Peptidų jungimas yra cheminis procesas, leidžiantis susidaryti ryšiui tarp karboksi grupę turinčio komponento ir aminogrupę turinčio komponento. Dėl šios reakcijos susidaro amidinis ryšys. Kai toks ryšys sujungia aminorūgščių liekanas peptidų sintezės metu, jis tampa to, kas vadinama peptido skeletu, dalimi.
Reaguojančios medžiagos nebūtinai turi būti pavienės aminorūgštys. Jungimo reakcija gali sujungti vieną aminorūgštį su kita, prijungti dar vieną aminorūgštį prie augančios peptidinės grandinės arba sujungti didesnius peptidų fragmentus, kurie anksčiau buvo susintetinti atskirai.
Iš pirmo žvilgsnio peptidų jungimas gali atrodyti paprasta užduotis: tereikia sujungti vieną aminorūgštį su kita.
Chemijos požiūriu amidinio ryšio susidarymas yra tik dalis viso tikslo.
Jungtis turi susidaryti tinkamoje vietoje ir išlaikant atitinkamą stereocheminę konfigūraciją, tuo tarpu kitos reaktyvios funkcinės grupės turi būti tinkamai kontroliuojamos. Reakcija gali iš pažiūros sėkmingai praeiti ir sunaudoti didžiąją dalį ar net visą pradinę medžiagą, tačiau vis tiek lemti nepageidaujamą tikslinio peptido ir kitų struktūrų mišinį.
Todėl reakcijos pabaiga ir taisyklingas produkto susidarymas nereiškia to paties.
Tyrimai, lyginantys skirtingas jungimo sistemas, funkcinių grupių apsaugos strategijas ir stereocheminius rezultatus, parodo, kodėl neegzistuoja vienas visiškai geriausias jungimo reagentas, nepriklausomas nuo sintetinamojo peptido tipo.
Moksline prasme naudingesnis klausimas taigi nėra:
„Kuris sujungimo reagentas yra geriausias?”
Geresnis klausimas yra:
„Kuris požiūris leidžia gauti norimą peptidą su tinkama konversija, stereocheminio integralumo išlaikymu ir tinkama priemaišų kontrole sąlygomis, tinkamomis konkrečiai molekulei?”
Šis skirtumas turi esminę reikšmę peptidų jungimo chemijos supratimui.
Peptidų jungimas (sankaba)
Sujungimas sujungia du komponentus sukuriant naują ryšį
Tipinėje reakcijoje, kurioje susidaro peptidinis karkasas, karboksi grupė, esanti prie vienos aminorūgšties liekanos, sujungiama su antrosios liekanos amino grupe.
Besiformuojantis ryšys yra cheminis amido ryšys.
Jeigu toksnis ryšys jungia aminorūgščių liekanas peptidinėje grandinėje, jis paprastai vadinamu peptide ryšiu.
Tikslus fizinis reaguojančių komponentų išdėstymas priklauso nuo taikomos sintezės strategijos.
Vykdant peptidų sintezę ant kietos fazės, atidengta aminogrupė paprastai priklauso augančiai peptidinei grandinei, prijungtai prie dervos, o karboksi grupę turintis komponentas gaunamas iš įvedamo apsaugoto aminorūgšties.
Vykdant sintezę tirpale, abu komponentai tuo tarpu gali būti skystoje fazėje.
Sujungimo atveju jungiama daugiau didesnių, apsaugotų peptidinių segmentų, o ne pridedamos pavienės aminorūgščių liekanos viena po kitos.
Skirtingos strategijos keičia reakcijų vykdymo, medžiagų atskyrimo ir jų gryninimo būdus, tačiau nepanaikina esminės cheminės problemos: tinkamos funkcinės grupės turi reaguoti tarpusavyje, tuo tarpu nepageidaujamos reakcijos kitose molekulės dalyse turi būti tinkamai apribotos.
Jungties susidarymas, konversija ir išeiga yra skirtingos sąvokos
Keli terminai, dažnai vartojantys apibūdinant peptidų jungimą, gali skambėti panašiai, nors ir nurodo skirtingus dalykus.
Konversija apibrėžia, kokia duotosios pradinės medžiagos dalis sureagavo.
Tačiau tai automatiškai nepasako, į ką ši medžiaga pavirto.
Jeigu išnyksta 99% pradinės medžiagos, tačiau dalis jos virsta nepageidaujamais šalutiniais produktais, 99 procentų konversija nereiškia, kad susidarė 99% numatyto peptido.
Galutinio produkto susid音乐aras atakoja į kitą klausimą: koks numatomos molekulinės struktūros kiekis iš tikrųjų susiformavo? Atsakymui reikia analitinio metodo, leidžiančio atskirti tinkamą produktą nuo svarbių alternatyvių struktūrų.
Išskirtoji išeiga apibūda tam tikro produkto kiekį, kurį galiausiai pavyko gauti, palyginti su nustatytu pradinio medžiagos kiekiu. Todėl galutinei išeigai įtakos gali turėti ir apdorojimo, atskyrimo bei gryninimo etapai, net jei pati jungimo reakcija vyko veiksmingai.
Chromatografinis grynumas apibřia komponentų, aptinkamų nurodytomis chromatografinio metodo sąlygomis, pasiskirstymą. Jis gali pateikti labai vertingos informacijos apie mėginio sudėtį, tačiau jo interpretavimą gali riboti koelucija, detektoriaus atsako skirtumai ar komponentų, kuriuos sunku aptikti taikomu metodu, buvimas.
Stereocheminis grynumas tuo tarpu atsako į klausimą, ar buvo išlaikyta numatyta erdvinė molekulės konfigūracija. Tai yra atskira analitinė problema, kadangi kai kurie stereocheminiai variantai gali pasižymėti lygiai tokia pačia molekuline mase kaip ir galutinis produktas.
Šie skirtumai padeda suprasti rezultatus, kurie iš pirmo žvilgsnio gali pasirodyti prieštaringi.
Reakcija gali rodyti didelę pradinės medžiagos konversiją ir kartu lemti kelių produktų susidorojimą. Neapdorotas preparatas gali pasižymėti didele atgauta mase, tačiau jame gali būti daug priemaišų. Tuo tarpu intensyvus gryninimas gali padėti gauti didelio grynumo medžiagą, tačiau mažesnės išskirto produkto išeigos sąskaita.
