A ligação peptídica é um processo químico que leva à formação de uma ligação entre um componente que contém um grupo carboxílico e um componente que contém um grupo amino. Como resultado dessa reação, ocorre uma ligação amidada. Quando essa ligação liga as restrições aminoacídicas durante a síntese de um peptídeo, ela se torna parte do que é conhecido como o esqueleto peptídico.
Os componentes reativos não precisam ser aminoácidos individuais. A reação de ligação pode unir um aminoácido a outro, ligar um segundo aminoácido ao cadeirão peptídico crescente ou unir fragmentos maiores de peptídeos que foram previamente sintetizados separadamente.
À primeira vista, a ligação de peptídeos pode parecer um trabalho simples: basta combinar um aminoácido com o outro.
Do ponto de vista químico, a formação de uma ligação amida é, no entanto, apenas uma parte do objetivo completo.
A ligação deve ocorrer no local adequado e com a correta configuração estereoquímica, enquanto outras funções reativas devem permanecer adequadamente controladas. A reação pode aparentemente ocorrer com sucesso e utilizar a maior parte ou até toda a massa inicial, ainda assim levando à formação de uma mistura indesejada de peptídeo final e outras estruturas.
Por isso, o fim da reação e a formação correta do produto não significam o mesmo.
Estudos que comparam diferentes sistemas de ligação, estratégias de proteção de grupos funcionais e resultados estereoquímicos mostram por que não existe um único reagente de ligação universalmente melhor, independente do tipo de peptídeo sintetizado.
Do ponto de vista científico, a pergunta mais útil não é, portanto:
„Qual é o reagente de ligação mais eficaz?”
A pergunta melhor seria:
„Qual é a abordagem que permite obter o peptídeo desejado com a conversão adequada, preservando a integridade estereoquímica e com controle adequado das impurezas em condições adequadas para a molécula específica?”
Esta distinção é fundamental para compreender a química de ligação dos peptídeos.
O que significa a ligação de peptídeos?
A ligação une dois componentes através da formação de uma nova ligação.
Na reação típica que leva à formação de um esqueleto peptídico, o grupo carboxílico ligado a uma única resídua de aminoácido é ligado ao grupo amino da segunda resídua.
A ligação formada é uma ligação amida química.
Se essa ligação une as outras aminas do cadeado peptídico, é geralmente chamada de ligação peptídica.
A colocação física precisa dos componentes reativos depende da estratégia de síntese utilizada.
Durante a síntese de peptídeos em fase sólida, o grupo amino normalmente pertence ao cadeirão peptídico crescente ligado à resina, enquanto o componente que contém o grupo carboxílico vem do aminoácido protegido introduzido.
Na síntese realizada em solução, ambos os componentes podem, no entanto, estar na fase líquida.
No caso de ligar fragmentos, os segmentos peptídicos maiores e mais protegidos são combinados, em vez de adicionar uma por uma as restrições de aminoácidos individuais.
Diferentes estratégias alteram a forma como a reação é conduzida, a separação dos materiais e a sua purificação, mas não eliminam o problema químico fundamental: os grupos funcionais adequados devem reagir entre si, enquanto as reacções indesejáveis em outras partes da molécula devem permanecer adequadamente limitadas.
A formação de ligações, a conversão e a eficiência são conceitos diferentes
Alguns termos frequentemente usados para descrever a ligação de peptídeos podem parecer semelhantes, embora se refiram a questões diferentes.
A conversão determina a parte do material de partida que sofreu a reação.
No entanto, ele não diz automaticamente em que se transformou esse material.
Se 99% do material inicial desaparecer, mas parte dele forçar produtos secundários indesejáveis, a conversão de 99% não significa que tenha sido produzido 99% do peptídeo pretendido.
A formação do produto final responde a outra pergunta: que quantidade da estrutura molecular pretendida foi realmente formada? A resposta exige uma metodologia analítica que permita distinguir o produto desejado das estruturas alternativas relevantes.
A produtividade isolada descreve a quantidade de produto determinado que foi finalmente recuperada em relação à quantidade de material inicial definida. Portanto, a produtividade final pode também ser influenciada por etapas de processamento, separação e purificação, mesmo que a própria conexão tenha sido realizada de forma eficaz.
A pureza cromatográfica descreve a distribuição dos componentes detectados em condições de uma determinada metodologia cromatográfica. Pode fornecer informações muito valiosas sobre a composição da amostra, mas sua interpretação pode ser limitada pela coelucação, diferenças na resposta do detetor ou presença de componentes pouco detectados pela metodologia em questão.
A puresterequímica, por sua vez, responde à questão de saber se a configuração espacial pretendida da partícula foi mantida. Esta é uma questão analítica distinta, pois algumas variantes estereoquímicas podem ter exatamente a mesma massa molecular do produto final.
Essas diferenças ajudam a compreender os resultados que, à primeira vista, podem parecer contraditórios.
A reação pode apresentar uma alta conversão do material inicial e, ao mesmo tempo, resultar na formação de vários produtos. O produto bruto pode apresentar uma massa recuperada significativa, mas conter uma quantidade significativa de impurezas. O tratamento intensivo, no entanto, pode resultar na obtenção de material de alta pureza, ao custo de uma menor eficiência isolada.
