A síntese de peptídeos em fase sólida, mais comumente conhecida como SPPS (síntese de peptídeos em fase sólida), é uma metodologia química para a construção de peptídeos a partir de aminoácidos, enquanto um dos extremos da cadeia formada permanece covalentemente ligado ao suporte insolúvel.
Em vez de isolar o peptídeo formado após cada reação, os químicos o mantêm ligado à fase sólida, introduzindo e removendo sucessivos reagentes líquidos e soluções de lavagem. Os ciclos repetidos permitem revelar a parte ativa da amina, ligar o próximo aminoácido e remover os componentes dissolvidos que já não são necessários. Após a construção da sequência de aminoácidos planejada, o peptídeo pode ser separado do suporte e submetido a mais processamento e análise.
Essa organização do processo é um dos principais motivos pelos quais a SPPS se tornou uma metodologia tão importante na química de peptídeos. A fase fixa simplifica a execução de muitas operações químicas repetitivas e possibilitou a automatização da síntese.
A conveniência da síntese em fase fixa não significa, no entanto, uma garantia de excelência química.
A ligação do peptídeo em desenvolvimento ao suporte não garante que cada cadeia receba todas as aminoácidos planejados. Também não significa que o material liberado no final do processo seja quimicamente puro ou tenha a estrutura correta.
A montagem da cadeia, a desengastamento e a recuperação do produto, a purificação, a verificação da identidade e a caracterização estrutural final são partes distintas de todo o processo.
As publicações metodológicas atuais demonstram tanto a utilidade do SPPS quanto a necessidade de modificar as metodologias padrão em caso de sequências complexas. Em uma das metodologias publicadas que utilizam a estratégia Fmoc, por exemplo, é descrita a síntese rotineira, mas também uma abordagem modificada para sequências peptídicas sensíveis à agregação. [1]
Para compreender o SPPS é necessário algo mais do que memorizar as etapas químicas seguintes. É também necessário saber qual é o objetivo de cada etapa, o que pode dar errado durante ela e quais perguntas analíticas ainda precisam ser respondidas após sua conclusão.
O que é a síntese de peptídeos em fase sólida?
O peptídeo resultante permanece unido e as soluções variam
Na SPPS convencional, o peptídeo é ligado quimicamente a pequenas partículas insolúveis, geralmente chamadas de grãos de resina, através de um ligante químico apropriado.
As sementes permanecem no sistema reativo, enquanto os reagentes líquidos e as soluções que se deslocam são introduzidos e removidos.
Isso simplifica significativamente a síntese repetitiva.
Na síntese clássica em fase contínua, a separação e a purificação do peptídeo em crescimento após cada adição de aminoácido podem ser incômodas. No SPPS, a cadeia formada permanece ligada à fase insolúvel. Isso permite que os excessos de reagentes dissolvíveis e muitos produtos secundários sejam removidos por lavagem, enquanto o peptídeo ligado à resina permanece no local.
O termo „fase estacionária” pode, no entanto, levar a equívocos.
Isso não significa que a formação de ligações peptídicas ocorra sem a participação de líquido ou solvente.
A polímero é geralmente envolto por um meio reativo líquido e a sua interação com o solvente pode influenciar significativamente o curso da síntese. Os reagentes ainda devem se deslocar no meio polimérico ou ao seu redor e chegar aos locais reativos do peptídeo em crescimento.
A ligação do peptídeo ao suporte geralmente é de natureza covalente. Isso significa que a molécula resultante é ligada ao suporte por meio de um ligante por meio de uma ligação química.
O peptídeo, portanto, não está simplesmente preso entre as partículas, preso por um filtro ou depositado vagamente na superfície.
Essa combinação química é projetada de forma deliberada para que a cadeia formada permaneça unida durante as seguintes reações e etapas de lavagem, podendo ser libertada em condições adequadas posteriormente.
A síntese convencional ocorre a partir do extremo C em direção ao extremo N.
A estratégia linear clássica do SPPS geralmente começa com um aminoácido que, no peptídeo acabado, será o seu extremo C.
O resto é anexado ao suporte.
Após a desativação da respectiva cadeia amino-reativa, é adicionado outro aminoácido protegido e este é covalentamente ligado à cadeia formada. Essa sequência de reações prolonga gradualmente o peptídeo no sentido do extremo N.
Vale a pena destacar esse caminho, pois ele difere da síntese biológica de proteínas por ribossomos.
A síntese ribossomal prolonga o polipeptídeo desde o extremo N para o extremo C. A SPPS convencional geralmente constrói a sequência no sentido inverso.
A sequência final de aminoácidos pode, no entanto, ser idêntica. A forma como ela é construída é diferente.
É importante definir a expressão „convencional”, pois a química de peptídeos também inclui estratégias especializadas que utilizam locais de ligação alternativos, a síntese de fragmentos, reações de ligação e outras soluções não convencionais.
A descrição do caminho de C- ao fim do N refere-se, portanto, a um processo SPPS típico, e não a todas as possíveis metodologias de química peptídica que utilizam a fase sólida.
O SPPS é apenas um dos elementos na produção de peptídeos
A síntese em fase sólida não é o único método para obter peptídeos.
Os peptídeos também podem ser obtidos por síntese química em solução, sistemas de expressão biológicos, transformações enzimáticas, ligação de fragmentos ou combinações de diferentes métodos.
