 50 etapów, wynosiłby około 60,5%.
Jest to jedynie ilustracja.
Zakłada ona, że wszystkie etapy zachowują się identycznie i niezależnie. Nie uwzględnia problemów z usuwaniem grup ochronnych, reakcji ubocznych, strat podczas odszczepiania i oczyszczania, agregacji ani wielu innych rzeczywistych czynników.
Nie należy więc interpretować tego wyniku jako przewidywania rzeczywistej wydajności produkcji.
Przykład pokazuje jedynie, dlaczego nawet bardzo wysoka wydajność pojedynczych etapów nie gwarantuje chemicznie prostego produktu surowego po kilkudziesięciu powtórzeniach.
Dlatego monitorowanie syntezy i kontrola zanieczyszczeń są istotne podczas całego procesu składania peptydu, a nie dopiero po dodaniu ostatniego aminokwasu.
Automatyzacja, ogrzewanie i inne rozwiązania technologiczne mogą przyspieszyć syntezę, ale szybkość procesu powinna być zawsze oceniana razem z jakością produktu.
Badanie nad SPPS wspomaganą mikrofalami analizowało zależną od rodzaju reszty racemizację oraz powstawanie aspartimidu, pokazując, dlaczego warunki reakcji nadal muszą być dostosowywane do właściwości konkretnej sekwencji. [7]
Odszczepianie i odzyskiwanie surowego produktu
Odszczepianie uwalnia produkt z nośnika
Po zbudowaniu zaplanowanej sekwencji peptyd należy zazwyczaj chemicznie oddzielić od nośnika.
Etap ten określa się jako cleavage, czyli odszczepianie.
Odszczepianie przerywa celowo zaprojektowane chemiczne połączenie pomiędzy peptydem a nośnikiem.
W zależności od zastosowanej strategii odszczepianie może następować jednocześnie z usunięciem części lub wszystkich grup ochronnych łańcuchów bocznych. W innych procesach peptyd lub jego fragment może zostać uwolniony przy zachowaniu niektórych zabezpieczeń, jeżeli planowane są dalsze przemiany chemiczne.
Odpowiednia chemia uwalniania zależy od łącznika i docelowej cząsteczki.
Warunki, które skutecznie uwalniają jeden peptyd, mogą uszkodzić chemicznie wrażliwą grupę w innym.
Dlatego odszczepianie opisuje cel chemiczny, a nie jeden uniwersalny zestaw odczynników lub warunków odpowiedni dla wszystkich peptydów.
Podobnie prawidłowe zbudowanie szkieletu peptydu nie dowodzi, że wszystkie grupy ochronne zostały następnie skutecznie usunięte.
Składanie łańcucha i końcowe usuwanie zabezpieczeń odpowiadają na różne pytania chemiczne i wymagają osobnej oceny.
Warunki odszczepiania mogą wpływać na profil zanieczyszczeń
Odszczepianie nie musi być chemicznie obojętnym etapem.
Usuwanie grup ochronnych oraz zrywanie połączenia peptydu z nośnikiem może prowadzić do powstawania reaktywnych form chemicznych zdolnych do modyfikowania peptydu lub innych składników mieszaniny.
Dlatego w opracowanych metodach mogą być stosowane tzw. scavengery, czyli związki wychwytujące określone niepożądane reaktywne produkty i wpływające na powstawanie produktów ubocznych.
W badaniu z 2019 r. przeanalizowano różne scavengery podczas odszczepiania exenatydu z żywicy peptydowej i wykazano, że ich wybór wpływał na jakość surowego produktu oraz obserwowany profil zanieczyszczeń. [8]
Nie należy na tej podstawie tworzyć uniwersalnej receptury odszczepiania.
Badanie pokazuje natomiast, że warunki tego etapu mogą wpływać na jakość produktu i dlatego powinny być oceniane dla konkretnego peptydu oraz zastosowanego systemu grup ochronnych.
