Spojenje peptidov je kemični proces, ki vodi do tvorbe vezi med komponento, ki vsebuje karboksilno skupino, in komponento, ki vsebuje aminno skupino. V tem procesu nastane amidna vez. Ko takšno vezovanje združuje aminokislinske ostanke med sintezo peptida, postane del tistega, kar imenujemo peptidni skelet.
Reagirajoči elementi ne smejo biti posamezni aminokisline. Reakcija vezave lahko združi en aminokislino z drugim, združi naslednji aminokislina v rastelni peptidni verigi ali združi večje fragmente peptidov, ki so bili prej sintetizirani ločeno.
Na prvi pogled se zlitje peptidov lahko zdi preprosta naloga: zadostuje le povezati en aminokislinski ostanek z naslednjim.
Z vidika kemije pa je tvorba amidnega vezanja le del celotnega cilja.
Spojitev mora potekati na pravem mestu in z ustrezno stereokemijsko konfiguracijo, medtem ko druge reaktivne funkcionalne skupine morajo ostati ustrezno pod nadzorom. Reakcija lahko na videz poteka uspešno in porabi večino ali celo celoten izhodni material, vendar pa lahko povzroči nastanek neželene mešanice končnega peptida in drugih struktur.
Zato končanje reakcije in ustrezno nastanek izdelka nista enaka.
Raziskave, ki primerjajo različne sisteme vezave, strategije za zaščito funkcionalnih skupin ter stereokemijske rezultate, kažejo, zakaj ne obstaja en univerzalno najboljši vezavni reagent, neodvisno od vrste sintetiziranega peptida.
Z znanstvenega vidika ni toliko uporabnega vprašanja:
„Kateri spojni reagent je najboljši?”
Boljše vprašanje je:
„Katero metodo omogoča pridobitev želenega peptida z ustrezno konverzijo, ohranitvijo stereokemijske integritete in ustrezno kontrolo onesnaženja v pogojih, primerljivih s tistimi za določeno molekulo?”
To razlikovanje je ključnega pomena za razumevanje kemije vezave peptidov.
Kaj pomeni združevanje peptidov?
Spojenje združuje dva elementa z ustvarjanjem nove vezi.
V tipični reakciji, ki vodi do nastanka peptidnega skeleta, se karboksilna skupina, vezana na eno od aminokislinskih ostankov, združi z aminno skupino druge ostanke.
Nastajajoči spoj je kemijsko vez med amidom in vodikom.
Če takšno vezavo tvorijo ostanki aminokislin v peptidnem verigu, ga običajno imenujemo peptidna vezava.
Natančen fizični položaj reagirajočih komponent je odvisen od uporabljenih strategij sinteze.
Med sintezo peptidov na stalni fazi se običajno razkrije aminokislinska skupina, ki je del rastočega peptidnega veriga, povezanega z vezivo, medtem ko sestavina, ki vsebuje karboksilno skupino, izvira iz vnesenega zavarovanega aminokislinskega ostanka.
V sintezi, ki poteka v raztopini, lahko obe sestavni deli pa sta prisotni v tekočem stanju.
Pri združevanju fragmentov se združijo večje, zaščitene peptidne dele, namesto da bi dodajali posamezne aminokislinske ostanke enega za drugim.
Različne strategije spreminjajo način izvajanja reakcij, razdeljevanja materialov in njihovega čiščenja, vendar ne odpravljajo osnovnega kemijskega problema: ustrezne kemijske skupine morajo reagirati med seboj, medtem ko neželene reakcije v drugih delih molekule morajo ostati ustrezno omejene.
Nastanek vezave, konverzija in učinkovitost so različni pojmi
Nekaj terminov, ki se pogosto uporabljajo pri opisovanju povezovanja peptidov, lahko zveni podobno, čeprav se nanašajo na različne teme.
Konverzija določa, katera del določene vhodne snovi je bila podvržena reakciji.
Vendar ne pove samodejno, v kaj se je ta material spremenil.
Če se iz 99% prvotnih materialov izgubi nekaj, vendar del tega nastane neželeni stranski produkt, 99-odstotna konverzija ne pomeni, da je nastal 99% namenjenega peptida.
Ustvarjanje končnega izdelka odgovarja na drugo vprašanje: koliko želene molekularne strukture je dejansko nastalo? Odgovor zahteva analitično metodo, ki omogoča razlikovanje med ustreznim izdelkom in pomembnimi alternativnimi strukturami.
Izolirana zmogljivost opisuje količino določenega izdelka, ki se je končno uspelo pridobiti glede na določeno količino začetnega materiala. Na končno zmogljivost lahko torej vplivajo tudi faze obdelave, razdelitve in čiščenja, tudi če je sam proces združevanja potekal učinkovito.
Kromatografska čistost opisuje porazdelitev sestavin, zaznjenih v pogojih določene kromatografske metode. Lahko zagotavlja zelo dragocene informacije o sestavi vzorca, vendar njeno interpretacijo lahko omejujejo stopnja elucije, razlike v odzivu detektorja ali prisotnost sestavin, ki jih določena metoda slabo zazna.
Stereokemijska čistost pa odgovarja na vprašanje, ali je ohranjena namenjena prostorska konfiguracija molekule. To je ločeno analitično vprašanje, saj lahko nekatere stereokemijske variante imajo točno enako maso molekule kot končni produkt.
Te razlike pomagajo razumeti rezultate, ki na prvi pogled lahko izgledajo nasprotujoči si.
