固体相ペプチド合成（SPPS）とも呼ばれる固体相ペプチド合成は、アミノ酸ごとにアミノ酸からペプチドを合成する化学的方法であり、生成鎖の一端は不溶解性担体に化学的に結合したまま残ります。.
化学者は、各反応の後に生成されるペプチドを分離する代わりに、そのペプチドを固定相に結合させ、次の液体試薬および洗浄液を導入および除去します。繰り返しとなるサイクルにより、活性アミノ基が露出され、次のアミノ酸が結合され、不要になった可溶成分が除去されます。アミノ酸の計画された配列が構築されると、ペプチドは担体から分離され、その後さらなる処理および分析が行われます。.
このプロセス機構は、ペプチド化学においてSPPSが非常に重要な手法となった主な理由の一つです。スタティックフェーズは、多くの繰り返し化学操作の実行を簡素化し、合成の自動化を可能にしました。.
しかし、定常相での合成の便利さは、化学的な完全性の保証とはならない。.
生成中のペプチドを担体に取り込むことは、すべてのアミノ酸が計画通りに配列された鎖になることを保証するわけではありません。また、プロセス末期に放出される物質が化学的に純粋であることや、正しい構造を持つことについても保証するものではありません。.
チェーンの組み立て、製品の除去および回収、洗浄、認証、および最終的な構造的特性は、全体のプロセスの一部として独立した部分です。.
現代のメソッド出版物は、SPPSの有用性と、困難な配列の場合に標準的な手法を修正する必要性を両方示しています。FMOC戦略を利用した出版された1つの手法では、例として通常の合成方法だけでなく、凝集しやすいペプチド配列に対する修正されたアプローチも説明されています。[1]
したがって、SPPSの理解には、化学的ステップの順序を記憶すること以上のものが必要です。また、各ステップの目的、その間に何が間違って起こり得るか、そしてそのステップの終了後に依然として分析に必要となる質問についても知っておく必要があります。.
固定相でのペプチド合成とは何ですか？
生成されるペプチドは結合したままであり、溶液は変化する。
従来のSPPSでは、ペプチドは適切な化学結合剤を用いて、通常はワイヤークラッドと呼ばれる小さな不溶解粒子に化学的に結合されます。.
粒状物質は反応系内に留まり、一方、別の液体反応物や流動化溶液が導入され取り除かれる。.
これは繰り返し合成を大幅に簡素化します。.
古典的な段階的合成では、各アミノ酸の追加後に成長中のペプチドを分離して精製することは面倒な作業になることがあります。SPPSでは、生成された鎖は不溶解相に結合したまま残ります。これにより、可溶性の過剰な活性物質や多くの副生成物が洗浄によって除去され、樹脂に結合したペプチドはそのまま残ります。.
しかし、「恒常段階」という用語は誤解を生じさせる可能性がある。.
それは、液体や溶媒の存在なしにペプチド結合が起こるという意味ではありません。.
樹脂は通常、流動的な反応性環境に囲まれています。その溶媒との相互作用は合成過程に大きく影響する可能性があります。反応性物質はポリマー環境内でまたはその周辺に移動し、成長中のペプチドの反応部位に到達する必要があります。.
ペプチドを担体に取り込むプロセスは通常、共役的な性質を有する。つまり、生成された分子は化学結合によって担体と結合する。.
ペプチドは、したがって、単に粒子の間にとどめられていたり、ろ過装置によって捕捉されているり、または表面にゆるやかに付着しているわけではない。.
このような化学結合は、生成する鎖が次の反応や洗浄段階の間には結合したまま残るように意図的に設計されており、その後適切な条件下で解離されることができます。.
従来の方法による合成は、C端からN端に向かって行われます。
古典的な線形SPPS戦略は通常、完成したペプチドにおいてそのC末端となるアミノ酸から始まる。.
残りの部分はそのメディアに接続されます。.
適切な活性化アミノ基が形成されると、次の保護されたアミノ酸が導入され、化学的に鎖に結合されます。このプロセスを繰り返すと、ペプチドは徐々にN末端に向かって長くなります。.
この経路は強調しておく価値があり、それはリボソームによるタンパク質の生物学的合成とは異なるからです。.
リボソーム合成はN末端からC末端に向かってポリペプチドの長さを延長します。従来の方法である段階的 SPPSは通常、逆方向に配列を構築します。.
しかし、最終的なアミノ酸配列は同一である可能性があります。その構成方法は異なるだけです。.
ここで「従来型」という用語が重要であるのは、ペプチド化学には代替接合部位を利用する特殊な戦略、断片の合成、リン酸化反応、およびその他の非標準的な手法も含まれているためである。.
C-末端からN-末端までの方向の記述は、常温相を利用したペプチド化学のすべての可能な方法ではなく、典型的な段階的なSPPSプロセスに関するものです。.
SPPSはペプチドの生成要素の一つに過ぎない
固定相合成はペプチドの生成の唯一の方法ではありません。.
ペプチドはまた、溶液中で化学合成、生物学的発現システム、酵素的変換、断片の結合、または様々な方法の組み合わせによっても得られる。.
SPPSは、シーケンスの制御された合成および安全な、変更された、または特殊なアミノ酸構造ブロックの使用が必要な場合に特に有用です。.
特定のペプチドに関する一つのプロジェクトであっても、常に最初から最後まで同じ手法を使用する必要はない。.