Prawidłowy proces odszczepiania ma więc kilka wymiarów.
Peptyd musi zostać odpowiednio odłączony, wymagane grupy ochronne powinny zostać usunięte, materiał docelowy musi zostać odzyskany, a niepożądane przemiany chemiczne powinny być kontrolowane.
Odzyskanie produktu surowego nie jest końcowym oczyszczaniem
Po odszczepieniu przeprowadza się proces umożliwiający oddzielenie materiału zawierającego peptyd od stałej żywicy oraz części pozostałych składników mieszaniny reakcyjnej.
Można przy tym wykorzystywać różnice w rozpuszczalności, lotności lub innych właściwościach chemicznych.
Odzyskanie widocznego osadu czy frakcji zawierającej peptyd nie dowodzi jednak, że materiał składa się wyłącznie z zamierzonego produktu.
Na tym etapie mówi się zwykle o surowym peptydzie.
Może on zawierać docelową cząsteczkę razem z sekwencjami delecyjnymi, skróconymi łańcuchami, chemicznie zmodyfikowanymi peptydami, niecałkowicie odbezpieczonymi strukturami, materiałami pochodzącymi z odczynników i innymi zanieczyszczeniami.
Znaczenie poszczególnych zanieczyszczeń zależy od sekwencji, warunków syntezy i zamierzonego zastosowania.
W jednym z badań połączono rozdział chromatograficzny ze spektrometrią mas w celu scharakteryzowania surowych produktów SPPS i przypisania poszczególnych pików chromatograficznych określonym peptydom. [9]
Pokazuje to, dlaczego informacje uzyskane dzięki metodom separacyjnym i strukturalnym wzajemnie się uzupełniają.
Chromatografia może wykazać obecność wielu składników, natomiast spektrometria mas może dostarczyć dodatkowych informacji pomagających ustalić, czym mogą być niektóre z nich.
Oczyszczanie i potwierdzanie tożsamości odpowiadają na różne pytania
Oczyszczanie ma na celu wzbogacenie lub wyizolowanie docelowej cząsteczki spośród innych składników.
Identyfikacja odpowiada natomiast na pytanie, czy wyizolowany materiał rzeczywiście ma oczekiwane właściwości chemiczne.
Pytania te częściowo się pokrywają, ale nie są tym samym.
Dobrze rozdzielony pik chromatograficzny nie stanowi automatycznie pełnego dowodu struktury cząsteczki.
Podobnie uzyskanie oczekiwanej masy cząsteczkowej samo w sobie nie jest pełną oceną czystości ani poprawności strukturalnej.
Blisko spokrewnione warianty sekwencji, stereoizomery lub chemicznie zmodyfikowane formy mogą być trudne do rozróżnienia lub rozdzielenia.
Metoda oczyszczania powinna więc być oceniana w odniesieniu do rzeczywistej mieszaniny powstałej podczas danej syntezy, a nie uznawana za wystarczającą tylko dlatego, że sprawdziła się w przypadku innego peptydu.
Jeżeli końcowa cząsteczka wymaga również utworzenia mostków disiarczkowych, cyklizacji lub innej transformacji po zakończeniu składania łańcucha, pojawiają się kolejne pytania analityczne dotyczące prawidłowości połączeń, jednorodności strukturalnej oraz tego, czy rzeczywiście otrzymano zamierzoną dojrzałą postać cząsteczki.
Zalety, ograniczenia i źródła zanieczyszczeń
Dlaczego SPPS jest tak szeroko stosowana?
Jedną z najważniejszych zalet SPPS jest możliwość utrzymywania powstającego peptydu na nośniku podczas wielokrotnej wymiany ciekłych odczynników.
Upraszcza to powtarzalne operacje chemiczne i umożliwia automatyzację.
Chemicy mogą wprowadzać zaplanowaną sekwencję aminokwasowych bloków budulcowych, a jeżeli pozwala na to chemia procesu, również niektóre niestandardowe aminokwasy i inne modyfikacje.