O SPPS é particularmente útil quando é necessário o controle da síntese de sequências e a utilização de blocos de aminoácidos protegidos, modificados ou especializados de outra forma.
Mesmo em um projeto específico que aborda um peptídeo específico, nem sempre é necessário usar a mesma metodologia de início a fim de fim.
Os fragmentos individuais do peptídeo podem, por exemplo, ser sintetizados em uma resina, separados e posteriormente combinados por outra via química. Outras moléculas podem exigir plegamento, oxidação, ciclibação ou outras alterações estruturais após a obtenção da sequência linear inicial.
A escolha da via adequada depende, portanto, da molécula final, da sua complexidade estrutural e dos requisitos analíticos e qualitativos do projeto.
O processo vale a pena ser considerado como uma série de perguntas sucessivas.
A ligação ao suporte marca o ponto de partida e influencia a subsequente química de liberação do produto. No entanto, ainda é necessário determinar se a ligação ocorreu corretamente e se a integridade estereoquímica foi preservada.
A construção da cadeia deve levar ao acoplamento dos aminoácidos na ordem prevista. Entretanto, é necessário verificar se todas as cadeias reagiram corretamente e se não foram produzidas sequências com aminoácidos faltando, produtos abreviados ou modificados.
A despolimerização e remoção dos grupos de proteção têm como objetivo libertar o peptídeo e eliminar determinados compostos químicos de proteção. No entanto, o próprio processo de libertação eficaz do produto não indica quais outras substâncias estão presentes no material bruto.
O processo de purificação serve para separar o material desejado dos componentes indesejados, mas mesmo a fração purificada ainda exige a confirmação da identidade e a avaliação da qualidade.
A caracterização estrutural e analítica final tem, no entanto, a função de responder à questão de saber se o material isolado possui as propriedades químicas esperadas para o peptídeo alvo e se os métodos analíticos utilizados são adequados para a aplicação pretendida.
Esses são passos conceituais, não uma instrução de laboratório. Os reagentes específicos, a instrumentação e as condições de reação dependem do peptídeo a ser produzido e exigem uma metodologia devidamente desenvolvida e validada.
A conexão com a resina e a colocação da cadeia
A colofonia, o ligante e o grau de polimerização desempenham funções diferentes
Nas discussões sobre o SPPS, frequentemente surgem três termos: resina, ligante e grau de preenchimento, ou seja, loading.
Elas descrevem propriedades relacionadas, mas diferentes.
A resina é um material insolúvel que serve como suporte.
O ligante proporciona uma ligação química entre esse suporte e o peptídeo ou a primeira sequência de aminoácidos. Sua química pode influenciar tanto a forma como o peptídeo se liga quanto a sua posterior liberação.
Loading descreve, por sua vez, o número de locais de conexão reativos em relação à quantidade de suporte.
Esses termos não são sinónimos.
Duas polímeras podem parecer fisicamente muito semelhantes, mas simultaneamente apresentar grupos funcionais diferentes, ligações ou graus de polimerização. Essas diferenças podem afetar a disponibilidade de locais reativos durante a formação da cadeia, o espessamento da polímera e a forma química do peptídeo final após a despolimerização.
Outro elemento importante é o grupo planejado no C-end.
Diversos sistemas suporte-ligação podem ser selecionados, por exemplo, de forma a obter um peptídeo com um grupo carboxílico ou amido.
Esta é uma diferença química importante.
A mudança de grupo terminal implica uma mudança na própria molécula, e não apenas na forma como ela é embalada ou descrita.
O encurtamento afeta o acesso aos elos conectados
Muitas substâncias utilizadas em SPPS absorvem o solvente e se expandem ao entrarem em contato com o meio líquido apropriado.
Isso altera o ambiente polimérico e pode aumentar ou diminuir o espaço pelo qual os reagentes dissolvidos precisam se deslocar para alcançar as cadeias peptídicas relacionadas à polímero.
A compressão não é, portanto, apenas uma curiosidade física.
Pode afetar a disponibilidade de grupos reativos durante a síntese.
Um estudo sistemático sobre os transportadores à base de poliestireno e PEG revelou que características como o tipo de ligação e o grau de polimerização da resina influenciaram significativamente a espessura na dissolução em solventes mais ecológicos testados. Além disso, constatou-se que a espessura pode variar durante a remoção dos grupos protectores e à medida que o comprimento da cadeia peptídica aumenta. [2]
Isso mostra que as propriedades da cera não podem sempre ser consideradas como características constantes dela.
Na prática, isso depende da interação da resina, do solvente, do ligante, do peptídeo ligado e do estágio atual da síntese.
Uma boa compatibilidade ou um resultado favorável da reação para uma combinação de resina, solvente e peptídeo não significam, portanto, que outra combinação se comportará de forma idêntica.
O próprio processo de conexão também exige controle de qualidade.
A primeira etapa da ligação pode parecer simples, pois a cadeia peptídica ainda está apenas a começar a formar-se.
O erro introduzido neste estágio pode, no entanto, permanecer presente durante toda a síntese posterior.
Se a primeira remanescente for ligada incorretamente ou durante esse processo a sua configuração estereoquímica for alterada, a adição correta de todas as remanescentes subsequentes não precisa corrigir o problema inicial.