例えば、ペプチドの各断片は、樹脂上に合成され、それぞれ分離され、その後化学的方法で結合される場合があります。他の分子は、開始的な直線配列が得られた後に、折りたためられ、酸化され、シクロ化され、または追加の構造変化を経て合成される必要があるかもしれません。.
したがって、適切な道を選ぶには、最終的な分子、その構造的複雑さ、およびプロジェクトの分析および品質要件が考慮されなければなりません。.
このプロセスを、一連の次々と出される質問として検討する価値があります。.
載体への結合は出発点を示し、製品の放出化学的挙動に影響を与えます。しかし、依然として、結合が正常に行われたか、立体化学的完全性が維持されたかを確認する必要があります。.
鎖の組み立ては、アミノ酸を計画された順序で結合させることを目的としています。しかし、その後、すべての鎖が正常に反応したかどうか、欠けているアミノ酸を含むシーケンス、短縮または変更された産物が生成されたかどうかを確認する必要があります。.
脱脂および保護群の除去はペプチドを解放し、特定の化学的保護層を排除するものです。しかし、製品が効果的に放出されるだけでは、原材料に含まれる他の物質がどのようになっているかがわかりません。.
浄化は望ましい物質を不要な成分から分離する目的で行われますが、浄化された物質の成分も依然として同定および品質評価の確認が必要となります。.
一方、最終的な構造的および分析的特性は、分離された物質がターゲットペプチドに期待される化学特性を有するかどうか、および使用された分析手法が目的の用途に適しているかどうかという問いに答えるものです。.
これらは概念段階のステップであり、実験手順ではありません。具体的な試薬、装置、および反応条件はペプチドの目的に応じて異なります。それらの反応には適切に開発および検証された方法が必要です。.
ワイヤの接続とチェーンの組み立て
樹脂、接合剤、および接合レベルはそれぞれ異なる機能を持っています。
SPPSに関する議論では、しばしば3つの用語が取り上げられます：樹脂、接着剤、および積層度（つまり、loading）。.
それらは関連するものの異なる特性を記述する。.
樹脂は不溶性物質であり、その媒介物である。.
この結合子は、この載体とペプチドまたは最初のアミノ酸残基との化学的な結合を保証します。この結合子の化学は、ペプチドの結合方法にも影響を与え、またその後の解離にも影響を与えます。.
一方、Loadingは、メディアの量に対する接続可能な反応域の数を表す。.
これらの用語は同義語ではありません。.
2つの樹脂は物理的に非常に類似しているように見えるかもしれませんが、機能基質、結合基質、または重合度において異なることがあります。これらの違いは、鎖合成時の活性部位の可用性、樹脂の膨張、および脱離後の最終ペプチドの化学構造に影響を与える可能性があります。.
次の重要な要素は、C端に配置される予定のグループです。.
例えば、様々な載置基と結合基の組み合わせは、カルボキシル基またはアミド基で終わるペプチドを得るように選択されることもあります。.
これは重要な化学的違いです。.
ターミナルグループの変更とは、その分子そのものの変化を意味します。つまり、その分子のパッケージングや記述の方法だけが変化するわけではありません。.
圧縮は接続されたチェーンへのアクセスに影響を及ぼす
SPPSで使用される多くの揮発性物質は溶媒を吸収し、適切な流動性環境に接触すると膨張します。.
これはポリマー環境を変え、溶媒を含むペプチド鎖に到達するために溶解した反応物が必要とする移動空間を増減させることができる。.
したがって、膨張は単なる物理的な興味深い現象ではありません。.
それは合成時の反応性の基質の可用性に影響を与える可能性がある。.
ポリスチレンおよびPEGベースの担体を用いた系統的な研究では、接合剤の種類や樹脂の付着度といった特性が、より環境に優しい溶媒を用いた試験において、プッチングに有意な影響を与えていることが示された。また、保護基の除去やペプチド鎖の長さを延長するにつれて、プッチングの性質が変化する可能性があることも確認された。[2]
これは、樹脂の挙動を常にその定常特性として扱うことができるわけではないことを示している。.
実際には、これには樹脂、溶媒、結合剤、結合されたペプチド、および現在の合成段階の相互作用が関係しています。.
そのため、ワイヤクレア、溶媒、ペプチドの組み合わせのいずれにおいても良好な配合または反応の良好な進行が、他の組み合わせでも同じように作用することを意味するわけではありません。.
接続工程自体も品質管理が必要である。
最初の結合段階は単純に見えるかもしれませんが、ペプチド鎖はまだ形成されていないからです。.
しかし、この段階で導入された誤りは、後の合成全体において依然として存在し続ける可能性があります。.
もし最初の残りの部分がこのプロセス中に誤って接続されたり、そのときのステレオ化学的構成が変化したりしたとしても、それ以降の残りの部分をすべて正しく接続しても、当初の問題を修正する必要はない。.
1992年の研究では、固定担体の上に置かれた保護されたアミノ酸が結合する過程で生じるラセミ化を測定するために特別に設計された分析手法が開発された。[3]
この研究の意義は、使用された分析手法そのものを超えています。.
これは、連続的な鎖延長サイクルを開始する前に、立体構造の品質を検査する必要があることを示しています。.
また、メディアに最初に取り付けられた素材の量についても、適切な解釈が必要である。.