Współczesne systemy automatyczne pokazują, jak daleko można rozwinąć tę koncepcję.
W badaniu dotyczącym zautomatyzowanej syntezy przepływowej z 2020 r. opisano otrzymywanie łańcuchów białkowych zawierających nawet 164 reszty aminokwasowe. Po późniejszym oczyszczaniu i fałdowaniu uzyskano funkcjonalne materiały. [10]
Jest to imponujący przykład możliwości technicznych.
Nie oznacza jednak, że każdą sekwencję o długości 164 reszt — ani każdy długi peptyd czy białko — można otrzymać z taką samą łatwością.
Nie oznacza również, że oczyszczanie i charakterystyka strukturalna stają się zbędne.
Badanie pokazuje raczej, jakie rezultaty można osiągnąć dzięki starannie opracowanemu systemowi dla odpowiednio dobranych cząsteczek.
Automatyzacja kontroluje wykonanie procesu.
Nie jest jednak w stanie zamienić nieodpowiedniej chemii w odpowiednią.
Dlatego wydajność aparatury, sekwencję peptydu i zachowanie samej cząsteczki należy analizować łącznie.
Jak powstają typowe zanieczyszczenia?
Podczas SPPS może występować kilka różnych dróg prowadzących do powstawania zanieczyszczeń. Ich zrozumienie pomaga wyjaśnić, dlaczego końcowe badania analityczne są nadal konieczne.
Sekwencja delecyjna lub produkt skrócony może powstać, gdy nie powiedzie się planowane przyłączenie aminokwasu albo gdy wzrost łańcucha zostanie przerwany. Ponieważ nieprawidłowy łańcuch może nadal pozostawać przyłączony do żywicy, późniejsze przemywanie nie musi go usuwać.
Epimeryzacja oznacza zmianę konfiguracji stereochemicznej odpowiedniego centrum. Ma to szczególne znaczenie analityczne, ponieważ epimer może mieć taką samą nominalną masę cząsteczkową jak właściwy peptyd, a jednocześnie różnić się konfiguracją przestrzenną.
Produkty związane z aspartimidem mogą powstawać w wyniku zależnych od sekwencji reakcji ubocznych obejmujących reszty asparaginianu. W zależności od przebiegu chemicznego może powstawać więcej niż jeden rodzaj takiego produktu.
Niepełne usunięcie grup ochronnych występuje wtedy, gdy grupa, która powinna zostać usunięta, pozostaje związana z cząsteczką. Peptyd może więc mieć nominalnie oczekiwaną długość łańcucha, ale nadal posiadać nieprawidłową strukturę chemiczną.
Modyfikacje związane z odszczepianiem mogą pojawiać się podczas końcowego uwalniania peptydu lub usuwania grup ochronnych. Prawidłowe zbudowanie łańcucha nie gwarantuje więc, że peptyd przejdzie etap odszczepiania bez zmian.
Niepełne reakcje związane z agregacją mogą natomiast występować wtedy, gdy powstające łańcuchy oddziałują ze sobą w sposób ograniczający dostęp do miejsc reaktywnych. Wprowadzenie wystarczającej ilości odczynnika do naczynia reakcyjnego nie gwarantuje, że każde miejsce reaktywne jest fizycznie dostępne i ulega odpowiedniej reakcji.
Są to możliwe drogi powstawania zanieczyszczeń.
Nie oznacza to, że każda partia otrzymywana metodą SPPS musi zawierać wszystkie wymienione rodzaje nieprawidłowości.
Ich znaczenie w konkretnej syntezie ustala się na podstawie wiedzy o procesie, badań analitycznych i odpowiedniej kontroli jakości.
Złożone peptydy naturalne wymagają czegoś więcej niż odtworzenia sekwencji
Niektóre peptydy są strukturalnie znacznie bardziej złożone, niż wynikałoby to z samej liniowej sekwencji aminokwasów.