Em um estudo de 1992, foi desenvolvida uma metodologia analítica especificamente destinada ao monitoramento da racemização que ocorre durante a ligação de aminoácidos protegidos a suportes fixos. [3]
A importância deste trabalho vai além da própria metodologia analítica utilizada.
Ela demonstra que a qualidade estereoquímica pode exigir controle ainda antes do início dos ciclos repetidos de alongamento da cadeia.
A quantidade de material inicialmente anexado ao suporte também requer uma interpretação adequada.
O grau nominal de polimerização da polímero, o carregamento medido experimentalmente, a quantidade de material bruto recuperado após a despolimerização e a produtividade final do peptídeo isolado e purificado são valores diferentes.
Não devem ser considerados indicadores alternativos do sucesso da síntese.
Lançamentos mais longos podem tornar-se mais difíceis de obter
À medida que o elo peptídico se alonga, a própria molécula individual começa a influenciar seu ambiente químico.
As cadeias vizinhas podem interagir entre si através de ligações hidrofílicas, interações hidrofóbicas e outras forças intercátionais. Algumas sequências podem apresentar uma tendência particularmente forte para tais interações.
Isto pode limitar o acesso aos grupos reativos.
Nesta situação, a ligação ao próximo aminoácido pode tornar-se mais difícil, mesmo que um suprimento aparentemente suficiente de ligante tenha sido introduzido no sistema.
Em um estudo sobre sequências difíceis e suscetíveis a agregação, diferentes métodos de agregação foram comparados e os produtos finais obtidos foram analisados. Os resultados corroboram a ideia de que o processo deve ser adaptado à sequência específica, em vez de presumir a existência de uma estratégia de agregação que seja sempre a melhor. [4]
Isso também explica por que o simples aumento do grau de polimerização da resina ou da quantidade de reagente não resolve automaticamente todos os problemas.
Se o problema principal for o acesso limitado aos locais reativos, torna-se mais importante do que a questão da quantidade de reagente adicionado a perguntar-se se este realmente chegou aos locais adequados e se a reação ocorreu de forma eficiente sem a formação de quantidades indesejáveis de produtos secundários.
Proteção, remoção de grupos de proteção e vinculação
Grupos de proteção estão controlando o local da reação
As aminoácidos contêm grupos químicos capazes de participar em diversas reações.
Durante a síntese controlada de um peptídeo, os químicos geralmente desejam que um determinado grupo amino reaja com um bloco específico que contém um grupo carboxílico, enquanto outros locais potencialmente reativos permanecem temporariamente inativos.
É exatamente isso que as equipes de proteção servem.
Temporariamente bloqueiam os locais de reação selecionados, permitindo que outro local participe na reação planejada.
Na estratégia SPPS amplamente utilizada, baseada em Fmoc, o grupo amino final da cadeia crescente permanece protegido entre as etapas subsequentes de ligação. Quando um novo aminoácido deve ser adicionado, a proteção temporária é removida, revelando o grupo amino.
As cadeias laterais reactivas podem conter grupos de proteção separados, projetados de forma a permanecerem intactos durante os ciclos repetidos de construção da cadeia principal.
O objetivo é a selecção controlada.
Um bloco adequado que contenha um grupo carboxílico deve se ligar a um grupo amino adequado, em vez de levar a uma desregulação não controlada ou a outras reações competitivas.
Ortogonalidade significa a possibilidade de eliminar os mecanismos de segurança de forma seletiva.
A estratégia ortogonal de grupos de proteção permite remover um grupo de proteção em condições em que os outros recursos necessários permanecem suficientemente intactos.
Isso dá ao químico a possibilidade de revelar de forma controlada diferentes locais reativos em diferentes etapas da síntese.
O Fmoc e o Boc são termos bem conhecidos na química de peptídeos, mas não significam diferentes tipos de ligações peptídicas nem diferentes estruturas terminais do peptídeo.
São grupos de proteção relacionados a diferentes estratégias de síntese e a diferentes métodos de sua eliminação.
A via química temporária utilizada durante a construção do péptido deve portanto ser distinguida de sua estrutura final.
Os medicamentos não proporcionam também uma proteção completa contra todas as possíveis reações secundárias.
Investigações sobre a formação de aspartimidina, por exemplo, mostram que a estratégia de proteção, as restrições aminoacídicas adjacentes e as condições de remoção dos grupos de proteção podem influenciar na formação de contaminantes mesmo em métodos de SPPS bem conhecidos. [5] [6]
A estratégia de grupos de proteção, portanto, limita certas reações indesejáveis, mas não elimina a necessidade de controle do processo nem a caracterização analítica final.
A ligação cria uma nova ligação amida no esqueleto peptídico.
A reação de ligação leva à formação de uma nova ligação amidada no esqueleto peptídico.
O bloco de aminoácidos que contém o grupo carboxílico é geralmente ativado quimicamente para que possa reagir efetivamente com o grupo amino descoberto no peptídeo em crescimento associado à fita.
Após o término do reagrupamento, o excesso de material solúvel pode ser removido por filtragem.
O aminoácido recém-adicionado então se torna a última parte do cadeado crescente. Em seguida, é possível revelar a sua cadeia de aminoácidos e iniciar um novo ciclo de ligação.