Nė vienas iš šių stebėjimų pats savaime neprieštarauja kitiems.
Jie tiesiog aprašo skirtingas produkto savybes arba skirtingus proceso etapus.
Todėl teiginys „sankaba buvo visiška” turi daug didesnę vertę, jei taip pat žinoma, koks analitinis metodas buvo naudojotas ir kas tiksliai buvo išmatuota.
Sudėtingi substratai atskleidžia įvairius proceso apribojimus
Ne kiekviena peptidų jungimo reakcija pasižymi vienodu cheminio sudėtingumo laipsniu.
Stipriai steriškai apribota reaktinga vieta gali sulėtinti jungties susidorimą, nes reaguojančioms grupėms sunku pasiekti viena kitą.
Prastas tirpumas gali apriboti veiksmingą kontaktą tarp reakcijos komponentų.
Vykdant sintezę ant kietojo nešiklio, auganti peptidinė grandinė gali sąveikauti su gretimomis grandinėmis arba įgyti struktūras, kurios riboja priėmimą prie reaktyviųjų vietų, net jeijungiamieji reagentai yra akivaizdžioje perdozavimo (arba: pertekliuje).
Šios problemos turi įvairų cheminį pagrindą.
Todėl negalima daryti prielaidos, kad vienas sprendimas bus automatiškai veiksmingas visais atvejais.
Tyrimai, lyginantys pakartotino sujungimo strategijas sudėtingoms peptidų sekoms, analizavo faktinę gautų neapdorotų produktų sudėtį, o ne vertinimą grindė vien teoriniu atskirų reagentų reaktyvumu ar reputacija. Viena iš tirtų strategijų pasirodė palankiai analizuotuose modeliuose, tačiau tai nereiškia, kad egzistuoja universalus sprendimas, tinkantis kiekvienai peptido sekai.
Svarbiausia išvada yra ta, kad metodo veiksmingumą reikėtų vertinti pagal produktą, gautą iš konkretaus substrato, o ne vien pagal panaudoto reagento reputaciją.
Karboksilinės grupės aktyvinimas
Kodėl aktywacija paprastai yra reikalinga?
Pats nemodifikuoto karboksirūgšties ir amino rūgšties sumaišymas įprastomis sąlygomis paprastai efektyviai nelemia gryno peptide ryšio susidarymo.
Vietoj toje gali vykti rūgščių ir bazių sąveika, o efektyviam amidinio ryšio susidarymui reikalingas atitinkamas cheminis kelias.
Todėl peptidų jungimas paprastai apima karboksigrupę turinčio komponento aktyvavimą.
Aktyvavimas padidina jo imlumą reakcijai su atitinkama amino grupe. Tinkama reakcijos terpė ir tinkama išeinanti grupė palengvina naujo amidinio ryšio susidarymą.
Aktyvuotas tarpinis produktas gali egzistuoti tik trumpą laiką ir jo nebūtina izoliuoti.
Tačiau tikslas nėra pasiekti didžiausią įmanomą cheminį reaktyvumą.
Tikslas – valdomas reaktyvumas.
Aktyvuotas tarpinis produktas, kuris labai greitai reaguoja su vandeniu, kitu nepageidaujamu nukleofilu arba dalyvauja konkurencinėje reakcijoje, gali greitai išnykti ir kartu lemti palyginti nedidelį norimo peptido kiekį.
Didelis reaktyvumas yra naudingas tik tada, kai jį galima tinkamai nukreipti į numatytą ryšio susidarymą.
Sujungimo reagentai ir priedai atlieka skirtingas funkcijas
Peptidų jungimo procese gali dalyvauti kelių rūšių cheminiai komponentai, atliekantys skirtingas funkcijas.
Karbodiimidai yra viena iš reagentų šeimų, naudojamų karboksilo grupėms aktyvuoti.
Kitos jungimo sistos naudoja skirtingus aktyvavimo mechanizmus, įskaitant dažnai sutinkamus oniumo tipo reagentus, tokius kaip HATU pagrįstos sistemos.
Papildomi junginiai gali atlikti priedų funkciją.
Tačiau terminas „priedas” nereiškia, kad atitinkamas junginys yra chemiškai nesvarbus. Priedas gali turėti įtakos tarpiniams produktams, sujungimo išeigai, konkuruojantiems reakcijos keliams ir stereocheminiams rezultatams.
Oksimo tyrimai peptidų sintezėje naudojant karbodiimidus analizavo tiek jungimo efektyvumą, tiek racemizacijos slopinimą pasirinktuose modeliuose.
Tokie duomenys yra vertingi tiriamoms sistemoms ir konkretiems modeliams.
Tačiau tai nereiškia, kad to paties junginio naudojimas kiekviename įmanomame peptidų sujungime duos identišką rezultatą.
Vėlesni Oxyma-B tyrimai palygino optinio grynumo rezultatus keliuose modeliniuose peptiduose.
Daugelio substratų tyrimas yra ypač svarbus, nes labai geri chemiškai lengvo jungimo rezultatai nebūtinai nusako reagento elgseną steriškai užimtoje, polinkio į agregaciją turinčioje arba stereochemiškai jautrioje vietoje.
Ką sintetinėje peptidų sintezėje reiškia HATU?
HATU yra sankabos reagentas, naudojamas amidiniams ryšiams susidaryti, įskaitant peptidų sintezę.
HATU nėra peptidas.
Ji taip pat nėra apsauginė grupė.
Vien tik jo buvimas nėra įrodymas, kad sujungimas baigtas arba kad gautas peptidas yra grynas.
Veiksmingumas priklauso nuo substrato tipo, kitų reagentų, tirpiklių sistemos ir platesnio reakcijos sąlygų konteksto.
Agregacijai jautrių sekvencijų tyrimuose buvo lyginami, tarp kitų, HATU pagrįsti metodai ir „Oxyma“ / karbodiimido sistemos pasikartojančio sujungimo sąlygomis.