Nenhuma dessas observações é em si mesma contrária aos demais.
Simplesmente descrevem as diferentes propriedades do produto ou as diferentes etapas do processo.
Por isso, a afirmação de que „a comparação era completa” tem um valor muito maior se também se sabe qual método analítico foi utilizado e o que exatamente foi medido.
Os substratos difíceis revelam diferentes limitações do processo
Não todas as reações de ligação peptídica envolvem o mesmo grau de dificuldade química.
Um sítio reativo fortemente saturado pode retardar a formação da ligação, pois os grupos reativos têm acesso dificultado um ao outro.
A baixa solubilidade pode limitar o contato efetivo entre os componentes da reação.
Na síntese em fase fixa, uma cadeia peptídica crescente pode interagir com cadeias vizinhas ou assumir estruturas que restringem o acesso aos locais de reação, mesmo que os reagentes de ligação estejam presentes em uma quantidade aparentemente excessiva.
Esses problemas têm diferentes bases químicas.
Portanto, não se pode presumir que uma solução será automaticamente eficaz em todos os casos.
Estudos que compararam as estratégias de ligação repetida para sequências peptídicas complexas analisaram a composição real dos produtos finais obtidos, em vez de basear a avaliação exclusivamente na reactividade teórica ou na reputação dos reagentes individuais. Uma das estratégias analisadas apresentou bons resultados nos modelos analisados, mas isso não significa que exista uma solução universal adequada para cada sequência peptídica.
A conclusão mais importante é que a eficácia da metodologia deve ser avaliada com base no produto obtido a partir de um substrato específico, e não apenas com base na reputação do reagente utilizado.
A ativação da via carboxilativa
Por que a ativação geralmente é necessária?
A simples mistura de ácido carboxílico não modificado com uma amina em condições normais geralmente não leva eficazmente à formação de uma ligação peptídica pura.
Em vez disso, podem ocorrer reações ácida-base, e a formação efetiva de ligações amidadas requer uma via química adequada.
Por isso, a ligação de peptídeos geralmente envolve a ativação de um componente que contém um grupo carboxílico.
A ativação aumenta a sua susceptibilidade a uma reação com o grupo amino correspondente. O ambiente de reação adequado e o grupo de saída adequado facilitam a formação de uma nova ligação amidada.
O produto intermediário ativado só pode existir por um curto período de tempo e não precisa ser isolado.
O objetivo, no entanto, não é obter a máxima reatividade química possível.
O objetivo é uma reação controlada.
Um produto intermediário ativado que reage muito rapidamente com água, com outro nucleofileno indesejável ou que participa em uma reação competitiva pode desaparecer rapidamente, ao mesmo tempo que produz uma quantidade relativamente pequena do peptídeo pretendido.
A alta reactividade é, portanto, vantajosa apenas quando pode ser adequadamente direcionada para a formação da ligação pretendida.
Os agentes de ligação e os aditivos desempenham funções diferentes
Na formação de peptídeos podem participar vários tipos de componentes químicos que desempenham funções diferentes.
Os carbodiimidas constituem uma família de agentes utilizados para ativar grupos carboxílicos.
Outros sistemas de acoplamento utilizam mecanismos de ativação diferentes, incluindo frequentemente os reagentes tipo onião, como os sistemas baseados no HATU.
Outras substâncias podem desempenhar a função de aditivos.
O termo „aditivo” não significa, no entanto, que a ligação em questão seja ineficaz em termos químicos. O aditivo pode influenciar os produtos intermediários, a eficiência de ligação, os caminhos de reação competitivos e os resultados estereoquímicos.
Os estudos sobre Oxyma na síntese de peptídeos com a participação de carbodiimidas analisaram tanto a eficiência de ligação como a redução da racemização em modelos selecionados.
Esses dados são valiosos para os sistemas e modelos estudados.
No entanto, isso não significa que a aplicação do mesmo composto em cada combinação possível de peptídeos trará o mesmo resultado.
Estudos posteriores com o Oxyma-B compararam os resultados de pureza óptica em vários peptídeos-modelo.
O estudo de vários substratos é particularmente importante, pois resultados muito bons em ligações químicas simples nem sempre preveem a atividade do reagente em um local congestionado eletricamente, suscetível de aglutinação ou sensível a estereoquímica.
O que significa HATU na síntese de peptídeos?
HATU é um reagente de ligação utilizado para facilitar a formação de ligações amidadas, incluindo durante a síntese de peptídeos.
HATU não é um peptídeo.
Ela também não é uma organização de proteção.
A sua própria presença não constitui prova de que a ligação tenha sido concluída nem de que o peptídeo recebido seja puro.
A eficiência depende do tipo do substrato, dos outros reagentes, do sistema de dissolventes e do contexto mais amplo das condições da reação.
Os estudos sobre sequências sensíveis à agregação compararam, entre outras coisas, abordagens baseadas no HATU e sistemas Oxyma/carbodiimid em condições de agregação repetida.