ポリマーの還元率、実験的に測定されたロードング、脱離後に回収された生物質の量、そして分離および精製されたペプチドの最終産物はそれぞれ異なる大きさです。.
それらを合成の成功の代用指標として扱うべきではありません。.
長いチェーンは入手しづらいものになる可能性がある
ペプチド鎖が長くなるにつれて、単独で結合した分子は化学環境に影響を及ぼし始める。.
隣接する鎖は水素結合、疎水作用、および他の分子間力を通じて相互作用する可能性があります。一部の鎖はこのような相互作用の傾向が特に強いことがあります。.
これは反応性のグループへのアクセスを制限する可能性がある。.
そのような状況では、たとえ結合剤の量が明らかに十分であるようにシステムに導入されたとしても、次のアミノ酸の結合が困難になる可能性があります。.
このアグリゲーションに弱い困難なシーケンスに関する研究では、様々な結合方法を比較し、得られた生合成産物を分析した。その結果、常に最適である1つの結合戦略が存在するという前提ではなく、特定のシーケンスに合わせてプロセスを調整すべきであるという原則が支持されている。[4]
これはまた、ワイヤークラフトの硬化度を上げるか、または活性物質の量を上げるだけで、自動的にすべての問題を解決するわけではないということも説明する。.
基本的な問題が活性化部位へのアクセスが制限されている場合、添加された活性物質の量に関する質問よりも、実際にその活性物質が適切な部位に到達し、不適切な副生成物の生成を伴わずに効率的に反応が起こったかどうかという質問が重要となる。.
セキュリティ対策、保護グループの削除、および結合
保護グループは反応の発生場所を監視している。
アミノ酸には、様々な反応に参加する能力を持つ化学基が含まれています。.
ペプチドの制御された合成において、化学者は通常、特定のアミノ基がカルボキシル基を含む特定のブロックと反応することを望みますが、他の潜在的に反応可能な部位は一時的に活性を失います。.
まさにそれこそが保護団体の役割なのです。.
一時的に選択された活性化部位をブロックし、他の部位が計画された反応に参加できるようにします。.
FMOCに基づく一般的なSPPS戦略では、成長鎖の末端のアミノ基は連結の次のステップの間で保護されます。次のアミノ酸が連結される際に、一時的な保護が解除され、アミノ基が露出されます。.
再活性化されたサイドチェーンには、メインチェーンの構築サイクルを繰り返す間に破損しないように設計された個別の保護グループが含まれている場合があります。.
目的は制御された選択性である。.
カルボキシル基を持つ適切なブロックは、制御不能な分岐または他の競合反応を生じさせるのではなく、適切なアミノ基と結合すべきである。.
正交性は、セキュリティーの選択的な削除が可能であることを意味します。
正交的な保護グループ戦略は、他の必要なセキュリティが十分に損なわれていない条件下で、1つの保護グループを排除することを可能にします。.
これにより、化学者が合成の各段階において様々な反応部位を制御的に明らかにする機会が得られる。.
FmocとBocはペプチド化学においてよく知られた用語ですが、それらは異なる種類のペプチド結合やペプチドの異なる最終構造を意味するわけではありません。.
これらは、合成戦略やそれらの除去方法の異なるグループを指す。.
ペプチドの構築中に使用される暫定化学経路は、その最終的な構造とは区別されるべきである。.
予防措置は、すべての可能な副反応から完全に保護するものではありません。.
例えば、アスパルティミドの生成に関する研究では、セーフティ戦略、隣接するアミノ酸残基、および保護基の除去条件が、よく知られたSPPS手法においてさえ、汚染物の生成に影響を与える可能性があることが示されている。[5] [6]
したがって、保護群戦略は特定の有害な反応を抑制しますが、プロセス制御の必要性や最終的な分析特性を排除しません。.
結合はペプチドの骨格アミド鎖の新たな結合を形成する。
結合反応はペプチドのスクリーテルに次のアミド結合を生じさせる。.
カルボキシル基を持つアミノ酸鎖は通常、成長中のペプチドと結合した生体分子の暴露したアミノ基と効果的に反応できるよう化学的に活性化される。.
結合が完了すると、溶解した余分な材料は洗浄によって除去できます。.
新たに結合されたアミノ酸は、その後成長する鎖の最終残基となります。その後、そのアミノ基を明らかにし、次の結合サイクルを開始することができます。.
理論的には、このシーケンスを繰り返すことで、ビルディングブロックの導入順序を制御することで、アミノ酸の順序を制御することができます。.
しかし実際には非常に重要な注意事項があります：
計画された化学反応は、各サイクルにおいて確実に正常に進行しなければなりません。.
1つの結合が不完全な場合、チェーンの一部は計画された残りの部分を受け取らない可能性があります。.
もしそれらが接着剤に結合し、次のサイクルで正常に反応すれば、デレシアン配列と呼ばれる、つまり1つまたは複数の計画されたアミノ酸が欠損したペプチド分子が形成される可能性があります。.
他のチェーンは短くすることができます。.
洗剤は可溶性反応物および副生成物を除去しますが、載体と依然として共价結合している不完全な鎖をすべて選択的に除去しません。.
少量の損失は多くのサイクルで累積する可能性がある。
SPPSの反復性には重要な数学的問題が生じる。.