Dobrym przykładem jest epidermina.
Charakterystyka strukturalna epiderminy wykazała obecność wielu pierścieni zawierających siarkę oraz nietypowych reszt. [11]
Samo odtworzenie liniowej kolejności aminokwasów nie byłoby więc wystarczającym dowodem, że otrzymano autentyczną dojrzałą epiderminę.
Rozróżnienie to jest ważne podczas interpretowania publikacji czy wyszukiwań dotyczących syntezy epiderminy na fazie stałej.
Publikacja może opisywać liniowy prekursor, fragment, analog lub inną pokrewną strukturę, a nie zweryfikowaną całkowitą syntezę kompletnej dojrzałej cząsteczki.
Publikacja strukturalna cytowana tutaj jako [11] opisuje charakterystykę samej epiderminy; nie jest raportem dotyczącym jej całkowitej syntezy metodą SPPS.
Twierdzenia o całkowitej syntezie należy więc oceniać w odniesieniu do rzeczywistej struktury docelowej cząsteczki, a nie wyłącznie jej liniowej sekwencji aminokwasowej.
Wydajność, czystość i tożsamość należy przedstawiać oddzielnie
Trzy pojęcia często mylone w dyskusjach o syntezie peptydów to wydajność, czystość i tożsamość.
Duża masa odzyskanego produktu nie musi oznaczać, że większość tego materiału stanowi zamierzony peptyd. Surowy materiał może zawierać znaczne ilości zanieczyszczeń.
Podobnie wysoka czystość chromatograficzna nie potwierdza automatycznie wszystkich aspektów tożsamości strukturalnej.
Nawet peptyd, którego strukturę chemiczną dokładnie scharakteryzowano, nie uzyskuje przez to automatycznie potwierdzonego zastosowania biologicznego, terapeutycznego czy klinicznego.
Są to odrębne zagadnienia.
Rzetelny opis syntezy powinien więc wskazywać, jaka była docelowa cząsteczka, na jakim etapie zmierzono wydajność, czy analizowany materiał był surowy czy oczyszczony oraz jakie dane analityczne wykorzystano do potwierdzenia twierdzeń dotyczących struktury.
Dzięki temu wyniki syntezy można interpretować i porównywać w bardziej wiarygodny sposób.
Pojedynczej wartości procentowej lub wartości masy nie należy przekształcać w ogólne stwierdzenie, że peptyd jest „wysokiej jakości”, bez wiedzy o tym, co rzeczywiście zmierzono.
Najczęściej zadawane pytania
1. Dlaczego w SPPS wykorzystuje się fazę stałą?
Faza stała utrzymuje powstający peptyd na nośniku, podczas gdy rozpuszczalne odczynniki, produkty uboczne reakcji i roztwory przemywające mogą być wielokrotnie wprowadzane i usuwane. Znacznie upraszcza to powtarzalne składanie łańcucha i umożliwia automatyzację syntezy peptydów, czego przykładem są współczesne metody zautomatyzowanej syntezy przepływowej. [10] Nośnik nie gwarantuje jednak, że każda reakcja przebiegnie idealnie, ani nie oddziela nieprawidłowo zbudowanego łańcucha związanego z żywicą od prawidłowego. Jego podstawową zaletą jest usprawnienie prowadzenia procesu. Selektywność chemiczna, kompletność reakcji, czystość i tożsamość strukturalna nadal wymagają osobnej oceny.
2. Czy synteza na fazie stałej eliminuje potrzebę oczyszczania?
Nie. Nieprawidłowe łańcuchy peptydowe mogą pozostawać przyłączone do żywicy podczas syntezy, a następnie zostać uwolnione razem z zamierzonym produktem. Badania analizujące surowe produkty SPPS za pomocą chromatografii i spektrometrii mas pokazują, że przemywanie podczas syntezy i końcowe oczyszczanie pełnią odmienne funkcje. [9] Przemywanie usuwa przede wszystkim rozpuszczalne składniki otaczające żywicę, natomiast oczyszczanie po odszczepieniu ma oddzielić pożądany peptyd od niepożądanych składników peptydowych i niepeptydowych. SPPS upraszcza operacje pośrednie, ale nie gwarantuje końcowej czystości.