Isso mostra por que pesquisas como „HATU peptide” devem ser entendidas como perguntas sobre a química de ligação e a escolha da metodologia, e não como prova de que um reagente específico constitui uma metodologia universal para a síntese de peptídeos.
A própria denominação do reagente não é suficiente para reproduzir nem para interpretar adequadamente o resultado publicado.
As condições da reação, a sequência do peptídeo e a forma de definir de forma analítica o sucesso do processo também são importantes.
A ativação e a controlo estereoquímica exigem a manutenção da estabilidade.
A manutenção prolongada da forma ativa do aminoácido no sistema de reação nem sempre é vantajosa.
A reação de ligação desejada ocorre junto com outros processos químicos possíveis.
Alguns caminhos concorrenciais podem alterar a estereotipia.
Investigações experimentais sobre produtos epiméricos protegidos analisaram o efeito da combinação de aminoácidos, solvente e outros componentes da reação sobre as mudanças estereoquímicas que ocorrem durante a ligação com a participação de carbodiimidas.
Isso demonstra uma importante regra: todo o ambiente da reação pode ser tão importante quanto a família geral do reagente utilizado.
A estratégia de reagrupamento deve, portanto, garantir uma reação suficiente para criar a ligação desejada, limitando simultaneamente a possibilidade de ocorrerem reações indesejadas.
Estas regras podem ser discutidas com fins educativos sem transformá-las num protocolo de laboratório pronto. As quantidades exatas dos reagentes, a ordem de adição e as condições da reação dependem do processo de síntese específico a ser desenvolvido.
O papel dos grupos de proteção
A segurança limita os espaços de reação competitivos
Um aminoácido pode conter mais grupos reativos do que apenas os grupos amino e carboxílico necessários para formar a estrutura peptídica.
A sua cadeia lateral pode conter grupos químicos reativos adicionais.
Se todas as grupos potencialmente reativos permanecessem descobertos durante cada etapa de ligação, a formação prevista da ligação peptídica poderia competir com a desagregação ou outras reações indesejadas.
A estratégia que utiliza grupos de proteção permite mascarar temporariamente os locais de reação selecionados.
Dessa forma, os grupos amino e carboxílico adequados podem reagir entre si, enquanto outros locais permanecem inacessíveis ou suficientemente pouco reativos sob essas condições.
A proteção fornece, portanto, uma seleção química.
Uma estratégia eficaz, no entanto, não se baseia apenas no acoplamento de um grupo químico estável.
O grupo de proteção também precisa ser removido posteriormente.
O mecanismo de proteção que efetivamente evita reações indesejadas durante a ligação, mas que não pode ser removido posteriormente sem danificar a molécula-alvo, cria um novo problema sintético.
Uma estratégia completa deve portanto ter em conta tanto a estabilidade durante o período em que a proteção é necessária, como a possibilidade de eliminar de forma selectiva o seguro quando deixar de ser necessário.
Os dispositivos de segurança temporários e de longa duração desempenham funções diferentes
Grupos de proteção individuais podem permanecer na molécula por um período diferente de tempo.
Na síntese típica em fase fixa, que utiliza a proteção Fmoc na extremidade da cadeia amino-terminal, esta é eliminada várias vezes à medida que a sequência se alonga.
No entanto, muitas das estruturas de proteção das cordas laterais permanecem presentes durante numerosos ciclos de ligação e só são removidas numa fase posterior.
Os métodos padrão baseados em Fmoc mostram como os ciclos repetitivos de remoção seletiva de proteções e de ligação são coordenados.
O tipo de proteção necessário para um determinado cadeado lateral depende da restante aminação, do peptídeo inteiro e da estratégia de síntese selecionada.
Não seria, portanto, correto afirmar que cada aminoácido requer a mesma proteção ou que todas as sínteses utilizam os mesmos grupos de proteção.
As equipes de proteção temporárias também devem ser diferenciadas das equipes químicas que permanecem intencionalmente no peptídeo acabado.
Uma modificação planejada na extremidade N ou na extremidade C, por exemplo, pode ser um elemento da estrutura final.
Por outro lado, uma equipe de proteção temporária que, acidentalmente, ficou na última parte da molécula significaria uma diferença estrutural indesejada.
Ortogonalidade é um requisito de conformidade química
A proteção ortogonal é uma estratégia em que os grupos de proteção selecionados podem ser removidos, deixando outras medidas de segurança intactas em grau suficiente.
Isso permite revelar vários locais reativos em etapas de síntese selecionadas de forma deliberada.
A ortogonalidade não deve ser entendida simplesmente como uma propriedade do único ingrediente presente na sua etiqueta.
Ela descreve a conformidade de toda a sequência planejada de operações químicas.
A remoção intencional do mecanismo de segurança deve ocorrer sem causar alterações inaceitáveis em outras partes do peptídeo em crescimento.
Na síntese em fase fixa, essa compatibilidade também pode incluir o sistema suporte-ligante e blocos de construção não convencionais ou especialmente sensíveis químicamente.
Estudos sobre a formação de aspartimidina, em que os mecanismos de proteção das cadeias laterais e do esqueleto foram modificados em um peptídeo modelo, demonstraram diferenças na formação de produtos secundários.