単一の段階におけるわずかな欠陥は重要ではないように思えるかもしれませんが、何度も繰り返されるとその影響は累積して大きくなります。.
簡単な数学的な例を考えてみましょう。.
ペプチドの合成が50の結合段階を必要とし、それぞれが正常終了の可能性が99% である場合、50段階すべてを成功裏に完了した分子の理論的な割合は約60%.5となります。.
これはあくまで例示です。.
このモデルでは、すべての段階が同じように、独立して動作するという仮定が立てられます。保護群の除去、副反応、分離および洗浄時の損失、アグリゲーション、およびその他の実際の要因については考慮されていません。.
したがって、この結果を生産の実質的な生産能力の予測として解釈すべきではありません。.
この例は、単一の工程の非常に高い効率であっても、数十回の繰り返しを経て化学的に単純な最終製品を保証しない理由を示すだけだ。.
そのため、ペプチドの合成の監視と汚染の制御は、最終的なアミノ酸の追加後にではなく、ペプチドの合成の全過程において重要です。.
自動化、暖房、およびその他の技術的なソリューションは合成を加速する可能性があるが、プロセス速度は常に製品の品質とともに評価されるべきである。.
マイクロ波補助SPPSによる研究では、レジメの種類の依存した残りの還元およびアスパルミチドの生成を分析し、反応条件が特定の配列の特性に合わせて引き続き調整されなければならない理由を示した。[7]
粗製品の分離と回収
脱脂は載荷から製品を取り出すプロセスです。
ペプチドの計画された配列が構築されると、通常、そのペプチドを担持体から化学的に分離する。.
この段階は切断と呼ばれ、つまり分解である。.
脱脂は、ペプチドと担体との間に意図的に設計された化学的結合を断ち切る。.
適用される戦略に応じて、部分またはすべての側面鎖の保護群の除去と同時に分解が起こる可能性があります。他のプロセスでは、計画されたさらなる化学的変化がなされる場合、ペプチドまたはその断片は一部の保護機構を維持しながら解放される可能性があります。.
放出の適切な化学反応は、結合剤と最終分子によって異なります。.
1つのペプチドを効果的に解離させる条件は、別のペプチドの化学的に敏感なグループを損傷する可能性がある。.
したがって、脱分化は、すべてのペプチドに適した一連の汎用的な活性物質または条件ではなく、化学的目標を記述する。.
同様に、ペプチドの骨格の正しい構成は、すべての保護基がその後効果的に除去されたことを示さない。.
チェーンの組み立てと安全装置の除去は、さまざまな化学物質に対応しており、別途評価が必要です。.
除去条件は汚染プロファイルに影響を与える可能性がある
分離は化学的に無害なステップである必要はない。.
保護群の除去およびペプチドと載体との結合の断絶は、ペプチドまたは混合物の他の成分を改変する能力を持つ活性化学形態の生成をもたらす可能性がある。.
そのため、開発された手法では、いわゆるスカベンジェリーと呼ばれる化合物が用いられ、それらは特定の不要な活性生成物を捕捉し、副生成物の生成を抑制する。.
2019年の研究では、エキナチ酸をペプチド系樹脂から除去する際の様々なスクラブゲンを分析し、その選択が粗製品の品質および観察された汚染プロファイルに影響を与えていることを示した。[8]
その根拠から、普遍的な除去レシピを作成すべきではありません。.
一方、この段階の条件は製品の品質に影響を与える可能性があるため、特定のペプチドおよび適用される保護群システムごとに評価されるべきである。.
したがって、正しい分解プロセスにはいくつかの側面があります。.
ペプチドは適切に分離され、必要な保護基は除去され、最終物質は回収され、不要な化学変化は制御される必要があります。.
生製品の回収は最終的な浄化ではありません
脱附処理の後、ペプチドを含む材料と反応混合物の残りの成分を分離するプロセスが行われます。.
その際、溶解度、揮発性、またはその他の化学的性質の違いを利用することができます。.
しかし、可視的な沈殿物またはペプチドを含むフラクションが回復したという事実は、その物質が意図された製品のみから構成されていることを示さない。.
この段階では通常、粗タンパク質について言います。.
この物質には、ターゲット分子とデリエーション配列、短鎖化された鎖、化学的に改変されたペプチド、不完全に分解された構造、反応物由来の物質、およびその他の汚染物質が含まれている可能性があります。.
特定の汚染物質の重要性は、その配列、合成条件、および意図された用途によって異なります。.
ある研究では、SPPSの生合成物を特徴づけるためにクロマトグラフィーの分離と質量分析を組み合わせ、各クロマトグラフィーのピクを特定のペプチドに割り当てた。 [9]
これは、分離法と構造法によって得られた情報が相互に補完される理由を示しています。.
クロマトグラフィーでは多くの成分の存在が示されることがありますが、質量分析計ではそれらのうちのいくつかが何であるかを判断するのに役立つ追加情報が得られます。.
認証と本人確認はさまざまな質問に答える
精製は、ターゲット分子を他の成分から濃縮または分離することを目的とする。.
一方、同定は、分離された物質が実際に期待される化学特性を有するかどうかという疑問に答えるものです。.
これらの質問は部分的に一致していますが、同じではありません。.
良好な分散クロマトグラフィーピクは、分子構造の完全な証拠とは自動的にならない。.
同様に、期待される分子量を得るだけでは、純度や構造的妥当性に関する完全な評価にはならない。.