Tai parodo, kodėl tokios paieškos kaip „HATU peptide” turėtų būti suprantamos kaip klausimai apie sujungimo chemiją ir metodo pasirinkimą, o ne kaip įrodymas, kad vienas konkretus reagentas yra universali peptidų sintezės metodas.
Vien tik reagento pavadinimo nepakanka nei paskelbtam rezultatui atkurti, nei jam teisingai interpretuoti.
Reikšmės turi ir reakcijos sąlygos, peptido seka bei proceso sėkmės analitinio apibrėžimo būdas.
Stereocheminė aktywacja ir kontrolė reikalauja pusiausvyros išlaikymo
Ilgesnis aktyvuotos aminorūgšties darbinio tirpalo ar darinio išlaikymas reakcijos sistemoje ne siempre yra naudingas.
Pageidaujama sujungimo reakcija vyksta šalia kitų galimų cheminių procesų.
Kai kurie konkurenciniai keliai gali pakeisti stereochemiją.
Eksperimentiniai tyrimai su apsaugotais epimeriniais produktais analizavo aminorūgščių, tirpiklio ir kitų reakcijos komponentų derinio poveikį stereocheminiams pokyčiams, vykstant sujungimui, kuriame dalyvauja karbodiimidai.
Tai parodo svarbią taisyklę: visa reakcijos aplinka gali būti tokia pat svarbi kaip ir naudojamo sankabos reagentų šeima apskritai.
Jungimo strategija todėl privalo užtikrinti pakankamą reaktyvumą pageidaujamam ryšiui suformuoti ir kartu apriboti nepageidaujamų reakcijų vyksmo galimybę.
Šias taisykles galima aptarti edukaciniais tikslais nepaverčiant jų gatavu laboratoriniu protokolu. Tikslus reagentų kiekis, jų pridėjimo eilė ir reakcijos sąlygos priklauso nuo konkretaus kuriamo sintezės proceso.
Apsauginių grupių vaidmuo
Apsauga apriboja konkuruojančias reakcijos vietas
Aminorūgštis gali turėti daugiau reaktyviųjų grupių nei tik aminogrupę ir karboksigrupę, reikalingas peptidiniam karkasui suformuoti.
Jo šoninė grandinė gali turėti papildomų reaktyvių cheminių grupių.
Jei visos potencialiai reaktyvios grupės liktų neapsaugotos per kiekvieną sujungimo etapą, numatytas peptidinio ryšio susidarymas galėtų konkuruoti su šakojimusi ar kitomis nepageidaujamomis reakcijomis.
Apsauginių grupių naudojimo strategija leidžia laikinai užmaskuoti pasirinktas reaguojančias vietas.
Dėl to atitinkamos aminų ir karboksilo grupės gali tarpusavyje reaguoti, kol kitos vietoslieka nepriešinamos arba yra nepakankamai reaktyvios esamomis sąlygomis.
Apsauga užtikrina cheminį selektyvumą.
Tačiau veiksminga strategija neapsiriboja vien chemiškai stabilios grupės prijungimu.
Apsauginę grupę vėliau taip pat reikės pašalinti.
Apsauga, kuri veiksmingai užkerta kelią nepageidaujamoms reakcijoms sujungimo metu, tačiau vėliau negali būti pašalinta nepažeidžiant tikslinės molekulės, sukuria dar vieną sintetinę problemą.
Todėl išsami strategija turi atsižvelgti tiek į stabilumą laikotarpiu, kuriuo apsauga yra reikalinga, tiek į galimybę selektyviai pašalinti apsaugą, kai ji tampa nebereikalinga.
Laikinosios ir ilgalaikės apsaugos priemonės atlieka skirtingas funkcijas
Atskiros apsauginės grupės molekulėje gali išbūti skirtingą laiką.
Tipinėje kietosios fazės sintezėje, naudojant Fmoc, augančios grandinės galinės aminogrupės apsauga yra pakartotinai pašalinama ilgėjant sekai.
Tuo tarpu daugelis šoninių grandžių apsauginių grupių išlieka per daugelį jungimo ciklų ir yra pašalinamos tik vėlesniame etape.
Standartiniai metodai, pagrįsti Fmoc, parodo, kaip koordinuojami pasikartojantys selektyvaus apsaugos pašalinimo ir sujungimo ciklai.
Apsaugos tipas, kurio reikia konkrečiai šoninei grandinei, priklauso nuo aminorūgšties liekanos, viso peptido ir pasirinktos sintezės strategijos.
Todėl nebūtų teisinga teigti, kad kiekvienai aminorūgštij reikia identiške apsaugos arba kad visose sintezėse naudojamos tos pačios apsauginės grupės.
Laikinas apsaugines grupes taip pat reikia skirti nuo cheminių grupių, kurios tikslingai paliekamos galutiniame peptide.
Numatyta N-galinė modifikacija arba amidas C-gale gali, pavyzdžiui, sudaryti tikslinės struktūros elementą.
Tuo tarpu laikina apsauginė grupė, atsitiktinai likusi galutinėje molekulėje, reikštų nepageidaujamą struktūrinį skirtumą.
Ortogonalumas yra cheminio suderinamumo reikalavimas
Ortogonali apsauga reiškia strategiją, kurioje pasirinktas apsaugines grupes galima pašalinti, paliekant kitus apsauginius elementus pakankamai nepažeistus.
Tai leidžia atidengti įvairias reaguojančias vietas tyčia pasirinktuose sintezės etapuose.
Ortogonalumo negalima suprasti tiesiog kaip vieno reagento savybės, užrašytos ant jo etiketės.
Ji apibūdina visos suplanuotos cheminių operacijų sekos suderinamumą.
Numatytas apsauginės grupės pašalinimas turėtų vykti nesukeliant nepriimtinų pokyčių kitose augančio peptido dalyse.
Vykdant sintezę ant kietojo nešiklio, šis suderinamumas taip pat gali apimti nešiklio ir jungties sistemą bei neįprastus arba chemiškai itin jautrius statybinius blokus.
Aspartimido susidarymo tyrimai, kuriuose buvo modifikuojamos šoninių grandinių ir karkaso apsaugos modeliniame peptide, parodė šalutinių produktų susidarymo skirtumus.