Isso mostra que a escolha do mecanismo de proteção pode afetar não apenas a ocorrência da reação evidente do retículo endoplasmático.
Ele também pode alterar outros caminhos de formação de poluentes durante a síntese.
Os grupos de proteção não fazem com que todas as sequências se comportem da mesma forma.
Mesmo que duas sequências contenham o mesmo aminoácido potencialmente problemático, elas não precisam se comportar da mesma forma.
Os outros componentes adjacentes podem influenciar a probabilidade de ocorrência de reações competitivas.
Estudos sistemáticos sobre sequências modelares contendo asparagina demonstraram que o aminoácido que se segue a essa sequência influencia a formação de produtos relacionados ao aspartimid em condições experimentais.
Isso não significa que toda sequência que contenha esse tema deva causar problemas.
Pelo contrário, demonstra que o contexto da sequência deve ser considerado durante a elaboração da metodologia e da avaliação de riscos.
A estratégia de proteção que se mostrou eficaz em um peptídeo modelo não garante um comportamento idêntico em todos os outros peptídeos que contêm a mesma sequência de aminoácidos.
Racismo e outras reações secundárias
A racemização e a epimerização dizem respeito ao sistema espacial da molécula
Muitas proteínas contêm um centro estereossímico.
A alteração na configuração desse centro pode levar à formação de uma molécula estruturalmente diferente, mesmo que a sua composição elementar e a massa molecular permaneçam inalteradas.
Em termos rigorosos, a racemização significa a perda do enriquecimento enantiomérico em direção a uma mistura racemática.
Na peptídeo que contém muitos centros estereoisópticos, a inversão da configuração de um determinado centro geralmente leva à formação de um epímero, ou seja, um tipo de diastereoímero.
No entanto, na literatura sobre a síntese de peptídeos, o termo „racemização” é utilizado de forma mais ampla em relação às alterações indesejáveis na configuração que ocorrem durante a ligação ou em outros estágios da síntese.
Essa distinção é importante, pois a identidade de um peptídeo não depende apenas dos átomos que estão presentes na molécula.
A sua distribuição espacial também é importante.
Nem todas as outras aminas são associadas a um risco estereoquímico semelhante.
A glicina, por exemplo, não possui o átomo de carbono alfa tipicamente quiral presente na maioria dos aminoácidos.
As outras restrições diferem na sua sensibilidade às mudanças de configuração, dependendo da sua estrutura e do seu ambiente de reação.
A massa normal pode ser acompanhada por uma estereoquímica anormal
O peptídeo epimérico pode ter exatamente a mesma massa molecular do peptídeo alvo.
Por isso, a observação da massa esperada através da espectrometria de massa não prova automaticamente que cada resíduo de aminoácido manteve a configuração estereoquímica pretendida.
Os estudos cromatográficos permitiram a separação de peptídeos epiméricos protegidos e a utilização desses fragmentos para analisar as mudanças estereoquímicas associadas à química de ligação.
Dependendo da molécula, uma avaliação estereoquímica adequada pode exigir métodos cromatográficos apropriados, ligantes de referência, estratégias de derivatização ou outras metodologias analíticas capazes de distinguir estruturas importantes.
Investigações analíticas individuais também analisaram as mudanças estereoquímicas que ocorrem durante a ligação de aminoácidos a suportes fixos.
Isso leva a uma conclusão importante: a poluição detectada no peptídeo acabado não precisa ter origem na última reação de ligação.
Poderia ter surgido em um estágio anterior e ter permanecido presente durante as etapas subsequentes da síntese.
A formação de aspartimidato é um problema distinto
A formação de aspartimidina é um caminho específico de reação secundária associado a sequências peptídicas sensíveis que contêm asparagina.
O processo envolve a criação de um produto intermediário cíclico, a partir do qual podem então surgir diferentes estruturas relacionadas.
Essas alterações podem incluir alterações na estrutura molecular do peptídeo e variantes estereoquímicas.
A formação de aspartimido não deve, portanto, ser descrita simplesmente como outra denominação para a não completa ligação.
A cadeia peptídica pode já conter as restrições de aminoácidos adequadas, e a reação secundária posterior pode modificar parte da sua estrutura.
Os estudos experimentais mostram que esta estratégia pode ser influenciada pela estratégia de proteção, pelas restrições adjacentes e pelas condições repetitivas associadas à eliminação de grupos de proteção.
Essa distinção é especialmente importante durante a interpretação dos problemas encontrados na síntese.
A simples repetição do reagendamento ou a adição de uma maior quantidade de reagente de ligação não irá reparar automaticamente a poluição que se originou devido a um caminho químico completamente diferente.
Reações incompletas levam a outros tipos de problemas
A não completa compatibilidade cria uma categoria separada de poluentes.
Se um elo da ligação com a proteína não receber o aminoácido previsto, mas reagir corretamente durante o ciclo subsequente, o peptídeo formado pode ficar sem essa parte.
Essa molécula é geralmente definida como uma sequência de deleções.
Outras cadeias podem parar de se alongar e permanecer encurtadas.