配列の近縁な変異体、立体異性体、または化学的に改変された形態は、識別または分離が困難である可能性がある。.
したがって、その合成過程で生成された実際の混合物と比較してその精製方法を評価すべきであり、単に別のペプチドで有効であることが証明されたからといって、その方法を十分なものとすることはできない。.
もし最終分子が連結の終了後にディシアーズ化合物、シクロ化、またはその他の変換も必要とする場合、連結の妥当性、構造的均一性、および実際に望ましい成熟した分子形態が生成されたかどうかに関する分析上の疑問が生じる。.
利点、制限事項、および汚染源
なぜSPPSはこれほど広く使われているのでしょうか？
SPPSの最も重要な利点の1つは、液体反応剤の複数回の交換中に生成されたペプチドを保持できることです。.
これにより、繰り返し作業が簡素化され、自動化が可能になります。.
化学者は、アミノ酸の構成ブロックの計画された配列を導入することができ、プロセス化学が許す範囲であれば、非標準のアミノ酸やその他の改変も導入することができます。.
現代の自動システムは、この概念をどの程度まで発展させることができるかを示している。.
2020年の自動化されたフロー合成に関する研究では、164個以上のアミノ酸残基を含むタンパク質鎖の生成が記述されている。その後、精製および折りたためを行った結果、機能的な材料が得られた。[10]
これは技術的な可能性の素晴らしい例です。.
しかし、164残基の配列であること、あるいは長いペプチドやタンパク質であることすべてが、同じほど簡単に得られるというわけではない。.
また、浄化と構造的特性が不要になるという意味でもない。.
この研究は、適切に選択された分子によって達成できる結果を、細心の設計によるシステムによって示している。.
自動化はプロセスを実行するプロセスを制御する。.
しかし、不適切な化学物質を適切なものに変えることはできない。.
したがって、装置の性能、ペプチドの配列、そして分子そのものの挙動を総合的に分析する必要があります。.
一般的な汚染物質はどのようにして形成されるのでしょうか？
SPPSでは、汚染物質の生成につながるさまざまな経路がいくつか存在します。その理解は、最終的な分析試験がなぜ引き続き必要であるかを説明するのに役立ちます。.
アミノ酸の結合が計画通りに進まない場合、または鎖の伸長が停止した場合に、デレクシアン配列または縮小された産物が生成される可能性があります。不完全な鎖がまだ樹脂に結合している可能性があるため、後の洗浄でそれを除去する必要はありません。.
エピメライゼーションとは、適切な中心の立体構造の変遷を意味します。これは分析上特に重要であり、エピメライゼーションは適切なペプチドと同じ分子量を持つことができ、同時に空間構造が異なる可能性があるからです。.
アスパルテミドに関連する化合物は、アスパラギン酸の残基を含む副反応反応の配列に依存して生成される可能性があります。化学的過程によっては、複数の種類の化合物が生成されることがあります。.
保護基団の不完全な除去は、除去されるべき基団が分子と結合している場合に起こります。したがって、ペプチドは理論上は期待される鎖長を持つことができますが、依然として化学構造が不適切である可能性があります。.
脱去に関連する修飾は、ペプチドの最終的な解離または保護基の除去時に発生する可能性があります。したがって、正しい鎖の構成は、ペプチドが変化なしで脱去段階を通過することを保証するわけではありません。.
一方、アグリゲーションに関連する不完全反応は、生成する鎖が反応部位へのアクセスを制限する形で相互作用する場合に発生する可能性があります。反応容器に十分な量の活性物質を導入しても、各反応部位が物理的に利用可能で適切な反応を起こすという保証はありません。.
これらは汚染物質の生成の可能な経路である。.
これは、SPPS方式で取得される各党の票が、上記のすべての種類の不正行為を含んでいるということを意味するわけではありません。.
具体的な合成におけるその重要性は、プロセスに関する知識、分析研究、および適切な品質管理に基づいて決定されます。.
天然のペプチドは、配列の再現以上のものが必要です。
いくつかのペプチドは、単なるアミノ酸配列から導かれるよりも構造的にはるかに複雑である。.
良い例がエピドメリンです。.
表皮の構造特性から、多くの硫黄を含む環および異常な残基が存在することが示された。[11]
したがって、アミノ酸の線形順序を再現するだけでは、本物の成熟したエピドerminを生成したという十分な証拠にはならない。.
この区別は、常在期における表皮合成に関する出版物や検索結果の解釈において重要です。.
この出版物は、完全成熟した分子全体の合成を検証されていない部分、類似物、または他の関連構造を記述する可能性がある。.
ここで [11] として引用されている構造的出版物は、真皮そのものの特性を記述しています。これは SPPS 方式による完全な合成に関する報告ではありません。.
したがって、完全な合成に関する主張は、分子の実際の最終構造に関するものでなければならない。単にアミノ酸配列の線形配列に関するものであってはならない。.
性能、純度、およびアイデンティティはそれぞれ別々に提示されるべきである。
ペプチド合成に関する議論においてよく混同される3つの概念は、性能、純度、および同一性です。.
回収された製品の大量には、その材料の大部分が意図されたペプチドであるということを意味する必要はありません。生物質には、大きな量の汚染物質が含まれている可能性があります。.