Tai rodo, kad apsaugos priemonės pasirinkimas gali turėti įtakos ne tik akivaizdžios šalutinės grandinės reakcijos atsiradimui.
Jis taip pat gali keisti kitus taršos susidarymo sintetizavimo metu būdus.
Apsauginės grupės neužtikrina, kad visos sekwencijos elgtųsi vienodai
Net jeigu dvi sekuotos turi tą patį potencialiai probleminį aminorūgštį, jos nebūtinai elgiasi vienodai.
Kaimyninės liekanos gali turėti įtakos konkurencinių reakcijų atsiradimo tikimybei.
Sisteminiai modelinių sekvenčių, turinčių aspartato, tyrimai parodė, kad po šios liekanos esanti aminorūgštis, esant tiriamoms sąlygoms, turėjo įtakos su aspartimidu susijusių produktų susidarymui.
Tai nereiškia, kad kiekviena seka, turinti tokį motyvą, privalo sukelti problemų.
Tai vis dėlto rodo, kad kuriant metodą ir vertinant riziką reikėtų atsižvelgti į sekos kontekstą.
Apsaugos strategija, kuri pasiteisino viename modeliniame peptide, negarantuoja identiško bet kurio kito peptido, turinčio tą pačią liekaną, elgesio.
Racemizacija ir kitos šalutinės reakcijos
Racemizacija ir epimerizacija susijusios su molekulės erdvine struktūra
Daugelis aminorūgščių liekanų turi stereogeninį centrą.
Tokio centro konfigūracijos pokytis gali lemti struktūriškai kitokios molekulės susidarymą, net jei jos elementinė sudėtis ir molekulinė masė išlieka nepakitusios.
Griežtai kalbant, racemizacija reiškia enantiomerinio grynumo praradimą link raceminio mišinio.
Peptido, turinčiame kelis stereogeninius centrus, vieno konkreto centro konfigūracijos inversija paprastai lemia epimero, kuris yra diastereoizomero rūšis, susidarymą.
Peptidų sintezės literatūroje terminas „racemizacija” vis dėlto kartais vartojamas platesne prasme, apibūdinant nepageidaujamus konfigūracijos pokyčius, vykstančius sujungimo metu ar kituose sintezės etapuose.
Šis skirtumas yra svarbus, nes peptido tapatybė priklauso ne vien nuo to, kokie atomai yra jo molekulėje.
Svarbu ir jų erdvinis išdėstymas.
Ne kiekviena aminorūgšties liekana yra susijusi su tokia pačia stereochemine rizika.
Pavyzdžiui, glicinas neturi tipinio chiralinio alfa anglies atomo, esančio daugumoje aminorūgščių.
Likusios liekanos pasižymi skirtingu jautrumu konfigūracijos pokyčiams, priklausomai nuo jų struktūros ir reakcijos aplinkos.
Tinkamai masei gali būti būdinga netinkama stereochemija
Epimeryczny peptidas gali turėti lygiai tokią pačią molekulinę masę kaip ir tikslinis peptidas.
Todėl numatomos masės stebėjimas pasitelkiant masės spektrometriją automatiškai neįrodo, kad kiekviena aminorūgšties liekana išlaikė numatytą stereocheminę konfigūraciją.
Chromatografiniai tyrimai leido atskirti apsaugotus epimerinius peptidus ir panaudoti šiuos atskyrimus stereocheminėms pokyčiams, susijusiems su jungiamosios chemija, analizuoti.
Priklausomai nuo molekulės, tinkamam stereocheminiam įvertinimui gali prireikti tinkamų chromatografinių metodų, etaloninių junginių, derivatizacijos strategijų arba kitų analitinių metodų, galinčių atskirti svarbias struktūras.
Asmeniniai analitiniai tyrimai taip pat nagrinėjo stereocheminius pokyčius, vykstančius aminorūgščių prijungimo prie kietųjų nešiklių metu.
Tai vedžia prie kitos svarbios išvados: gatavame peptide aptiktas užterštumas nebūtinai turi būti kilęs iš paskutinės jungimo reakcijos.
Tai galėjo susidaryti ankstesniame etape ir išlikti vėlesniuose sintezės etapuose.
Aspartimido susidarymas yra atskira problema
Aspartimido susidarymas yra specifinis šalutinės reakcijos kelias, susijęs su jautriomis peptidų sekomis, turinčiomis aspartatą.
Procesas apima ciklinio tarpinio produkto sukūrimą, iš kurio vėliau gali susidaryti įvairios giminingos struktūros.
Jos gali apimti pakeistus junginius peptido skelete ir stereocheminius variantus.
Aspartimido susidarymo todėl nereikėtų tiesiog apibūdinti kaip kito nepilno sujungimo pavadinimo.
Peptidinė grandinė jau gali turėti reikiamus aminorūgščių liekanas, o vėlesnė šalutinė reakcija gali pakeisti dalį jos struktūros.
Eksperimentiniai tyrimai rodo, kad šiam procesui įtakos gali turėti apsauginė strategija, gretimos liekanos ir pasikartojančios sąlygos, susijusios su apsauginių grupių pašalinimu.
Šis skirtumas yra ypač svarbus interpretuojant sintezės metu kylančias problemas.
Pats jungimo pakartojimas arba didesnio jungimo reagento kiekio pridėjimas automatiškai neištaisys užterštumo, kuris susidarė dėl visiškai kito cheminio kelio.
Nepilnos reakcijos sukelia kitokio pobūžio problemas
Nepilnas sankabos jungimas sudaro atskirą taršos kategoriją.
Jei viena prie dervos prijungta grandinė negaus suplanuotos aminorūgšties, bet vėlesnio ciklo metu reaguos teisingai, susidarandis peptidas gali neturėti šios liekanos.
Tokia molekulė paprastai vadinama delecine seka.
Kiti grandinės segmentai gali nustoti ilgėti ir likti sutrumpėję.
Šie produktai iš esmės skiriasi nuo epimerų.
Epimeras gali turėti teisingą aminorūgščių sekas ir bendrąją formulę, tačiau neteisingą vieno centro stereochemiją.
Tuo tarpu delecinis peptidas yra kitos sekvenconės arba ilgio.