Esses produtos diferem substancialmente dos epímeros.
Um epímero pode ter uma sequência de aminoácidos e um esquema molecular correto, mas uma estereoquímica incorreta em um único centro.
O peptídeo delecional, por outro lado, possui uma sequência ou comprimento diferente.
Algumas estratégias de síntese utilizam o chamado capping para impedir que cadeias específicas não reagidas se alonguem ainda mais.
Mas o capping não corrige a sequência defeituosa e não a transforma em um peptídeo alvo.
Ele apenas muda a sua conduta durante as etapas seguintes.
A mistura bruta obtida durante a síntese pode, portanto, conter produtos resultantes de vários mecanismos diferentes.
Uma única valorização da produtividade não permite determinar quais mecanismos de formação de poluentes foram responsáveis pelo resultado final.
A temperatura e as condições do processo influenciam o compromisso entre velocidade e qualidade
A elevação da temperatura ou outros métodos para acelerar a síntese podem aumentar a velocidade das reações desejadas.
Ao mesmo tempo, no entanto, podem acelerar as reações adversas.
Os estudos da SPPS com microfones analisaram a racemização e a formação de aspartimido em sistemas modelados e demonstraram a sensibilidade dependente do tipo de resíduo nos parâmetros experimentais aplicados.
Isso não significa que o aquecimento seja, por natureza, ineficaz na síntese de peptídeos.
Isso também não significa que uma temperatura mais baixa é sempre melhor.
A regra mais importante é: a velocidade do processo e a qualidade química devem ser avaliadas simultaneamente.
Temperaturas mais elevadas, exposições mais longas ou processamentos múltiplos podem afetar tanto a formação de ligações desejada quanto as respostas competitivas.
Um compromisso adequado deve, portanto, ser avaliado experimentalmente para uma determinada sequência.
Modificações no produto final também podem ocorrer já após o término do próprio processo de ligação.
Estudos que compararam diferentes scavengers durante a despolimerização de um peptídeo de uma resina mostraram perfis de poluição diferentes.
Isso lembra que a poluição final não deve ser automaticamente atribuída à reação de ligação.
A síntese de um peptídeo é um processo de várias etapas, e a desestruturação, a despolimerização e a posterior manipulação podem alterar o material que foi previamente formado corretamente.
Como é avaliada a eficácia do agrupamento?
Os testes realizados durante o processo respondem apenas a perguntas específicas
Durante a síntese em fase fixa, um teste que detecta os outros grupos amino disponíveis pode ajudar a avaliar se o passo de acilação não foi completo.
Esses testes podem ser muito úteis.
A sua interpretação, no entanto, deve limitar-se ao questionamento químico a que a metodologia utilizada realmente responde.
Dependendo da metodologia analítica e do tipo de aminoácido, os testes baseados na mudança de cor podem reagir de forma diferente a diferentes aminas.
A disponibilidade do local em questão também é importante.
O grupo amino reativo, ao qual o reagente de teste tem acesso físico dificultado, não é o mesmo que o grupo amino que passou corretamente a reação de ligação — mesmo que o teste em questão não seja capaz de diferenciar claramente essas situações.
As limitações podem, portanto, incluir a disponibilidade de espaço de reação, a sensibilidade do teste, as interferências químicas e o tipo de grupo funcional detectado.
O resultado negativo do teste realizado durante o processo não deve ser interpretado automaticamente como prova de que todo o peptídeo possui a sequência, a estereoquímica e a pureza corretas.
A monitorização do processo é mais valiosa quando os seus resultados podem ser posteriormente associados à análise do produto peptídico real.
A cromatografia separa, enquanto a espectrometria de massa ajuda a caracterizar os componentes.
A cromatografia e a espectrometria de massa fornecem informações complementares.
A cromatografia pode separar os componentes da amostra e indicar a presença de mais de um componente detectável.
A espectrometria de massa pode fornecer informações sobre a massa das partículas, ajudando na caracterização ou atribuição de componentes individuais.
Os estudos que combinam ambas as técnicas permitiram analisar os produtos finais da síntese de peptídeos em fase sólida e obter informações sobre a sua identidade e o grau de remoção dos grupos protectores.
A combinação das duas metodologias geralmente fornece mais informações do que a suposição de que cada pico cromatográfico já foi identificado ou de que cada massa detectada corresponde a uma fração pura e estruturalmente completa.
No entanto, existem algumas limitações.
Os diferentes componentes podem coexistir, ou seja, não serem completamente separados por cromatografia.
As substâncias individuais também podem causar uma resposta diferente do detector.
As isoméricas estruturais e as isostéricas podem exigir a aplicação de métodos analíticos adicionais.
Por essa mesma razão, o simples fato de afirmar que o peptídeo foi testado pela metodologia HPLC não significa automaticamente que todas as impurezas relevantes foram separadas.
A utilidade de uma determinada metodologia de HPLC depende do desvio realmente obtido e do questionamento analítico que ela deve responder.
Deve ser explicada a forma como o resultado foi calculado.
A percentagem apresentada em relação ao acoplamento de peptídeos pode significar várias coisas completamente diferentes.