Teoricamente, a repetição dessa sequência permite controlar a ordem dos aminoácidos, controlando a sequência de inserção dos blocos de construção.
Na prática, existe, no entanto, uma importante advertência:
A reação química planejada deve realmente ocorrer corretamente em cada ciclo.
Se uma conexão for incompleta, parte das cadeias pode não receber a parte planejada.
Se permanecerem ligados à polímero e reagirem corretamente no próximo ciclo, podem ser formadas sequências delecionais, ou seja, moléculas de peptídeo que não contêm um ou vários aminoácidos programados.
Outras cadeias podem permanecer curtas.
O lavagem remove os reagentes dissolvíveis e os produtos secundários, mas não elimina selectivamente todos os cadeias anormais, que ainda estão covalentemente ligadas ao suporte.
Perdas pequenas podem acumular-se em vários ciclos
O caráter repetitivo do SPPS leva a um problema matemático importante.
Uma pequena imperfeição em um único passo pode parecer insignificante, mas após muitas repetições, seus efeitos podem se acumular.
Vamos considerar um exemplo matemático simples.
Se a síntese do peptídeo exigisse 50 etapas de ligação e cada uma delas tivesse, por si só, uma probabilidade de 99% de conclusão correta, a proporção teórica de moléculas que concluíssem com sucesso todas as 50 etapas seria de cerca de 60,5%.
Esta é apenas uma ilustração.
Ela pressupõe que todas as etapas se comportam de forma idêntica e independente. Não leva em conta problemas de remoção de grupos protetores, reações adversas, perdas durante a separação e purificação, agregação ou muitos outros fatores reais.
Portanto, não deve ser interpretado este resultado como uma previsão da produtividade real da produção.
O exemplo mostra apenas por que mesmo uma performance muito alta em etapas individuais não garante um produto bruto quimicamente simples após várias dezenas de repetições.
Por isso, o monitoramento da síntese e o controle das impurezas são importantes durante todo o processo de síntese do peptídeo, e não apenas após a adição do último aminoácido.
A automação, o aquecimento e outras soluções tecnológicas podem acelerar a síntese, mas a velocidade do processo deve sempre ser avaliada juntamente com a qualidade do produto.
O estudo sobre a SPPS com microfones analisou a racemização dependente do tipo e a formação de aspartimid, demonstrando por que as condições da reação ainda devem ser ajustadas às propriedades da sequência específica. [7]
Descascamento e recuperação do produto bruto
A desclipagem libera o produto do suporte.
Após a construção da sequência peptídica planejada, geralmente é necessário separar-a quimicamente do suporte.
Este passo é conhecido como clivagem, ou seja, desprendimento.
A despolimerização interrompe a ligação química deliberadamente projetada entre o peptídeo e o suporte.
Dependendo da estratégia utilizada, a despolimerização pode ocorrer simultaneamente com a remoção de partes ou de todas as unidades de proteção das cadeias laterais. Em outros processos, o peptídeo ou um seu fragmento pode ser libertado mantendo algumas proteções, se forem previstas alterações químicas posteriores.
A química de liberação apropriada depende do ligante e da molécula alvo.
As condições que efetivamente libertam um peptídeo podem danificar a parte química do outro.
Por isso, a desacetilação descreve um objetivo químico, e não um conjunto universal de reagentes ou condições adequadas para todos os peptídeos.
Da mesma forma, a construção correta do esqueleto do peptídeo não prova que todas as unidades de proteção foram posteriormente efetivamente removidas.
A montagem da cadeia e a eliminação final dos dispositivos de segurança respondem a diferentes questões químicas e exigem uma avaliação separada.
As condições de desintoxicação podem influenciar no perfil de poluição
A desparasitação não precisa ser um processo químico neutro.
A remoção das unidades de proteção e a ruptura da ligação peptídica ao suporte podem levar à formação de formas químicas reativas capazes de modificar o peptídeo ou outros componentes da mistura.
Por isso, os métodos desenvolvidos podem utilizar os chamados scavengers, ou seja, compostos que captam determinados produtos reativos indesejados e influenciam a formação de produtos secundários.
Em um estudo de 2019, vários scavengers foram analisados durante a descaracterização do exenatido a partir de uma resina peptídica e constatou-se que a sua escolha influenciou a qualidade do produto bruto e o perfil de poluição observado. [8]
Não devemos basear essa decisão numa receita universal para a desintoxicação.
O estudo mostra, no entanto, que as condições deste passo podem influenciar a qualidade do produto e, portanto, devem ser avaliadas para cada peptídeo específico e para o sistema de grupos de proteção utilizado.
O processo de desprendimento correto tem, portanto, vários aspectos.
O peptídeo deve ser removido adequadamente, os grupos de proteção necessários devem ser removidos, o material alvo deve ser recuperado e as alterações químicas indesejadas devem ser controladas.
A recuperação do produto bruto não é um processo final de purificação
Após a despolimerização, realiza-se um processo que permite separar o material que contém o peptídeo da resina fixa e das outras partes dos componentes da mistura reativa.
Além disso, é possível aproveitar as diferenças na solubilidade, viscosidade ou outras propriedades químicas.
A recuperação de uma massa visível ou de uma fração contendo um peptídeo, no entanto, não prova que o material se compõe exclusivamente do produto pretendido.
Neste estágio, geralmente se fala em peptídeo cru.