同様に、高純度クロマトグラフィーは構造的同一性のすべての側面を自動的に裏付けるわけではない。.
たとえその構造が正確に明らかにされたペプチドであっても、それは自動的に生物学的、治療学的、または臨床的な適用が認められるわけではない。.
これらは別々の問題です。.
したがって、合成の正確な説明には、最終的な分子がどのようなものであったか、性能がどの段階で測定されたか、分析対象の物質が粗いものか、または精製されたものか、および構造に関する主張を裏付けるための分析データがどのようなものだったかを示すべきである。.
これにより、合成結果をより信頼性の高い方法で解釈および比較することができます。.
単一のパーセント値または質量値は、実際に測定された内容を知らずに、ペプチドが「高品質」であるという一般的な主張に変換してはならない。.
よくある質問
1. なぜSPPSでは恒常位相を使用するのですか？
固定相は生成されたペプチドを載置体に保持し、可溶性反応生成物および透過流体は繰り返し導入および除去される。これによって連続鎖の合成が大幅に簡便化され、ペプチド合成の自動化が可能になる。これには現代の自動フロー合成方法が例である。[10] しかし、載置体は必ずしもすべての反応が理想的に進行することを保証せず、また、ポリマー結合された不完全鎖を正常な鎖から分離する能力も保証しない。その主な利点はプロセスを効率化することである。化学選択性、反応の完全性、純度、および構造的同一性は引き続き別途評価が必要である。.
2. 定常相合成は浄化の必要性を排除するのでしょうか？
いいえ。合成中の間に異常なペプチド鎖が樹脂に付着し、その後、意図した製品とともに放出される可能性があります。クロマトグラフィーおよび質量分析法を用いてSPPSの粗い形態を分析した研究では、合成中の洗浄と最終的な精製が異なる機能を発揮していることが示されています。[9] 洗浄は主に樹脂を取り巻く可溶成分を除去しますが、分離後の精製は、不要なペプチドおよび非ペプチド成分から望ましいペプチドを分離することを目的としています。SPPSは中間工程を簡素化しますが、究極的な純度を保証するものではありません。.
3. 「固定相」は溶媒を使用しないことを意味しますか？
いいえ。従来のSPPSでは、不溶解性担体は通常、液体活性物質および溶媒で包まれています。溶媒は、樹脂の結晶化の程度や活性物質が連結鎖に到達する際の容易さなど、樹脂の物理的環境に影響を与えます。実験研究では、樹脂の結晶化は溶媒に依存し、連結鎖の形成や延長に関する化学的変化も同様です。 [2] つまり、樹脂と溶媒はともに反応の環境を形成します。.
4. SPPS の際にペプチドはどの方向に成長するのですか？
従来の段階的な SPPS は通常、C 末端の残りの部分から N 末端に向けてペプチドを合成します。完成した分子の C 末端を構成する最初のアミノ酸は担体に取り付けられ、それ以降の残りのアミノ酸は鎖の露出した末端を延長します。 Fmoc ベースの公開された手法は、この典型的なパターンを示しています。[1] しかし、固定相を利用した特殊な手法も存在し、それらは異なる方法で進行する可能性があります。.
5. 樹脂と接合剤は同じ意味ですか？
いいえ。樹脂は不溶性担体であり、結合剤は担体と成長中のペプチドの間の化学的な結合です。結合剤の機能は、ポリマーそのものに依存することなく、結合、樹脂の保持、およびペプチドの後の放出に影響を及ぼす可能性があります。ペプチド合成における担体の研究は、樹脂の種類を単に指定するだけで、システム全体の挙動を記述するには不十分であることを示しています。[2]
6. ポリマーの付着度を高めることで常に生産性が向上するのですか？
いいえ。より高い積載量は、担体1単位当たりの潜在的な結合部位の数を増加させる意味合いがありますが、これは必ずしも適切に組み立てられ回収可能なペプチドの量を増加させるわけではありません。結合の程度は局所的な分子環境を変化させることがあり、これは樹脂の膨潤に影響を与える要因の一つとして実験的に示されています。[2] 結合鎖が過度に密集している場合や、強く相互作用している場合、反応活性部位の可用性は悪化する可能性があります。したがって、積載量は樹脂の特性、配列挙動、反応効率、および最終製品の品質と併せて分析されるべきです。.
7. なぜアミノ酸はペプチドの合成中に保護されるのですか？
保護群は選択的な活性化群が反応に参加することを一時的に妨げます。同時に特定の結合が形成されます。これにより、制御された段階的な鎖合成が可能になります。しかし、保護群はすべての副反応を排除するわけではありません。例えば、モデルシステムでの研究では、保護群戦略と周囲の配列がアスパルティミドの生成に影響を与えることが示されました。[5] 保護群は化学的選択性を提供しますが、保護と解除の全体的な戦略は依然として慎重な計画と評価を必要とします。.
8. 機能群の正交保護とはどういう意味ですか？
正交性は、必要な他の保護を十分な程度に保持した状態で1つの保護群を削除できることを意味します。これにより、合成の計画された段階において特定の活性部位が明らかになるようになります。確立されたSPPS手法は、同時により多くの活性基を明らかにするのではなく、制御された保護と解除のプロセスに基づいています。[1] しかしながら、実際に使用される保護が最終分子および反応条件によって依然として適合しているかどうかは、依然として疑問です。.