Pode se referir à conversão do material de partida, à área superficial relativa do pico cromatográfico, à concentração do produto final medida, à produtividade bruta ou à produtividade isolada.
A apresentação da própria cifra sem explicar o que ela representa pode, portanto, criar a impressão de uma grande precisão.
As comparações precisas devem especificar o substrato, a fase de ligação analisada, a metodologia analítica utilizada, o momento da coleta da amostra e os tipos de poluentes analisados.
Se foi utilizado o agrupamento repetido, também isso deve ser considerado.
O resultado final após duas operações de fusão não precisa refletir o que aconteceu durante a primeira reação.
As fronteiras de detecção dos métodos analíticos exigem uma precaução semelhante.
A afirmação „não foi detectada” significa que a substância em questão não foi detectada nos parâmetros e com os limites da metodologia utilizada.
Não deve ser automaticamente assumido como uma afirmação absoluta que a poluição em si não existe.
Os dados relativos ao agente devem incluir mais do que um modelo simples.
O agente de ligação, que funciona excepcionalmente bem na reação modelo simples, pode se comportar de forma diferente em caso de aminoácido com grande carga estereomolecular, centro estereoquímico sensível, substrato pouco solúvel ou cadeia peptídica suscetível a agregação.
Estudos que comparam o Oxyma-B em vários peptídeos-modelo mostram por que a avaliação da química de ligação em mais de um substrato é valiosa.
Em última análise, uma metodologia de ligamento útil deve conduzir à obtenção da estrutura desejada com um perfil de poluição aceitável e um resultado repetível para a síntese pretendida.
Por isso, é melhor entender a eficiência da combinação como um conjunto de diferentes medições do que como uma propriedade descrita pelo nome de um único reagente ou como resultado de um único teste de desaparecimento de substrato.
Perguntas mais frequentes
1. Por que grupos de proteção são necessários durante a síntese de peptídeos?
Os grupos de proteção temporariamente restringem as reações indesejadas, permitindo que os grupos funcionais adequados possam efetivamente formar ligações peptídicas. As aminas podem conter várias posições reativas e deixar todas elas disponíveis simultaneamente pode levar a reações competitivas. Uma estratégia eficaz de proteção também deve considerar a possibilidade de remoção posterior dos grupos de proteção e sua compatibilidade com o resto da molécula. Os estudos de modelagem mostram que a escolha dos grupos de proteção pode influenciar não apenas a selectividade básica da reação, mas também a formação de produtos secundários. Portanto, o grupo de proteção é apenas um componente de toda a estratégia de síntese e não é uma solução universal para todos os problemas químicos.
2. Será que a combinação correta ainda pode levar à formação de poluentes?
Sim. A ligação peptídica intencional pode ocorrer enquanto outras moléculas da mesma mistura sofrem uma conversão incompleta ou reacções secundárias indesejadas. Os estudos sobre produtos epiméricos demonstram isso de forma particularmente clara, pois a formação da ligação correta e a manutenção da estereoquímica correta são questões distintas. Portanto, a detecção do peptídeo alvo não significa que ele seja o único produto presente. Uma avaliação científica do sucesso da ligação requer um ponto final de análise definido e informações sobre as impurezas relevantes.
3. A ligação de peptídeos é a mesma coisa que a síntese completa de um peptídeo?
Não. A ligação é uma única operação de formação de ligação no âmbito de um processo de síntese muito mais amplo. A síntese em fase fixa pode também incluir a ligação a um suporte, a proteção, a remoção de grupos de proteção, a lavagem múltipla, a despolimerização, a manipulação, a purificação e a caracterização final. Como os produtos indesejados podem também ser produzidos fora do período de ligação, a poluição final não deve ser automaticamente atribuída ao ligamento indevido sem dados que indiquem a sua origem real.
4. Por que a carboxilação é ativada?
A ativação da carboxila cria uma via de reação mais vantajosa com a respectiva amina, facilitando assim a formação de ligações amidadas. No entanto, a maior reactividade pode também permitir reações concorrenciais. Portanto, ao avaliar os sistemas de ligação, é analisada não apenas a eficiência da formação de ligações, mas também os efeitos estereoquímicos e a formação de produtos secundários. O objetivo da ativação não é maximizar a reactividade da molécula, mas sim alcançar uma selectividade adequada para a reação.
5. Para que serve o HATU?
HATU é um ligante de ligação utilizado para facilitar a formação de ligações amidadas, incluindo a ligação de peptídeos. Não é um peptídeo nem uma via de proteção. Estudos comparativos de sequências peptídicas difíceis revelam que os métodos que utilizam HATU devem ser avaliados no contexto completo das condições da reação. A simples informação de que foi utilizado HATU não confirma a conversão completa, a conservação da estereoquímica nem um perfil de impurezas melhorado.
6. Existe um único agente ideal para ligar peptídeos?
Não. Não existe um ranking universal de reagentes adequado para cada peptídeo e cada reação. A densidade estérica, a solubilidade do substrato, a agregação, a sensibilidade estereoquímica e o contexto da sequência podem influenciar o resultado. Portanto, a escolha do reagente deve basear-se nos resultados medidos para a reação específica, e não apenas na sua reputação ou popularidade.