Kai kuriose sintezės strategijose naudojamas vadinamasis „capping“, siekiant užkirsti kelią tolesniam tam tikrų nesureagavusių grandinių ilgėjimui.
Užblokavimas vis dėlto neištaiso neteisingos grandinės ir nepaverčia jos tiksliniu peptidu.
Jis tik pakeičia savo elgesį per tolesnius etapus.
Todėl sintezės metu gautas neapdorotas mišinys gali turėti produktų, susidarančių dėl kelių skirtingų mechanizmų.
Viena bendra našumo vertė neleidžia nustatyti, kurie taršos susidarymo mechanizmai lėmė galutinį rezultatą.
Temperatūra ir proceso sąlygos lemia kompromisą tarp greičio ir kokybės
Temperatūros paaukštinimas ar kiti sintezės spartinimo būdai gali padidinti pageidaujamų reakcijų greitį.
Tačiau tuo pat metu jos gali paskatinti nepageidaujamas reakcijas.
Mikrobangomis palaikomo kietafazės peptide sintezės (SPPS) tyrimai išanalizavo racemizaciją ir aspartimido susidarymą modelinėse sistemose ir, taikytomis sąlygomis, parodė nuo liekanos tipo priklausomą jautrumą.
Tai nereiškia, kad šildymas iš esmės yra netinkamas peptidų sintezėje.
Tai taip pat nereiškia, kad žemesnė temperatūra visada yra geresnė.
Svarbiausia taisyklė yra tokia: proceso greitis ir cheminė kokybė turi būti vertinami vienu metu.
Aukštesnė temperatūra, ilgesnis poveikis arba pakartotinis perdirbimas gali turėti įtakos tiek pageidaujamam ryšių susidarymui, tiek konkuruojančioms reakcijoms.
Tinkamas kompromisas todėl turėtų būti įvertintas eksperimentiškai konkrečiai sekai.
Galutinio produkto modifikacijos taip pat gali vykti jau pasibaigus pačiam sujungimo procesui.
Tyrimai, lyginantys įvairius „scavengerius“ atskiriant peptidą nuo dervos, parodė skirtingus priemaišų profilius.
Tai primena, kad galutinio užteršimo negalima automatiškai priskirti sujungimo reakcijai.
Peptidų sintezė yra daugiapakopis procesas, o vėlesnis nukapsuliavimas, atskyrimas ir tolesnis apdorojimas gali pakeisti medžiagą, kuri anksčiau buvo sukonstruota teisingai.
Kaip vertinamas susiejimo efektyvumas?
Testai, atliekami proceso metu, atsako tik į tam tikrus klausimus
Vykdant sintezę ant kietojo nešiklio, likusias laisvas aminoguopas aptinkantis testas gali padėti įvertinti, ar acilinimo etapas galėjo įvykti ne iki galo.
Tokie testai gali būti labai naudingi.
Vis dėlto jų interpretacija turėtų apsiriboti cheminiu klausimu, į kurį iš tikrųjų atako taikytas metodas.
Priklausomai nuo analizės metodo ir aminorūgšties tipo, spalvos pokyčiu pagrįsti testai gali skirtingai reaguoti į įvairius aminus.
Svarbi yra ir tirreiamos vietos prieinamumas.
Reaktyvi amino grupė, prie kurios bandymo reagentui fizine prasme yra sunku prieiti, nėra tapati amino grupei, kuri sėkmingai atliko sujungimo reakciją, net jei nagrinėjamas testas negali vienareikšmiškai atskirti šių situacijų.
Apribojimai todėl gali apimti reaktyviosios vietos prieinamumą, testo jautrumą, chemines interferencijas bei aptinkamos funkcinės grupės tipą.
Neigiamo bandymo, atlikto proceso metu, rezultato negalima automatiškai interpretuoti kaip įrodymo, kad visas peptidas yra taisyklingos sekos, stereochemijos ir grynumo.
Proceso stebėsena yra vertingiausia tada, când jos rezultatus vėliau galima sulyginti su realaus peididinio produkto analize.
Chromatografija atskiria, o masių spektrometrija padeda charakterizuoti komponentus
Chromatografija ir masių spektrometrija teikia viena kitą papildančią informaciją.
Chromatografija gali atskirti mėginio komponentus ir parodyti daugiau nei vieno aptinkamo komponento buvimą.
Masės spektrometrija gali pateikti informaciją apie molekulinę masę, padėdama charakterizuoti arba priskirti atskirus komponentus.
Tyrimai, sujungiantys abi technikas, leido analizuoti neapdorotus kietafazės peptidų sintezės produktus ir gauti informaciją apie jų tapatybę bei apsauginių grupių pašalinimo laipsnį.
Abiejų metodų derinimas paprastai suteikia daugiau informacijos nei prielaida, kad kiekvienas chromatografinis pikas jau yra identifikuotas arba kad kiekviena aptikta masė atitinka gryną ir struktūriškai pilną frakciją.
Vis dėlto apribojimų vis dar yra.
Skirtingi komponentai gali bendrai eliuuotis, tai yra nebūti visiškai atskirti chromatografiškai.
Atskiros medžiagos taip pat gali sukelti skirtingą detektoriaus atsaką.
Struktūriniai izomerai ir stereozomerai gali reikalauti taikyti papildomus analitinius metodus.
Dėl tos pačios priežasties vien tik teiginys, kad peptidas buvo ištirtas HPLC metodu, automatiškai nereiškia, kad buvo atskirti visi svarbūs nešvarumai.
Konkrečiojo HPLC metodo tinkamumas priklauso nuo faktiškai pasiekto atskyrimo ir nuo analitinio klausimo, į kurį juo siekiama atsakyti.
Reikia paaiškinti, kaip buvo apskaičiuotas rezultatas
Procentinė vertė, nurodoma kalbant apie peptidų sujungimą, gali reikšti kelis visiškai skirtingus dalykus.
Tai gali būti susiję su pradinės medžiagos konversija, santykiniu chromatografinio piko plotu, išmatuotu tikslinio produkto kiekiu, neapdorota išeiga arba išskirta išeiga.
Pats skaitmenio pateikimas be paaiškinimo, ko jis yra, todėl gali sukurti klaidinantį didelio tikslumo įspūdį.