Ele pode conter a molécula-alvo juntamente com sequências de deleção, cadeias curtas, peptídeos modificados quimicamente, estruturas parcialmente desestruturadas, materiais provenientes de reagentes e outras impurezas.
A importância de cada um dos poluentes depende da sequência, das condições de síntese e do uso pretendido.
Em um estudo, o método cromatográfico foi combinado com a espectrometria de massa para caracterizar os produtos finais do SPPS e atribuir os diferentes pontos cromatográficos aos peptídeos específicos. [9]
Isso mostra por que as informações obtidas através de métodos de separação e estruturais se complementam mutuamente.
A cromatografia pode revelar a presença de vários componentes, enquanto a espectrometria de massa pode fornecer informações adicionais que ajudam a determinar o que podem ser alguns deles.
A verificação e a confirmação da identidade respondem a várias perguntas
A purificação visa enriquecer ou isolar a molécula alvo entre outros componentes.
A identificação, por outro lado, responde à questão de saber se o material isolado realmente possui as propriedades químicas esperadas.
Estas perguntas são parcialmente coincidentes, mas não são a mesma coisa.
Uma picro cromatográfica bem distribuída não constitui automaticamente uma prova completa da estrutura da molécula.
Da mesma forma, obter a massa molecular esperada por si só não é uma avaliação completa da pureza ou da validade estrutural.
Variantes de sequência geneticamente próximas, estereoisómeros ou formas modificadas quimicamente podem ser difíceis de distinguir ou de separar.
A metodologia de purificação deve portanto ser avaliada em relação à mistura real formada durante a síntese em questão, e não ser considerada suficiente apenas porque tenha funcionado em outro peptídeo.
Se a molécula final também exige a formação de pontes disarsínicas, ciclicações ou outras transformações após a conclusão da formação da cadeia, surgem novas questões analíticas relativas à correta conformação dos compostos, à homogeneidade estrutural e à questão de se realmente se obteve a forma madura desejada da molécula.
Vantagens, limitações e fontes de poluição
Por que a SPPS é tão amplamente utilizada?
Uma das vantagens mais importantes do SPPS é a possibilidade de manter o peptídeo formado no suporte durante a troca múltipla de reagentes líquidos.
Isso simplifica as operações químicas repetitivas e permite a automação.
Os químicos podem introduzir uma sequência planejada de blocos de construção de aminoácidos e, se a química do processo permitir, também alguns aminoácidos não padrão e outras modificações.
Os sistemas automatizados atuais mostram até onde essa ideia pode ser desenvolvida.
Em um estudo sobre síntese de fluxo automatizada de 2020, descreveu-se a obtenção de cadeias de proteínas contendo até 164 restos de aminoácidos. Após posterior purificação e faldação, foram obtidos materiais funcionais. [10]
Este é um exemplo impressionante das possibilidades técnicas.
No entanto, isso não significa que todas as sequências com 164 restos — nem todos os peptídeos ou proteínas longos — possam ser obtidos com a mesma facilidade.
Isso também não significa que a limpeza e a caracterização estrutural se tornem desnecessárias.
O estudo mostra mais bem quais resultados podem ser alcançados com um sistema cuidadosamente desenvolvido para moléculas adequadamente selecionadas.
A automação controla a execução do processo.
No entanto, ele não consegue transformar a química inadequada em química adequada.
Por isso, a eficiência do dispositivo, a sequência do peptídeo e a própria estrutura da molécula devem ser analisadas em conjunto.
Como se formam as poluições típicas?
Durante a SPPS podem existir várias vias diferentes que conduzem à formação de poluentes. A compreensão destas vias ajuda a explicar por que os testes analíticos finais ainda são necessários.
Uma sequência de deleção ou um produto abreviado pode ocorrer quando a ligação prevista do aminoácido não for possível ou quando o crescimento da cadeia for interrompido. Como a cadeia anormal pode continuar ligada à polímero, a remoção posterior não precisa eliminá-la.
A epimerização significa uma alteração na configuração estereoquímica do centro correspondente. Isso tem um significado analítico especial, pois o epímero pode ter a mesma massa molecular nominal do peptídeo original, mas também pode apresentar uma configuração espacial diferente.
Os produtos relacionados com o aspartimid podem ser produzidos como resultado de reações secundárias dependentes da sequência, que incluem os resíduos de aspartina. Dependendo do seu curso químico, pode ser produzido mais de um tipo desse produto.
A remoção incompleta das cadeias de proteção ocorre quando a cadeia que deve ser removida permanece ligada à molécula. Portanto, o peptídeo pode ter a cadeia nominalmente esperada, mas ainda assim apresentar uma estrutura química incorreta.
Modificações relacionadas ao desacoplanção podem ocorrer durante a libertação final do peptídeo ou durante a remoção dos grupos de proteção. Portanto, a formação correta da cadeia não garante que o peptídeo passe pelo processo de desacoplanção sem alterações.
Reações incompletas relacionadas à agregação podem, no entanto, ocorrer quando as cadeias formadas interagem de forma a restringir o acesso aos locais reativos. Introduzir uma quantidade suficiente de reagente no recipiente de reação não garante que cada local reativo esteja fisicamente disponível e esteja sujeita a uma reação adequada.
Essas são possíveis vias de formação de poluentes.