3. Czy „faza stała” oznacza, że nie stosuje się rozpuszczalnika?
Nie. W konwencjonalnej SPPS nierozpuszczalny nośnik jest zazwyczaj otoczony ciekłymi odczynnikami i rozpuszczalnikami. Rozpuszczalniki wpływają na fizyczne środowisko żywicy, między innymi na stopień jej pęcznienia i łatwość, z jaką odczynniki mogą docierać do przyłączonych łańcuchów. Badania eksperymentalne wykazały zależne od rozpuszczalnika pęcznienie żywic oraz zmiany związane z chemią łącznika, stopniem podstawienia i wydłużaniem łańcucha. [2] Żywica i rozpuszczalnik wspólnie tworzą więc środowisko reakcji.
4. W którym kierunku rośnie peptyd podczas SPPS?
Konwencjonalna etapowa SPPS zazwyczaj buduje peptyd od jego reszty C-końcowej w kierunku N-końca. Pierwszy aminokwas, który ma stanowić C-koniec gotowej cząsteczki, jest przyłączany do nośnika, a kolejne reszty wydłużają odsłonięty koniec aminowy łańcucha. Opublikowane metody oparte na Fmoc pokazują ten typowy schemat. [1] Istnieją jednak wyspecjalizowane strategie wykorzystujące fazę stałą, które mogą przebiegać inaczej.
5. Czy żywica i łącznik oznaczają to samo?
Nie. Żywica jest nierozpuszczalnym nośnikiem, natomiast łącznik stanowi chemiczne połączenie pomiędzy nośnikiem a rosnącym peptydem. Funkcjonalność łącznika może niezależnie od samego polimeru wpływać na przyłączenie, zachowanie żywicy oraz późniejsze uwalnianie peptydu. Badania nośników stosowanych w syntezie peptydów pokazują, dlaczego samo określenie rodzaju żywicy może nie wystarczyć do opisania zachowania całego systemu. [2]
6. Czy większy stopień podstawienia żywicy zawsze zwiększa produkcję?
Nie. Wyższy loading oznacza większą liczbę potencjalnych miejsc przyłączenia na określoną ilość nośnika, ale nie musi prowadzić do uzyskania większej ilości prawidłowo zbudowanego i możliwego do odzyskania peptydu. Stopień podstawienia może zmieniać lokalne środowisko cząsteczkowe i został eksperymentalnie wskazany jako jeden z czynników wpływających na pęcznienie żywicy. [2] Jeżeli przyłączone łańcuchy są nadmiernie zagęszczone lub silnie ze sobą oddziałują, dostępność reaktywnych miejsc może się pogorszyć. Loading należy więc analizować razem z właściwościami żywicy, zachowaniem sekwencji, wydajnością reakcji i jakością produktu końcowego.
7. Dlaczego aminokwasy są zabezpieczane podczas składania peptydu?
Grupy ochronne tymczasowo uniemożliwiają wybranym grupom reaktywnym uczestniczenie w reakcjach, podczas gdy tworzone jest konkretne wiązanie. Umożliwia to kontrolowane, etapowe składanie łańcucha. Zabezpieczenie nie eliminuje jednak wszystkich reakcji ubocznych. Badania na modelowych układach wykazały na przykład, że strategia grup ochronnych oraz otaczająca sekwencja mogą wpływać na powstawanie aspartimidu. [5] Grupy ochronne zapewniają więc selektywność chemiczną, ale cała strategia zabezpieczania i odbezpieczania nadal wymaga starannego zaplanowania i oceny.