Patikimi palyginimais turėtų būti nurodomas substratas, analizuojamas sujungimo etapas, taikytas analitinis metodas, mėginio paėmimo momentas ir tiriamų teršalų rūšys.
Jei buvo pritaikytas pakartotinis susiejimas, tai taip pat reikia atsižvelgti.
Galutinis rezultatas po dviejų sujungimo operacijų nebūtinai turi atspindėti to, kas įvyko per pirmąją reakciją.
Panašaus atsargumo reikalauja ir analitinių metodų aptikimo ribos.
Teiginys „neaptikta” reiškia, kad tam tikros medžiagos neaptiko nurodytomis sąlygomis ir taikyto metodo ribose.
Neturėtų būti automatiškai keičiama į absoliutų teiginį, kad tam tikra tarša apskritai neegzistuoja.
Reagentų duomenys turėtų apimti daugiau nei paprastą modelį
Sujungimo reagentas, kuris puikiai veikia paprastoje modelinėje reakcijoje, sterikai perkrauto aminorūgšties, jautraus stereocheminio centro, mažai tirpaus substrato arba agregacijai jautrios peptidinės grandinės atveju gali elgtis kitaip.
Tyrimai, lyginantys „Oxyma-B“ keliuose modeliniatų peptidų tyrimuose, parodo, kodėl jungimo chemijos įvertinimas naudojant daugiau nei vieną substratą yra vertingas.
Galiausiai, veiksmingas jungimo metodas turėtų užtikrinti, kad būtų gauta numatyta struktūra su priimtinu teršalų profiliu ir pakartojamu rezultatu, reikalingu tikslinei sintezei.
Todėl jungimosi efektyvumą geriau suvokti kaip įvairių matavimų rinkinį, o ne kaip savybę, apibūdinamą vieno reagento pavadinimu ar vieno substrato išnykimo bandymo rezultatu.
Dažniausiai užduodami klausimai
1. Kodėl peptide sintezės metu reikalingos apsauginės grupės?
Apsauginės grupės laikinai slopina nepageidaujamas reakcijas, todėl reikiamos funkcinės grupės gali suformuoti numatytą peptidinį ryšį. Amino rūgštys gali turėti keletą reaktyvių vietų, o jei jos visos bus paliktos vienu metu prieinamos, tai gali sukelti konkurencines reakcijas. Veiksminga apsaugos strategija taip pat turi atsižvelgti į galimybę vėliau pašalinti apsaugas bei jų suderinamumą su likusia molekulės dalimi. Modeliniai tyrimai rodo, kad apsauginių grupių pasirinkimas gali turėti įtakos ne tik pagrindiniam reakcijos selektyvumui, bet ir šalutinių produktų susidarymui. Taigi apsauginė grupė yra vienas iš visos sintezės strategijos elementų, o ne universalus visų cheminių problemų sprendimas.
2. Ar tinkamas sujungimas vis tiek gali sukelti taršą?
Taip. Norimas peptidinis ryšys gali susidaryti, tuo tarpu kitos tos pačios mišinio dalelės gali būti nevisiškai konvertuotos arba patirti nepageidaujamas šalutines reakcijas. Tai ypač gerai iliustruoja epimerinių produktų tyrimai, nes tinkamos jungties susidarymas ir tinkamos stereocheminės konfigūracijos išlaikymas yra atskiri klausimai. Taigi tikslinio peptido aptikimas nereiškia, kad jis yra vienintelis esantis produktas. Moksliškai pagrįstas jungimo sėkmės įvertinimas reikalauja aiškiai apibrėžto analizės galutinio taško ir informacijos apie reikšmingus teršalus.
3. Ar peptidų jungimas yra tas pats, kas visa peptido sintezė?
Ne. Sujungimas yra viena jungties sudarymo operacija kur kas platesniame sintezės procese. Kietosios fazės sintezė taip pat gali apimti prijungimą prie nešiklio, apsaugą, apsauginių grupių pašalinimą, pakartotinį plovimą, atskėrimą, apdorojimą, gryninimą ir galutinį charakterizavimą. Kadangi nepageidaujami produktai taip pat gali susidaryti ne tik sujungimo etape, galutinio užterštumo nereikėtų automatiškai priskirti netinkamam sujungimui be duomenų, rodančių jo tikrąją kilmę.
4. Kodėl karboksilinė grupė yra aktyvuota?
Karboxilinės grupės aktyvacija sudaro palankesnes sąlygas jos reakcijai su atitinkama amino grupe, taip palengvindama amidinio ryšio susidarymą. Tačiau padidėjęs reaktyvumas taip pat gali sudaryti sąlygas konkurencinėms reakcijoms. Todėl vertinant jungimo sistemas analizuojamas ne tik ryšio susidarymo efektyvumas, bet ir stereocheminiai padariniai bei šalutinių produktų susidarymas. Aktyvacijos tikslas nėra maksimaliai padidinti molekulės reaktyvumą, o pasiekti tinkamą reakcijos selektyvumą.
5. Kam skirta „HATU“?
HATU yra jungiamasis reagentas, naudojamas amidinių ryšių susidarymui palengvinti, įskaitant peptidų jungimą. Tai nėra nei peptidas, nei apsauginė grupė. Sudėtingų peptidų sekvencijų lyginamieji tyrimai rodo, kad metodai, kuriuose naudojamas HATU, turi būti vertinami atsižvelgiant į visas reakcijos sąlygas. Vien tai, kad buvo panaudotas HATU, dar nereiškia, kad buvo pasiektas visiškas konversijos laipsnis, išsaugota stereochemija ar geresnis teršalų profilis.
6. Ar yra vienas geriausias reagentas peptidų jungimui?
Ne. Neegzistuoja joks universalus reagentų reitingas, tinkantis kiekvienam peptidui ir kiekvienai reakcijai. Sterinė thedrūstė, substrato tirpumas, agregacija, stereocheminis jautrumas ir seku kontekstas gali turėti įtakos rezultatui. Todėl reagentų pasirinkimas turėtų būti pagrįstas konkrečios reakcijos matuotais rezultatais, o ne vien jo reputacija ar populiarumu.