9. Fmoc と Boc は異なる種類のペプチドを表すのでしょうか？
いいえ。 Fmoc と Boc は保護基であり、それに関連する合成戦略であり、ペプチド骨格の異なる種類ではありません。除去化学における違いは合成方法に影響を与えますが、最終的な目的のペプチドの構造とは一時的な保護基化学を混同してはなりません。FMOCに基づく公開された手法は一般的な SPPS の1つの手法を示していますが、これはすべてのペプチドがこの方法で合成される必要があるという意味ではありません。[1]
10. 第1段階の接続で汚染が発生する可能性があるか？
はい。接合工程は、連続的な鎖の延長を開始する前に、立体構造の品質に影響を与える可能性があります。保護されたアミノ酸を樹脂に結合する際のラセミ化の測定に特化した分析手法が開発されました。[3] これは、各接合が重大なラセミ化を引き起こすという意味ではありません。しかし、接合そのものが、一般的な品質評価において考慮されるべき重要な化学的ステップであるということを示しています。.
11. なぜ一部のペプチド配列は難易度が高いとされているのでしょうか？
一部の増殖ペプチド鎖は、活性部位へのアクセスを制限する形で互いに作用したり、隣接する鎖と作用します。水素結合、疎水性相互作用、および凝集類似の挙動は、後の結合を困難にすることがあります。凝集性の高い配列の研究では、結合方式の変化が粗製製品の組成に影響を与える可能性があることが示されています。[4] 合成の難易度は、分子の性質と反応条件に左右されるものであり、ペプチドの長さだけではなく、それ自体です。.
12. より速い合成が常により良い製品を意味するのでしょうか？
いいえ。合成速度と製品の品質は別々のパラメータです。加熱、マイクロウェーブ補助、および自動化はプロセス時間を短縮する可能性がありますが、反応速度を加速することは望ましい反応と副反応のバランスを変化させる可能性もあります。マイクロウェーブ合成の研究では、残留物の種類による反応の妥当性およびアスパルミートの生成が依存していることが示されており、適切な条件下での制御が必要であることを示しています。[7]合成時間が短くなることは、得られた材料が必要な化学的および分析的基準を満たしている場合にのみ有利です。.
13. 除去とは、単に樹脂の粒子を取り除くことですか？
いいえ。脱脂は、ペプチドと担体との設計された結合を断ち切る化学的プロセスです。一方で、樹脂粒子をろ過法で除去することは、化学的脱脂プロセスの正常な進行を証明する物理的な分離操作ではありません。ペプチドの放出は、保護基の除去および他の反応とともに起こる可能性があります。脱脂時に使用されるスクレーバーの研究では、このステップが汚染プロファイルの変動に影響を与える可能性があることが示されています。[8]
14. 原物料の高い生産効率はペプチドの純度が高いことを意味するのでしょうか？
いいえ。収率とは、すべての不要な成分を除去する前に回収された材料の量を表すものです。この材料には、ターゲットペプチドとデリバリーシーケンス、改変された構造、残存する保護基、およびその他の不純物が含まれる可能性があります。クロマトグラフィーおよび質量分析法を用いてSPPS粗混合物を研究した研究では、回収された質量、純度、および分子の同一性がそれぞれ別の解釈を必要とする理由が示されています。[9]したがって、信頼できる報告された収率は、その測定が行われたステップと、その材料がすでに精製されたかどうかを示すべきものです。.
15. SPPSでは長いペプチド鎖の生成が可能ですか？
はい。慎重に設計された SPPS の手法により、非常に長い鎖の合成が可能になります。自動合成の研究では、164 個以上の残基を含む鎖が生成され、その後機能評価のために精製およびフラグメント化が行われます。[10] これは最新のペプチド合成の可能性を示していますが、同じ長さのすべての配列を同等の効率で合成できるわけではありません。長さは一つの要因にすぎません。配列依存的なアグリゲーション、副反応、フラグメント化の要件、および洗浄の難易度も重要です。.
16. エピダーミンの配列を構築することによって、その完全な合成が行われるのでしょうか？
いいえ。成熟した表皮には、単にアミノ酸の線形配列を超えた硫黄を含む環を含む非典型的な構造要素が含まれています。これらは構造研究で実証されています。[11] したがって、線形配列、前駆体、または断片を得ることは、完全な成熟した分子の合成を自動的に意味するわけではありません。完全な合成の主張には、意図された結合およびその他の必須構造要素の複製を確認する分析データが必要です。.
17. 期待される分子量は構造の完全な正確性を裏付けているか？
いいえ。期待される分子量を得ることは有益な情報ですが、単なる分子量ではペプチド構造のすべての側面を裏付けることはできません。2つの分子は同じ分子量を示すことがあり、同時に立体異性体や特定の構造を持つこともあります。分離されたエピメラーゼペプチドを用いた研究は、立体異性体による違いが、単に質量測定によって識別できない構造を識別する分析手法を必要とする理由を示しています。[12]したがって、最終的な特性評価は、現実的な不純物および特定の合成中に発生する可能性のある代替構造を考慮して設計されるべきです。.
概要
固定相でのペプチド合成によりペプチドの化学構造が変化し、繰り返し導入、反応の実行、および可溶性活性物質の除去を行う際に、成長中の鎖を不溶解性担体に保持することが可能になりました。これにより、シーケンスの段階的な構築が容易になり、自動合成の実際的な基礎となります。.