Isso não significa que cada partido recebido pela via SPPS deve conter todos os tipos de irregularidades mencionados.
A sua importância na síntese específica é determinada com base na compreensão do processo, em estudos analíticos e em uma adequada verificação da qualidade.
Os peptídeos naturais compostos requerem algo mais do que a reprodução da sequência.
Alguns peptídeos são estruturalmente muito mais complexos do que a própria sequência linear de aminoácidos sugeriria.
Um bom exemplo é a epiderme.
A caracterização estrutural da epiderme revelou a presença de muitos anéis contendo enxofre e de resíduos pouco comuns. [11]
A simples reprodução da ordem linear de aminoácidos não seria, portanto, prova suficiente de que se tenha obtido uma epiderme madura e autêntica.
Essa distinção é importante durante a interpretação de publicações ou pesquisas sobre a síntese da epiderme em fase fixa.
A publicação pode descrever um precursor linear, um fragmento, um análogo ou outra estrutura relacionada, em vez de uma síntese completa verificada da molécula completa madura.
A publicação estrutural citada aqui como [11] descreve a caracterização da própria epiderme; não é um relatório sobre a sua síntese total por meio da SPPS.
As afirmações sobre a síntese total devem, portanto, ser avaliadas em relação à estrutura final real da molécula, e não apenas em relação à sua sequência linear de aminoácidos.
A produtividade, a pureza e a identidade devem ser apresentadas separadamente
Os três conceitos frequentemente confundidos nas discussões sobre a síntese de peptídeos são desempenho, pureza e identidade.
Uma grande quantidade de produto recuperado não significa necessariamente que a maioria desse material seja peptídeo intencional. O material bruto pode conter quantidades significativas de impurezas.
A pureza cromatográfica elevada também não confirma automaticamente todos os aspectos da identidade estrutural.
Mesmo que um peptídeo cuja estrutura química tenha sido caracterizada com precisão, não obtenha automaticamente uma validação biológica, terapêutica ou clínica.
Trata-se de questões distintas.
Uma descrição precisa da síntese deve indicar qual era a molécula alvo, em que fase se verificou a eficiência, se o material analisado era bruto ou purificado e quais dados analíticos foram utilizados para confirmar as afirmações relativas à estrutura.
Graças a isso, os resultados da síntese podem ser interpretados e comparados de forma mais confiável.
Um valor percentual ou uma massa não devem ser transformados em uma afirmação geral de que o peptídeo é de „alta qualidade”, sem conhecimento do que realmente foi medido.
Perguntas mais frequentes
1. Por que a fase constante é utilizada no SPPS?
A fase fixa mantém o peptídeo em suspensão no suporte, enquanto os reagentes dissolvíveis, os produtos secundários da reação e os solventes de passagem podem ser introduzidos e removidos várias vezes. Isso simplifica significativamente a preparação repetida da cadeia e permite a automatização da síntese de peptídeos, como demonstrado pelas modernas metodologias de síntese automatizada de fluxo. [10] No entanto, o suporte não garante que cada reação se desenrole perfeitamente nem separa adequadamente o elo mal formado da ligação à resina. Sua principal vantagem é a melhoria do processo. A selectividade química, a integridade da reação, a pureza e a identidade estrutural ainda exigem uma avaliação separada.
2. A síntese em fase sólida elimina a necessidade de purificação?
Não. As cadeias peptídicas incorretas podem permanecer ligadas à polímero durante a síntese e, posteriormente, serem libertadas juntamente com o produto pretendido. Estudos que analisaram produtos SPPS crus por meio de cromatografia e espectrometria de massa mostram que a purificação durante a síntese e a purificação final desempenham funções diferentes. [9] A purificação remove principalmente os componentes dissolvíveis que rodeiam a polímero, enquanto a purificação após a despolimerização tem como objetivo separar o peptídeo desejado dos componentes peptídicos e não peptídicos indesejados. O SPPS simplifica as operações intermediárias, mas não garante a pureza final.
3. A „fase estacionária” significa que não é utilizado solvente?
Não. Na SPPS convencional, o suporte insolúvel é geralmente envolto por reagentes líquidos e solventes. Os solventes influenciam o ambiente físico da resina, incluindo o grau de espessamento e a facilidade com que os reagentes podem penetrar nos elos ligados. Pesquisas experimentais demonstraram que o espessamento da resina é dependente do solvente e que as alterações associadas à química do ligante, ao grau de polimerização e ao alongamento do elo. [2] Portanto, a resina e o solvente formam juntos um ambiente de reação.
4. Em que direção cresce o peptídeo durante a SPPS?
A SPPS convencional geralmente constrói o peptídeo a partir da sua parte C-terminal em direção ao N-terminal. O primeiro aminoácido que constitui o C-terminal da molécula final é ligado ao suporte, enquanto as subsequentes restrições alongam o extremo amino-terminal descoberto. Os métodos publicados com base em Fmoc mostram esse tipo de esquema típico. [1] No entanto, existem estratégias especializadas que utilizam a fase fixa e que podem ser aplicadas de forma diferente.