8. Co oznacza ortogonalna ochrona grup funkcyjnych?
Ortogonalność oznacza możliwość usunięcia jednej grupy ochronnej w warunkach, które pozostawiają inne potrzebne zabezpieczenia w wystarczającym stopniu nienaruszone. Pozwala to odsłaniać określone miejsca reaktywne na zaplanowanych etapach syntezy. Ugruntowane metody SPPS opierają się na kontrolowanym zabezpieczaniu i odbezpieczaniu, zamiast jednoczesnego odsłaniania wszystkich reaktywnych grup. [1] Rzeczywista zgodność zastosowanych zabezpieczeń nadal zależy jednak od docelowej cząsteczki i warunków reakcji.
9. Czy Fmoc i Boc oznaczają różne rodzaje peptydów?
Nie. Fmoc i Boc to grupy ochronne oraz związane z nimi strategie syntetyczne, a nie różne rodzaje szkieletu peptydowego. Różnice w chemii ich usuwania wpływają na sposób prowadzenia syntezy, ale tymczasowej chemii ochronnej nie należy mylić z końcową strukturą docelowego peptydu. Opublikowane metody oparte na Fmoc pokazują jeden z powszechnie stosowanych wariantów SPPS, ale nie oznacza to, że każdy peptyd musi być otrzymywany tą metodą. [1]
10. Czy już pierwszy etap przyłączenia może wprowadzić zanieczyszczenie?
Tak. Etap przyłączania może wpływać na jakość stereochemiczną jeszcze przed rozpoczęciem wielokrotnego wydłużania łańcucha. Opracowano metody analityczne przeznaczone specjalnie do oznaczania racemizacji podczas przyłączania zabezpieczonych aminokwasów do żywic. [3] Nie oznacza to, że każde przyłączenie powoduje istotną racemizację. Pokazuje natomiast, że samo przyłączenie jest chemicznie istotnym etapem, podczas którego mogą pojawić się mierzalne zmiany wymagające uwzględnienia w ogólnej ocenie jakości.
11. Dlaczego niektóre sekwencje peptydowe określa się jako trudne?
Niektóre rosnące łańcuchy peptydowe oddziałują ze sobą lub z sąsiednimi łańcuchami w sposób ograniczający dostęp do miejsc reaktywnych. Wiązania wodorowe, oddziaływania hydrofobowe i zachowania przypominające agregację mogą utrudniać późniejsze sprzęganie. Badania sekwencji podatnych na agregację pokazują, że zmiana sposobu sprzęgania może wpływać na skład surowego produktu. [4] Trudność syntezy zależy więc od właściwości cząsteczki i warunków reakcji, a nie wyłącznie od długości peptydu.
12. Czy szybsza synteza zawsze oznacza lepszy produkt?
Nie. Szybkość syntezy i jakość produktu są odrębnymi parametrami. Ogrzewanie, wspomaganie mikrofalami i automatyzacja mogą skrócić czas procesu, ale przyspieszanie reakcji może również zmienić równowagę pomiędzy reakcjami pożądanymi i ubocznymi. Badania syntezy wspomaganej mikrofalami wykazały zależną od rodzaju reszty racemizację i powstawanie aspartimidu, co wskazuje na konieczność odpowiedniej kontroli warunków. [7] Krótszy czas syntezy jest korzystny tylko wtedy, gdy uzyskany materiał spełnia również wymagane kryteria chemiczne i analityczne.
13. Czy odszczepianie oznacza po prostu usunięcie ziaren żywicy?
Nie. Odszczepianie jest procesem chemicznym prowadzącym do zerwania zaprojektowanego połączenia pomiędzy peptydem a nośnikiem. Usunięcie ziaren żywicy poprzez filtrację jest natomiast operacją fizycznego rozdzielenia i samo w sobie nie potwierdza prawidłowego przebiegu chemii odszczepiania. Uwalnianie peptydu może zachodzić jednocześnie z usuwaniem grup ochronnych i innymi reakcjami. Badania scavengerów stosowanych podczas odszczepiania pokazują, że etap ten może wpływać na profil zanieczyszczeń. [8]