7. Os termos „agente de ligação” e „aditivo” significam a mesma coisa?
Não. Estas denominações podem descrever diferentes funções no sistema de reagrupamento. O reagente de reagrupamento pode participar diretamente na ativação, enquanto o aditivo pode influenciar na formação de produtos intermediários, na eficiência da reação, na integridade estereoquímica ou nos caminhos químicos concorrenciais. É por isso que é necessário analisar todo o sistema de reação, e não tratar todos os seus componentes como equivalentes intercambiáveis.
8. É possível ligar partes inteiras de peptídeos em vez de aminoácidos individuais?
Sim. A reação de ligação pode combinar fragmentos peptídicos maiores, e não apenas aminoácidos individuais. No entanto, o aumento do tamanho dos componentes reagentes não elimina a necessidade de controlar a selectividade do local de reação, a estereoquímica ou a caracterização final do produto. No caso da ligação de fragmentos, ainda são necessários dados que confirmem que a ligação correta realmente ocorreu corretamente.
9. Qual é a diferença entre racemização e epimerezação?
A racemização no sentido estrito significa a perda do enriquecimento enantiomérico em direção a uma mistura racemática, enquanto a epimerização significa a alteração da configuração de um centro estereossímile em uma molécula que contém vários centros desse tipo. Na literatura sobre a síntese de peptídeos, o termo racemização é utilizado de forma mais ampla para descrever alterações indesejáveis na configuração das restrições aminoacídicas. Portanto, a definição precisa deve corresponder à mudança estrutural real.
10. A espectrometria de massa pode detectar qualquer erro estereoquímico?
Não. Os estereoisómeros podem ter exatamente a mesma massa molecular. Portanto, obter a massa esperada não confirma a configuração correta de cada centro estereóide. Métodos adicionais, como técnicas cromatográficas adequadas ou estratégias de derivatização, podem ser necessários para avaliar essas diferenças. A espectrometria de massa permanece uma ferramenta extremamente útil para a caracterização molecular, mas seus resultados devem ser interpretados de acordo com as limitações do questionamento estrutural específico.
11. A formação de aspartimidato significa simplesmente uma ligação não correta?
Não. A formação de aspartimido é um caminho de reação secundária distinto, associado a sequências sensíveis que contêm asparaginina. Sua ocorrência pode ser influenciada por restrições adjacentes e por condições relacionadas com a eliminação de grupos protectores. Portanto, uma alteração estrutural indesejada pode ocorrer mesmo quando o aminoácido apropriado foi previamente corretamente ligado. Determinar a origem da contaminação é importante, pois uma repetição do reagenciamento não precisa resolver o problema decorrente de um caminho de reação completamente diferente.
12. A repetição do reagrupamento garante o sucesso da reação?
Não. Uma repetição do reagenciamento pode, em alguns casos, melhorar a conversão, mas não garante que todos os locais reativos se tornem acessíveis nem que outras reações secundárias sejam eliminadas. O resultado ainda depende do substrato e da metodologia utilizada. Portanto, é necessária uma análise do produto para determinar o que realmente proporcionou o reagenciamento adicional.
13. A temperatura mais elevada sempre melhora a qualidade da ligação?
Não. A elevação da temperatura pode acelerar a reação desejada, mas também pode acelerar processos químicos indesejados. Portanto, a conversão mais rápida não deve ser interpretada automaticamente como uma melhoria na qualidade química. A temperatura deve ser avaliada tanto em termos da produção do produto final quanto do perfil das impurezas formadas.
14. A ausência de um grupo amino livre confirma a formação de um peptídeo correto?
Não. A ausência de uma cadeia livre de aminoácidos detectável responde a uma questão muito mais restrita relativa a um grupo funcional específico nos termos do teste utilizado. Não confirma de forma independente a sequência completa do péptido, sua estereoquímica ou sua pureza. A monitorização das cadeias livres de aminoácidos pode ser um elemento útil no controle do processo, mas não substitui a caracterização final do produto.
15. A pureza do HPLC é a mesma coisa que a eficiência da ligação?
Não. A pureza do HPLC e a eficiência descrevem diferentes propriedades. A pureza do HPLC é dependente da metodologia utilizada para descrever a composição dos componentes detectados na amostra, enquanto a eficiência refere-se à quantidade de produto determinado obtida em relação à quantidade de material inicial definida. O purificação pode aumentar a pureza cromatográfica, ao mesmo tempo que reduz a quantidade de produto final recuperado. Portanto, o valor percentual tem pouca importância se não estiver claramente especificado o que se pretende representar.
16. As contaminantes podem se formar mesmo após o término do processo de ligação?
Sim. Após a conclusão da reação de ligação, a síntese do peptídeo passa por etapas químicas adicionais. A remoção de grupos protectores, a despolimerização e a posterior manipulação podem modificar a molécula ou levar à formação de impurezas adicionais. Isso não significa que cada impureza final seja formada em etapas posteriores, mas mostra por que uma ligação correta não garante a qualidade do produto final.