7. Ar „jungimo reagentas” ir „priedas” reiškia to paties?
Ne. Šie terminai gali apibūdininkti skirtingas funkcijas jungimo sistemoje. Jungimo reagentas gali tiesiogiai dalyvauti aktyvavime, tuo tarpu priedas gali turėti įtakos tarpinių produktų susidarymui, reakcijos išeigai, stereocheminiam vientisumui arba konkuruojantiems cheminiams keliams. Todėl būtina analizuoti visą reakcijos sistemą, o ne laikyti visus jos komponentus keičiamais ekvivalentais.
8. Ar galima jungti visas peptidų atkarpas vietoje pavienių aminorūgščių?
Taip. Sujungimo reakcija gali sujungti didesnius apsaugotus peptidų fragmentus, o ne tik pavienius aminorūgštis. Tačiau reaguojančių komponentų dydžio padidinimas nepanaikina poreikio kontroliuoti reakcijos vietos selektyvumą, stereochemiją ar galutinę produkto charakteristiką. Atliekant fragmentų sujungimą vis tiek reikia duomenų, patvirtinančių, kad tinkamas sujungimas iš tikrųjų susidarė teisingai.
9. Koks yra skirtumas tarp racemizacijos ir epimerizacijos?
Racemizacija tikrąja prasme reiškia enantiomerinio pranašumo praradimą iki raceminio mišinio, o epimerizacija reiškia vieno stereogeninio centro konfigūracijos pasikeitimą molekulėje, turinčioje daug tokių centrų. Peptidų sintezės literatūroje terminas racemizacija kartais vartojamas platesne prasme nepageidaujamiems aminorūgščių liekanų konfigūracijos pokyčiams apibūdinti. Todėl tikslus apibrėžimas turėtų atitikti faktinį struktūrinį pokytį.
10. Ar masių spektrometrija gali aptikti bet kokią stereocheminę klaidą?
Ne. Stereoizomerai gali turėti lygiai tokią pačią molekulinę masę. Todėl pageidaujamos masės gavimas nepatvirtina teisingos kiekvieno stereogeninio centro konfigūracijos. Tokiems skirtumams įvertinti gali prireikti papildomų metodų, pavyzdžiui, tinkamų chromatografinių technikų arba derivatizacijos strategijų. Masės spektrometrija išlieka itin naudingu molekulinės charakterizavimo įrankiu, tačiau jos rezultatus reikia interpretuoti atsižvelgiant į konkretaus struktūrinio klausimo apribojimus.
11. Ar aspartimido susidarymas tiesiog reiškia nepavykusį sujungimą?
Ne. Aspartimido susidarymas yra atskiras šalutinės reakcijos kelias, susijusis su jautriomis sekomis, turinčiomis aspartato. Tam įtakos gali turėti gretimos liekanos ir apsauginių grupių šalinimo sąlygos. Nepageidaujamas struktūrinis pokytis todėl gali įvykti net ir tada, kai atitinkama aminorūgštis prieš tai buvo prijungta teisingai. Priemaišos kilmės nustatymas yra svarbus, nes pakartotinis sujungimas nebūtinai išspręs problemą, kylančią dėl visai kito reakcijos kelio.
12. Ar sankabos pakartojimas garantuoja reakcijos sėkmę?
Ne. Pakartotinis jungimas kai kuriais atvejais gali pagerinti konversiją, tačiau negarantuoja, kad visos reaktyviosios vietos taps prieinamos arba kad bus pašalintos kitos šalutinės reakcijos. Rezultatas vis tiek priklauso nuo substrato ir taikomo metodo. Todėl būtina atlikti produkto analizę, kad būtų nustatyta, ką iš tikrųjų davė papildomas konjugavimas.
13. Ar aukštesnė temperatūra visada pagerina sujungimo kokybę?
Ne. Temperatūra gali paspartinti pageidaujamą reakciją, tačiau ji taip pat gali paspartinti nepageidaujamus cheminius procesus. Todėl spartesnės konversijos nereikėtų automatiškai suprasti kaip cheminės kokybės pagerėjimo. Temperaturą reikia vertinti tiek tikslinio produkto susidarymo, tiek susidarančių priemaišų profilio požiūriu.
14. Ar laisvos aminogrupės išnykimas patvirtina taisyklingo peptido susidarymą?
Ne. Jokios aptinkamos laisvos aminogrupės buvimas atsako į kur kas siauresnį klausimą apie konkrečią funkcina grupę taikyto tyrimo sąlygomis. Tai viena pati nepatvirtina pilnos peptido sekos, jo stereochemijos ar grynumo. Laisvų aminogrupių stebėsena gali būti naudingas proceso kontrolės elementas, tačiau nepakeičia galutinės produkto charakterizacijos.
15. Ar švara HPLC yra tas pats kas sujungimo efektyvumas?
Ne. Grynumas PL ir išeiga nusako skirtingas savybes. Grynumas PL yra nuo metodo priklausomas aptinkamų mėginio komponentų sudėties aprašymas, o išeiga nurodo tam tikro gauto produkto kiekį, palyginti su apibrėžtu pradinės medžiagos kiekiu. Gryninimas gali padidinti chromatografinį grynumą ir kartu sumažinti atgauto galutinio produkto kiekį. Todėl procentinė vertė turi ribotą reikšmę, jei tiksliai neapibrėžta, ką ji parodo.
16. Ar teršalai gali rastis jau po sujungimo pabaigos?
Taip. Po sujungimo reakcijos pabaigos peptidų sintezė apima tolesnius cheminius etapus. Apsauginių grupių pašalinimas, atskilimas ir tolesnis apdorojimas gali modifikuoti molekulę arba lemti papildomų priemaišų susidarymą. Tai nereiškia, kad kiekviena galutinė priemaiša susidaro vėlesniuose etapuose, tačiau tai parodo, kodėl tinkamas sujungimas nėra galutinio produkto kokybės garantija.