14. Czy wysoka wydajność produktu surowego oznacza wysoką czystość peptydu?
Nie. Wydajność surowa opisuje ilość odzyskanego materiału przed usunięciem wszystkich niepożądanych składników. Materiał ten może zawierać docelowy peptyd wraz z sekwencjami delecyjnymi, zmodyfikowanymi strukturami, pozostałymi grupami ochronnymi i innymi zanieczyszczeniami. Badania surowych mieszanin SPPS z wykorzystaniem chromatografii i spektrometrii mas pokazują, dlaczego odzyskana masa, czystość i tożsamość cząsteczkowa wymagają osobnej interpretacji. [9] Rzetelnie przedstawiona wydajność powinna więc wskazywać etap, na którym została zmierzona, oraz to, czy materiał był już oczyszczony.
15. Czy SPPS umożliwia otrzymywanie długich łańcuchów peptydowych?
Tak. Starannie opracowane metody SPPS mogą umożliwiać otrzymywanie bardzo długich łańcuchów. W badaniach nad zautomatyzowaną syntezą przepływową otrzymywano łańcuchy zawierające nawet 164 reszty, które następnie poddawano oczyszczaniu i fałdowaniu przed oceną funkcjonalną. [10] Pokazuje to możliwości współczesnej syntezy peptydów, ale nie oznacza, że każdą sekwencję o podobnej długości można otrzymać z jednakową wydajnością. Długość jest tylko jednym z czynników; znaczenie mają również agregacja zależna od sekwencji, reakcje uboczne, wymagania dotyczące fałdowania i trudność oczyszczania.
16. Czy zbudowanie sekwencji epiderminy oznacza przeprowadzenie jej całkowitej syntezy?
Nie. Dojrzała epidermina zawiera nietypowe elementy strukturalne, w tym pierścienie zawierające siarkę, które wykraczają poza samą liniową kolejność aminokwasów. Zostało to wykazane w badaniach strukturalnych. [11] Otrzymanie liniowej sekwencji, prekursora lub fragmentu nie oznacza więc automatycznie syntezy kompletnej dojrzałej cząsteczki. Twierdzenie o syntezie całkowitej wymaga danych analitycznych potwierdzających odtworzenie zamierzonych połączeń i innych istotnych elementów strukturalnych.
17. Czy oczekiwana masa cząsteczkowa potwierdza pełną poprawność struktury?
Nie. Uzyskanie oczekiwanej masy cząsteczkowej stanowi wartościową informację, ale sama masa nie potwierdza wszystkich aspektów struktury peptydu i nie wyklucza wszystkich istotnych zanieczyszczeń. Dwie cząsteczki mogą mieć tę samą nominalną masę, a jednocześnie różnić się stereochemią lub określonym układem strukturalnym. Badania obejmujące rozdzielanie epimerycznych peptydów pokazują, dlaczego różnice stereochemiczne mogą wymagać metod analitycznych zdolnych rozróżniać struktury, których nie można odróżnić wyłącznie na podstawie pomiaru masy. [12] Końcową charakterystykę należy więc projektować z uwzględnieniem realistycznych zanieczyszczeń i alternatywnych struktur, które mogą powstać podczas konkretnej syntezy.
Podsumowanie
Synteza peptydów na fazie stałej zmieniła chemię peptydów, umożliwiając utrzymywanie rosnącego łańcucha na nierozpuszczalnym nośniku podczas wielokrotnego wprowadzania, przeprowadzania reakcji i usuwania rozpuszczalnych odczynników. Ułatwia to etapowe budowanie sekwencji i stanowi praktyczną podstawę automatycznej syntezy.
Pozorna prostota tej metody nie powinna jednak przesłaniać chemii zachodzącej na każdym etapie.