この方法の表面的な単純さは、各段階で起こる化学過程を隠蔽するものではないはずです。.
樹脂、結合剤、および加水分解の程度は合成環境の重要な特性に影響を与えます。溶媒依存のプッチングは、樹脂に関連する鎖へのアクセスに影響を与えます。保護基はどの機能群が反応できるかを制御しますが、結合反応は残基同士の結合構造を構築します。[1][2]
これらの段階それぞれには限界があります。.
初期の連結は立体構造の質に影響を与える可能性がある。[3] 難易度の高い配列では、活性物質のアクセスが制限される可能性がある。[4] 保護基の固定および除去化学は、アスパルティミドの生成などの副反応を促進する可能性がある。[5][6] 加速された合成条件では、ラセミ化の程度または汚染プロファイルが変化する可能性がある。[7] 脱離条件は、粗製品の組成にも影響を与える可能性がある。[8]
したがって、正しい鎖の構成は、純粋で適切に特定されたペプチドの獲得と同義ではない。.
粗製品の回収、精製、および構造的特性はそれぞれ別の段階である。クロマトグラフィーは混合物の組成および純度に関する情報を提供するが、質量分析法およびその他の分析手法は同定に関する情報を提供する。単一の分析結果がペプチドの構造のすべての側面を裏付ける必要はない。[9][12]
現代の自動化されたフロー合成は、適切に設計された条件下では、非常に長い鎖にも適用可能であることを示している。[10] 同時に、構造的に複雑なペプチド、例えばエピドerminは、成熟した分子が追加の環、非標準な残基、または特定の結合配列を含む場合、単にアミノ酸配列を再構築するだけで十分ではないことを示している。[11]
SPPSを単一の反応としてではなく、化学的および分析的段階の連続として理解するのが最善です。.
接合は出発点を示します。繰り返し行われる保護、解除、および結合のサイクルは計画された鎖を構築します。分離は生成物を解放します。洗浄は不要な成分からターゲット分子を分離します。最終的な特性評価により、分離された物質が実際に与えられた構造と品質を持つかどうかを判断することができます。.
これらの段階を分離することで、いくつかの一般的な誤解を回避できます。成功した合成は自動的に純度を保証するわけではなく、高い効率は自動的に同一性を保証するわけではなく、期待される分子量自体では構造的完全性が保証されるわけではありません。.
参考文献
- コイン、I., ベイヤーマン、M., ベイナーツ、M. (2007). 固体相ペプチド合成：標準的手順から困難な配列の合成まで。. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- アマディ・カムラウ、C、クラーク、H、マクロビー、M、モルティマー、J、ノース、M、ラン、Y、ルートウェイズ、A、シバルド、D、ティキアス、M、ツェ、K、ウィルウェイ、H (2020). 緑色溶媒中の樹脂の膨張に影響を与えるパラメーターの調査。. 化学Open, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- アダムソン、J. G.、ホーアン、T.、クリヴィチ、A.、およびラジョイ、G. A. (1992)。アミノ酸を固体支持体に固定した際に、マーフィー試薬を用いてペプチド合成においてラセミ化を定量化する。. 分析化学、202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- カポラリー、A., ドティ、N., サンドモネンコ、A., & ルボウ、M. (2017). ペプチド配列の集約において、オキサマとHATUを併用した評価。. ペプチド科学ジャーナル、23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Fmoc ベースの SPPS におけるアスパルミド問題 Part I. ペプチド科学ジャーナル、9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Fmoc-ベースのSPPSにおけるアスパルミチド問題。パートII。. ペプチド科学ジャーナル、9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). マイクロ波増強Fmoc固相ペプチド合成におけるラセミ化およびアスパルチミド生成の抑制。. 『Journal of Peptide Science』、13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas、J., Svensson、T., & Rasmussen、J. H. (2019). 緑色ペプチド樹脂の分解を抑制する活性物質としての1,4-ベンゼンドイメタンチオール（1,4-BDMT）。. RSC アヴァンス、9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop、K., Davidson、W., Hansen、G., Freeman、D., & Pallai、P. (1991). mu-HPLC/高速原子爆撃質量分析法による固体相ペプチド合成による粗製品の特性評価。. ペプチド研究、4(1), 40–46. パブコメ
- ハートラムプフ、N., サエビ、A., プスコス、M., ガットレス、Z. P., カッラーハン、A. J., コーファー、A. E., ハッナ、S., アンティラ、S., シセッル、C. K., クォターラロ、A. J., 叶、X., ミヤリス、A. J., シモン、M. D., ロアス、A. J., 劉、S., ジェッセン、C., ニールセン、T. E.、およびペンテルーテ、B. L. (2020). 自動フロー化学によるタンパク質の合成。. 科学、368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- オールガイヤー、H.、ユング、G.、ワーナー、R. G.、シュナイダー、U.、ザーナー、H. (1986). エピデリン：ヘテロジックな四環環状21ペプチドアミド抗生物質の配列決定。. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- 宮澤、T., 遠松、T., 山田、T., & 古畑、S. (1992). 保護されたエピメラーゼペプチドをリバースフェーズ高機能液体クロマトグラフィーにより分離することによるペプチド合成におけるレシマライゼーション研究。. ペプチドおよびタンパク質研究国際ジャーナル、39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x