17. Kas užtikrina, kad sujungimo metodų palyginimas yra patikimas?
Patikimas palyginimas turėtų vertinti alternatyvus to paties, aiškiai apibrėžto tikslo metodus ir pakankamai palyginamomis sąlygomis. Jame turėtų būti nurodyti panaudoti substratai, mėginių ėmimo etapas, analitiniai metodu bei vertinami taršos tipai, o ne pateikiama nepaaiškinta procentinė vertė ar remiamasi reagento reputacija. Palyginimai, apimantys kelis skirtingus modelinius peptidus, gali suteikti daugiau informacijos nei vienas didelis našumas, gautas su lengvu substratu, nes jie parodo, kaip veiksmingumas kinta priklausomai nuo molekulinio konteksto. Net ir tada išvados turėtų apsiriboti faktiškai ištirtomis cheminėmis sistemomis.
Santrauka
Peptidų jungimas yra pagrindinis cheminės peptidų sintezės elementas, nes jis lemia amidinių ryšių, jungiančių aminorūgščių liekanas į peptidinį karkasą, susidarymą. Tačiau jungimo apibūdinimas tik kaip „dviejų aminorūgščių sujungimas” neparodo didelės dalies chemijos, kuri lemia, ar gautas produktas iš tikrųjų yra norimas peptidas.
Junginys, turintis karboksi grupę, paprastai reikalauja aktyvavimo, kad veiksmingas amidinio ryšio susidarymas galėtų vykti tinkamu būdu. Sukabinimo reagentai ir priedai gali palengvinti šį procesą, tačiau jų veiksmingumas priklauso nuo substrato, reakcijos aplinkos bei analitinio rezultato įvertinimo būdo. Todėl reagentą reikia vertinti pilname eksperimento kontekste, o ne klasifikuoti nepriklausomai nuo sintetinamojo peptido.
Apsauginės grupės suteikia papildomą kontrolės lygį, laikinai neleisdamos nepageidaujamoms funkcinėms grupėms dalyvauti reakcijoje. Jų naudingumas priklauso ne tik nuo veiksmingo apsaugojimo, bet ir nuo galimybės selektyviai jas pašalinti bei suderinamumo su vėlesniais sintezės etapais. Apsaugojimo strategija ir gretimos aminorūgščių liekanos taip pat gali turėti įtakos tam tikrų šalutinių produktų susidarymui.
Stereocheminis vientas yra dar vienas svarbus elementas. Sukabinimo reakcija gali lemti amidinio ryšio susidarymą ir kartu generuoti epimerinę medžiagą. Kadangi epimeras gali pasižymėti tokia pačia molekuline mase kaip ir tinkamas peptidas, vien masės atitiktis nepatvirtina visiško struktūrinio teisingumo. Konfigūracijos pokyčių taip pat gali atsirasti kituose etapuose, pavyzdžiui, pradinio aminorūgšties prijungimo prie kietosios fazės metu.
Kiti priemaišos susidaro per skirtingus mechanizmusus. Nepilnas sujungimas gali lemti delekcinių arba sutrumpintų sekų susidarymą, tuo tarpu su aspartimidu susijusios reakcijos gali modifikuoti peptidą, kuriame jau yra tinkamos aminorūgščių liekanos. Proceso pagreitinimas gali paveikti tiek pageidaujamas reakcijas, tiek šalutinius keliams, o papildomos priemaišos taip pat gali susidaryti vėlesniuose etapuose, tokiuose kaip atskėlimas.
Dėl šių priežasčių peptidų jungimo vertinimas reikalauja daugiau nei nustatymo, ar pradinė medžiaga dingo.
Konversija, tikslinio produkto susidarymas, izoliuotas išeiga, chromatografinis grynumas ir stereocheminis grynumas atsako į skirtingus klausimus.
Sintezės metu atliekami testai gali padėti aptikti nebaigtas reakcijas, tačiau patys savaime nepatvirtina pilnos peptido struktūros. Chromatografija ir masės spektrometrija suteikia papildomos informacijos, o klausimai, susiję su stereochemija arba labai panašiomis struktūromis, gali reikalauti papildomų analitinių metodų.
Todėl labiausiai pagrįstas peptidų sujungimo būdas yra nukreiptas į konkrečią molekulę ir pagrįstas duomenimis.
Naudingas poravimo metodas nėra tiesiog toks, kuriame naudojamas žinomiausias arba labiausiai reaktyvus reagentas. Tai metodas, kuris patikimai užtikrina tikslinio molekulinio ryšio susidarymą, kartu išlaikant tinkamą stereocheminį integralumą ir kontroliuojant konkrečiam sintezuojamam peptidui svarbias priemaišas.
Nuorodos
- Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: An efficient additive for peptide synthesis to replace the benzotriazole-based HOBt and HOAt with a lower risk of explosion. Chemistry—A European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T. ir Kuwata, S. (1992). Racemizacijos tyrimai peptide sintezėje atskiriant apsaugotus epimerinius peptidus naudojant atvirkštų fazių didelio efektyvumo skysčių chromatografiją. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A. ir Ruvo, M. (2017). Kombinuoto „Oxyma“ ir „HATU“ naudojimo agreguojančiose peptidinėse sekomis įvertinimas. Peptidų mokslo žurnalas, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, an excellent racemization suppressor for peptide synthesis. Organic & Biomolecular Chemistry, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Kietafazė peptidų sintezė: nuo standartinių procedūrų iki sudėtingų sekų sintezės. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P. ir Vorherr, T. (2003). Aspartimido problema Fmoc pagrindu vykdomoje SPPS. I dalis. Peptidų mokslo žurnalas, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Aspartimido problema Fmoc pagrindu vykdomoje SPPS. II dalis. Peptidų mokslo žurnalas, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Marfey reagento naudojimas racemizacijai kiekybiškai įvertinti pritvirtinant aminorūgštis prie kietųjų nešiklių peptidų sintezei. Analytical Biochemistry, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Palasek, S. A., Cox, Z. J. ir Collins, J. M. (2007). Racemizacijos ir aspartimido susidarymo ribojimas mikrobangų pagreitintoje Fmoc kietosios fazės peptidų sintezėje. „Journal of Peptide Science“, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzendimetantiolis (1,4-BDMT) kaip šalintuvas žalesniam peptidų dervos skilimui. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., ir Pallai, P. (1991). „mu-HPLC / fast atom bombardment mass spectrometry“ metodiką taikant kietfazių peptidų sintezės metu gautų neapdorotų produktų charakterizavimas. Peptidų tyrimai, 4(1), 40–46. PubMed