17. O que torna a comparação das metodologias de ligação confiável?
Uma comparação credível deve avaliar métodos alternativos para o mesmo objetivo claramente definido e em condições suficientemente comparáveis. Deve indicar os substratos utilizados, o estágio da coleta da amostra, as metodologias analíticas e os tipos de poluição avaliados, em vez de apresentar um valor percentual não esclarecido ou basear-se na reputação do reagente. As comparações que envolvem vários peptídeos modelo podem fornecer mais informações do que uma única alta eficiência obtida para um substrato simples, pois mostram como a eficácia varia com o contexto molecular. Mesmo assim, as conclusões devem limitar-se a sistemas químicos verdadeiramente investigados.
Resumo
A ligação de peptídeos é o elemento fundamental da síntese química de peptídeos, pois leva à formação de ligações amidadas que unem as restrições aminoacídicas no esqueleto peptídico. No entanto, descrever a ligação apenas como „a ligação de dois aminoácidos” omite uma grande parte da química que determina se o produto obtido é realmente o peptídeo pretendido.
Os compostos que contêm um grupo carboxílico geralmente necessitam de uma ativação para que a formação efetiva da ligação amidada possa ocorrer de forma adequada. Os reagentes de ligação e os aditivos podem facilitar esse processo, mas a sua eficácia depende do substrato, do ambiente da reação e da forma de avaliação analítica do resultado. Portanto, o reagente deve ser analisado no contexto completo do experimento e não classificado independentemente do peptídeo sintetizado.
Os grupos de proteção proporcionam um nível adicional de controle ao impedir temporariamente que grupos funcionais indesejados participem na reação. Sua utilidade depende não apenas da proteção eficaz, mas também da capacidade de remoção seletiva e da conformidade com as etapas subsequentes da síntese. A estratégia de proteção e as demais restrições aminoacídicas podem também influenciar na formação de determinados produtos secundários.
A estereoquímica integral é outro elemento importante. A reação de ligação pode levar à formação de uma ligação amidada, gerando ao mesmo tempo um material epimérico. Como o epímero pode ter a mesma massa molecular do peptídeo original, a própria concordância de massa não confirma a correta estrutura estrutural. Alterações de configuração também podem ocorrer em outros estágios, como a ligação inicial do aminoácido à fase sólida.
Outras poluição ocorre por mecanismos diferentes. A ligação incompleta pode levar à formação de secções deletérias ou curtas, enquanto as reações associadas ao aspartimid podem modificar o peptídeo que já contém as restrições aminoacídicas corretas. A aceleração do processo pode afetar tanto as reações desejadas quanto os caminhos secundários, e as poluições adicionais também podem ocorrer durante etapas posteriores, como a despolimerização.
Por estas razões, a avaliação da ligação peptídica requer algo mais do que determinar se o material de partida desapareceu.
A conversão, a formação do produto final, a eficiência isolada, a pureza cromatográfica e a pureza estereoquímica respondem a diferentes perguntas.
Os testes realizados durante a síntese podem ajudar a detectar reações incompletas, mas não confirmam por si só a estrutura completa do peptídeo. A cromatografia e a espectrometria de massa fornecem informações complementares, enquanto questões relativas à estereoquímica ou a estruturas muito semelhantes podem exigir métodos analíticos adicionais.
A abordagem mais razoável para a ligação de peptídeos é, portanto, direcionada para uma molécula específica e baseada em dados.
A metodologia de ligação útil não é simplesmente uma metodologia que utiliza o reagente mais conhecido ou mais reactivo. É uma metodologia que conduz de forma repetível ao estabelecimento de uma ligação molecular desejada, mantendo simultaneamente a integridade estereoquímica adequada e controlando as impurezas relevantes para o peptídeo sintetizado em questão.
Referências
- Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: um aditivo eficiente para a síntese de peptídeos que substitui os HOBt e HOAt à base de benzotriazol, com um risco de explosão mais baixo. Química—A European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Estudos de racemização na síntese de peptídeos através da separação de peptídeos epímeros protegidos por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Avaliação do uso combinado de Oxyma e HATU para a agregação de sequências peptídicas. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, um excelente inibidor de racemização para a síntese de peptídeos. Química Orgânica e Biomolecular, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Síntese de peptídeos em fase sólida: de procedimentos padrão à síntese de sequências complexas. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). O problema da aspartimida na SPPS baseada em Fmoc. Parte I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). O problema da aspartimida no SPPS baseado em Fmoc. Parte II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Utilização do reagente de Marfey para quantificar a racemização após a fixação de aminoácidos em suportes sólidos para a síntese de peptídeos. Análise de bioquímica, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limitação da racemização e da formação de aspartimida na síntese de péptidos em fase sólida por Fmoc assistida por micro-ondas. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzenedimethanethiol (1,4-BDMT) como um atrator para a clivagem de resinas peptídicas mais ecológicas. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D. & Pallai, P. (1991). A caracterização de produtos brutos da síntese de peptídeos em fase sólida através da espectrometria de massa com mu-HPLC/bombardeamento rápido de átomos. Pesquisa em Peptídeos, 4(1), 40–46. PubMed