5. A resina e o ligante significam a mesma coisa?
Não. A resina é um veículo insolúvel, enquanto o ligante é uma ligação química entre o veículo e o peptídeo em crescimento. A funcionalidade do ligante pode, independentemente do próprio polímero, influenciar a ligação, a estabilidade da resina e a posterior libertação do peptídeo. As pesquisas sobre os veículos utilizados na síntese de peptídeos mostram por que a simples definição do tipo de resina pode não ser suficiente para descrever o comportamento de todo o sistema. [2]
6. O maior grau de polimerização da resina sempre aumenta a produção?
Não. Uma carga mais elevada significa um maior número de locais de ligação potenciais para uma determinada quantidade de carga transportadora, mas não necessariamente leva à obtenção de um maior número de peptídeos corretamente formados e recuperáveis. O grau de ligamento pode alterar o ambiente molecular local e foi experimentalmente indicado como um dos fatores que influenciam a fragilização da resina. [2] Se os cadeias ligadas estiverem excessivamente compactadas ou fortemente interligadas, a disponibilidade de locais reativos pode piorar. Portanto, a carga deve ser analisada juntamente com as propriedades da resina, o comportamento da sequência, a eficiência da reação e a qualidade do produto final.
7. Por que os aminoácidos são protegidos durante a síntese de um péptido?
Os grupos de proteção temporariamente impedem que grupos reativos selecionados participem nas reações enquanto se forma uma ligação específica. Isso permite a formação controlada e progressiva da cadeia. No entanto, a proteção não elimina todas as reações secundárias. Estudos em sistemas modelares demonstraram, por exemplo, que a estratégia dos grupos de proteção e a sequência circundante podem influenciar na formação de aspartimidina. [5] Portanto, os grupos de proteção proporcionam uma seleção química, mas toda a estratégia de proteção e desproteção ainda exige um planejamento cuidadoso e uma avaliação.
8. O que significa a proteção ortogonal de grupos funcionais?
Ortogonalidade significa a possibilidade de remover um grupo de proteção em condições que deixem outras proteções necessárias intactas. Isso permite revelar locais de reação específicos em etapas planejadas da síntese. As metodologias SPPS consolidadas baseiam-se no controle de proteção e desproteção, em vez de revelar simultaneamente todos os grupos de proteção. [1] No entanto, a verdadeira compatibilidade dos grupos de proteção utilizados ainda depende da molécula alvo e das condições da reação.
9. As siglas Fmoc e Boc significam diferentes tipos de peptídeos?
Não. Fmoc e Boc são grupos de proteção e as estratégias sintéticas associadas a eles, e não diferentes tipos de estrutura peptídica. As diferenças na química de sua remoção afetam a maneira como a síntese é conduzida, mas a estrutura química de proteção temporária não deve ser confundida com a estrutura final do peptídeo alvo. As metodologias publicadas baseadas em Fmoc mostram um dos vários SPPS mais comumente utilizados, mas isso não significa que todo peptídeo precisa ser obtido dessa maneira. [1]
10. Será que a primeira fase da ligação já pode introduzir poluição?
Sim. A etapa de ligação pode afetar a qualidade estereoquímica ainda antes do início do alargamento repetido da cadeia. Foram desenvolvidas metodologias analíticas especificamente concebidas para a detecção de racemização durante a ligação de aminoácidos protegidos às resinas. [3] Isso não significa que cada ligação cause uma racemização significativa. Simplesmente indica que a própria ligação é um passo químico importante durante o qual podem ocorrer alterações mensuráveis que devem ser consideradas na avaliação global da qualidade.
11. Por que algumas sequências peptídicas são consideradas difíceis?
Alguns elos peptídicos crescentes interagem entre si ou com elos vizinhos de forma a restringir o acesso aos locais reativos. Ligações hidrofóbicas, interações hidrofóbicas e comportamentos que lembram a agregação podem dificultar a posterior ligação. Os estudos de sequências sensíveis a agregação mostram que a alteração do modo de agregação pode influenciar na composição do produto bruto. [4] A dificuldade de síntese depende portanto das propriedades da molécula e das condições da reação, e não apenas da extensão do péptido.
12. A síntese mais rápida sempre significa um produto melhor?
Não. A velocidade de síntese e a qualidade do produto são parâmetros distintos. O aquecimento, o apoio microfónico e a automatização podem reduzir o tempo do processo, mas acelerar a reação também pode alterar a relação entre as reações desejadas e as secundárias. Os estudos sobre a síntese assistida por microfones demonstraram uma racemização dependente do tipo de resíduo e a formação de aspartimid, o que indica a necessidade de uma adequada controlo dos parâmetros. [7] Um tempo de síntese mais curto é vantajoso apenas quando o material obtido também atende aos critérios químicos e analíticos exigidos.
13. A desengomadoria significa simplesmente a remoção das partículas de resina?
Não. A despolimerização é um processo químico que leva à ruptura do elo projetado entre o peptídeo e o suporte. Enquanto isso, a remoção de grânulos de polímero por filtragem é uma operação física que não confirma propriamente a execução da despolimerização química. A libertação do peptídeo pode ocorrer simultaneamente com a remoção de grupos protectores e outras reações. Os estudos sobre os scavenger utilizados durante a despolimerização mostram que esta etapa pode influenciar no perfil de poluição. [8]
14. A alta eficiência do produto bruto significa uma alta pureza do peptídeo?
Não. A produtividade bruta descreve a quantidade de material recuperado antes de remover todos os componentes indesejados. Este material pode conter o peptídeo alvo, juntamente com sequências de deleção, estruturas modificadas, grupos de proteção remanescentes e outras impurezas. Os estudos sobre misturas brutas de SPPS utilizando cromatografia e espectrometria de massa mostram por que a massa recuperada, a pureza e a identidade molecular exigem uma interpretação separada. [9] Portanto, uma produtividade apresentada de forma rigorosa deve indicar o estágio em que foi medida e se o material já foi purificado.