Żywica, łącznik i stopień podstawienia wpływają na istotne właściwości środowiska syntezy. Zależne od rozpuszczalnika pęcznienie wpływa na dostęp do łańcuchów związanych z żywicą. Grupy ochronne kontrolują, które grupy funkcyjne mogą reagować, natomiast reakcje sprzęgania budują szkielet peptydu reszta po reszcie. [1] [2]
Każdy z tych etapów ma również swoje ograniczenia.
Początkowe przyłączenie może wpływać na jakość stereochemiczną. [3] Trudne sekwencje mogą agregować i ograniczać dostęp odczynników. [4] Chemia zabezpieczania i usuwania grup ochronnych może sprzyjać reakcjom ubocznym, takim jak powstawanie aspartimidu. [5] [6] Przyspieszone warunki syntezy mogą zmieniać stopień racemizacji lub profil zanieczyszczeń. [7] Warunki odszczepiania mogą dodatkowo wpływać na skład surowego produktu. [8]
Dlatego prawidłowe zbudowanie łańcucha nie jest równoznaczne z uzyskaniem czystego i prawidłowo zidentyfikowanego peptydu.
Odzyskiwanie surowego produktu, oczyszczanie oraz charakterystyka strukturalna pozostają odrębnymi etapami. Chromatografia może dostarczać informacji o składzie mieszaniny i czystości, natomiast spektrometria mas i inne metody analityczne dostarczają informacji o tożsamości. Żaden pojedynczy wynik analityczny nie musi potwierdzać wszystkich aspektów struktury peptydu. [9] [12]
Współczesna zautomatyzowana synteza przepływowa pokazuje, że przy odpowiednio opracowanych warunkach SPPS można stosować nawet do bardzo długich łańcuchów. [10] Jednocześnie strukturalnie złożone peptydy, takie jak epidermina, pokazują, dlaczego samo odtworzenie liniowej sekwencji aminokwasowej może być niewystarczające, jeżeli dojrzała cząsteczka zawiera dodatkowe pierścienie, nietypowe reszty lub określony układ połączeń. [11]
Najlepiej rozumieć SPPS nie jako pojedynczą reakcję, lecz jako sekwencję odrębnych etapów chemicznych i analitycznych.
Przyłączenie wyznacza punkt początkowy. Powtarzające się cykle zabezpieczania, odbezpieczania i sprzęgania budują zaplanowany łańcuch. Odszczepianie uwalnia produkt. Oczyszczanie oddziela cząsteczkę docelową od niepożądanych składników. Końcowa charakterystyka pozwala następnie ustalić, czy wyizolowany materiał rzeczywiście ma przypisywaną mu strukturę i jakość.
Rozdzielenie tych etapów pozwala uniknąć kilku częstych nieporozumień: udana synteza nie potwierdza automatycznie czystości, wysoka wydajność nie potwierdza automatycznie tożsamości, a oczekiwana masa cząsteczkowa sama w sobie nie dowodzi pełnej poprawności strukturalnej.
References
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Solid-phase peptide synthesis: From standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K., & Willway, H. (2020). Investigation of parameters that affect resin swelling in green solvents. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Use of Marfey’s reagent to quantitate racemization upon anchoring of amino acids to solid supports for peptide synthesis. Analytical Biochemistry, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluation of combined use of Oxyma and HATU in aggregating peptide sequences. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). The aspartimide problem in Fmoc-based SPPS. Part I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). The aspartimide problem in Fmoc-based SPPS. Part II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzenedimethanethiol (1,4-BDMT) as a scavenger for greener peptide resin cleavages. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). The characterization of crude products from solid-phase peptide synthesis by mu-HPLC/fast atom bombardment mass spectrometry. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E., & Pentelute, B. L. (2020). Synthesis of proteins by automated flow chemistry. Science, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: Sequencing of a heterodetic tetracyclic 21-peptide amide antibiotic. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Racemization studies in peptide synthesis through the separation of protected epimeric peptides by reversed-phase high performance liquid chromatography. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x