15. O SPPS permite a obtenção de cadeias peptídicas longas?
Sim. Métodos SPPS cuidadosamente desenvolvidos podem permitir a obtenção de cadeias muito longas. Em estudos de síntese automatizada, foram obtidos cadeias que continham até 164 resíduos, que foram posteriormente purificados e faldados antes da avaliação funcional. [10] Isto demonstra as possibilidades da síntese peptídica moderna, mas não significa que qualquer sequência com uma mesma extensão possa ser obtida com a mesma eficiência. A extensão é apenas um dos fatores; também existem fatores como agregação dependente de sequência, reações secundárias, requisitos de faldamento e dificuldade de purificação.
16. Significa a construção de uma sequência epidérmica a realização de sua síntese completa?
Não. A epiderme madura contém elementos estruturais incomuns, incluindo anéis de sulfeto que ultrapassam a ordem linear das aminoácidos. Isto foi demonstrado em estudos estruturais. [11] Portanto, a obtenção de uma sequência linear, um precursor ou um fragmento não implica automaticamente a síntese de uma molécula completa e madura. A afirmação de que a síntese completa ocorre exige dados analíticos que confirm a reprodução dos laços pretendidos e outros elementos estruturais importantes.
17. A massa molecular esperada confirma a estrutura completa?
Não. A obtenção da massa molecular esperada constitui uma informação valiosa, mas a massa em si não confirma todos os aspectos da estrutura do peptídeo e não exclui todas as impurezas relevantes. Duas moléculas podem ter a mesma massa nominal, mas diferir em estereoquímica ou em um determinado sistema estrutural. As pesquisas que envolvem a separação de peptídeos epiméricos mostram por que as diferenças estereoquímicas podem exigir métodos analíticos capazes de distinguir estruturas que não podem ser distinguidas apenas com base na massa medida. [12] Portanto, a caracterização final deve ser projetada considerando as impurezas realistas e as estruturas alternativas que podem ocorrer durante a síntese específica.
Resumo
A síntese de peptídeos em fase sólida alterou a química dos peptídeos, permitindo que a cadeia crescente se mantenha em um suporte insolúvel durante a introdução repetida, a execução da reação e a remoção dos reagentes dissolvidos. Isso facilita a construção progressiva da sequência e constitui uma base prática para a síntese automática.
A aparente simplicidade desta metodologia não deve, no entanto, esconder a complexidade que se desenvolve em todos os estágios.
A resina, o ligante e o grau de polimerização influenciam as propriedades ambientais da síntese. O encolhimento dependente do solvente afeta o acesso aos cadeias relacionadas à resina. Os grupos protectores controlam quais grupos funcionais podem reagir, enquanto as reacções de ligação constroem o esqueleto peptídico da molécula. [1] [2]
Cada um destes estágios também tem suas limitações.
A ligação inicial pode influenciar a qualidade estereoquímica. [3] Sequências difíceis podem agrupar e restringir o acesso aos reagentes. [4] A química de proteção e remoção de grupos protectores pode favorecer reações secundárias, como a formação de aspartimidina. [5] [6] Condições de síntese aceleradas podem alterar o grau de racemização ou o perfil de impurezas. [7] As condições de desagregação podem também influenciar a composição do produto bruto. [8]
Por isso, a construção correta da cadeia não é sinônimo de obtenção de um peptídeo puro e corretamente identificado.
A recuperação do produto bruto, a purificação e a caracterização estrutural permanecem como etapas distintas. A cromatografia pode fornecer informações sobre a composição da mistura e a pureza, enquanto a espectrometria de massa e outras metodologias analíticas fornecem informações sobre a identidade. Nenhum único resultado analítico precisa confirmar todos os aspectos da estrutura do peptídeo. [9] [12]
A síntese de fluxo automatizada moderna mostra que, com condições adequadamente desenvolvidas, o SPPS pode ser aplicado até mesmo a cadeias muito longas. [10] Entretanto, os peptídeos estruturalmente complexos, como a epiderme, mostram por que a própria replicação de uma sequência linear de aminoácidos pode não ser suficiente quando a molécula madura contém anéis adicionais, restos incomuns ou um determinado sistema de ligações. [11]
A melhor maneira de entender o SPPS não é como uma única reação, mas sim como uma sequência de etapas químicas e analíticas distintas.
A conexão marca o ponto de partida. Os ciclos repetidos de proteção, desproteção e fixação constroem uma cadeia planejada. A desconexão libera o produto. A purificação separa a molécula-alvo dos componentes indesejados. A caracterização final permite determinar se o material isolado realmente possui a estrutura e a qualidade atribuídas a ele.
A separação desses estágios permite evitar algumas frequentes confusões: a síntese bem-sucedida não confirma automaticamente a pureza, a alta eficiência não confirma automaticamente a identidade, e a massa molecular esperada em si mesma não comprova a total correta estrutura.
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