Reakcija lahko kaže visoko konverzijo vhodnega materiala, hkrati pa lahko povzroči nastanek več proizvodov. Surov pripravak lahko ima veliko pridobljeno maso, vendar vsebuje veliko količino onesnaževalcev. Intenzivno čiščenje pa lahko privede do pridobivanja materiala z visoko čistostjo na račun manjše učinkovitosti izolacije.
Nobena od teh opazovanj sama po sebi ni v nasprotju z drugimi.
Preprosto opisujejo različne lastnosti izdelka ali različne faze procesa.
Zato je ugotovitev „analiza je bila popolna” znatno bolj pomembna, če je znana tudi metoda analize, ki je bila uporabljena in kaj je bilo natančno merjeno.
Težki substrati razkrivajo različne omejitve procesa
Ne vsaka reakcija vezave peptidov je povezana z enako stopnjo kemijske zahtevnosti.
Močno prenapolnjeno sterično reaktivno mesto lahko upočasni tvorjenje vezi, saj imajo reagirajoče skupine težek dostop do sebe.
Šibka topnost lahko omeji učinkovit stik med komponentami reakcije.
V sintezi v stalni fazi lahko rastajoči peptidni verigah deluje z sosednjimi verigami ali sprejema strukture, ki omejujejo dostop do reaktivnih mest, tudi če so vezni spojinami prisotni v navideznem presežku.
Te težave imajo različne kemijske podlage.
Zato ni mogoče trditi, da bo eno rešitev samodejno učinkovito v vseh primerih.
Raziskave, ki primerjajo strategije ponavljajočega spajanja za težke peptidne sekvence, so analizirale dejanski sestave dobljenih surovih proizvodov, namesto da bi oceno temeljile izključno na teoretični reaktivnosti ali reputaciji posameznih reagentov. Ena od raziskanih strategij je bila v analiziranih modelih uspešna, vendar to ne pomeni obstoja univerzalnega rešitve, ki bi ustrezala vsaki peptidni sekvenci.
Najpomembnejši priporočil je ta, da je učinkovitost metode treba ocenjevati na podlagi proizvoda, pridobljenega iz specifičnega substrata, in ne le na podlagi ugleda uporabljenega dejavnika.
Aktivacija karboksilne skupine
Zakaj je aktivacija običajno potrebna?
Samo mešanje neprečiščenega karboksilnega kislina z amino kislo v običajnih pogojih običajno ne vodi do učinkovitega nastanka čistega peptidnega vezanja.
Namesto tega lahko pride do delovanja kislina–baza, za učinkovito tvorjenje amidnega vezanja pa je potrebna ustrezna kemijska pot.
Zato vezanje peptidov običajno vključuje aktivacijo sestavnega dela, ki vsebuje karboksilno skupino.
Aktivacija povečuje njegovo občutljivost za reakcijo z ustrezno aminno skupino. Ustrezen reakcijski medij in ustrezna odstranljiva skupina omogočata nastanek novega amidnega vezanja.
Aktivirani posredni izdelek lahko obstaja le za kratek čas in ni nujno, da ga je treba izolirati.
Cilj pa ni doseči maksimalne možne kemijske reaktivnosti.
Cilj je nadzorovana reaktivnost.
Aktivirani posredni produkt, ki zelo hitro reagira z vodo, z drugim neželenim nukleofilom ali sodeluje v konkurenčni reakciji, se lahko hitro raztopi, hkrati pa povzroči nastanek relativno majhne količine želenega peptida.
Visoka reaktivnost je torej koristna le takrat, ko jo ustrezno usmerimo v nastanek želenega vezanja.
Spojne snovi in dodatki opravljajo različne funkcije
Pri povezovanju peptidov lahko sodeluje več vrst kemičnih sestavin z različnimi funkcijami.
Karbodiimidi so ena od skupin reagentov, ki se uporabljajo za aktivacijo karboksilnih skupin.
Drugi sistemi za povezovanje uporabljajo drugačne mehanizme aktivacije, vključno s pogosto uporabljenimi reagenti tipa onija, kot so sistemi, ki temeljijo na HATU.
Dodatni spojinami lahko služijo kot dodatki.
Izraz „dodatek” pa ne pomeni, da je določen spoj kemijsko nepomemben. Dodatek lahko vpliva na posredne produkte, učinkovitost vezave, konkurenčne poti reakcij in stereokemijske rezultate.
Raziskave oksima pri sintezi peptidov s karbodiimidi so analizirale tako učinkovitost vezave kot tudi zmanjšanje racemizacije v izbranih modelih.
Ti podatki so dragoceni za raziskane sisteme in konkretne modele.
Vendar to ne pomeni, da uporaba iste spojine v vsakem možnem spoju peptidov prinaša enak rezultat.
Kasnejša raziskava podjetja Oxyma-B je primerjala rezultate glede optične čistosti pri več modelnih peptidih.
Raziskovanje več substratov je še posebej pomembno, saj zelo dobri rezultati pri lahkem kemijsko vezanju ne pomenijo nujno, da bo reagent deloval v strogem stresnem okolju, ki je nagnjen k agregaciji ali je stereokemijsko občutljiv.
Kaj pomeni HATU v sintezi peptidov?
HATU je spojinilno sredstvo, ki se uporablja za lažje tvorjenje amidnih vezi, vključno med sintezo peptidov.
HATU ni peptid.
Niti ni zaščitna skupina.
Samo njegovo prisotnost ne pomeni, da je vez med dvema spojinama končan ali da je pridobljen peptid čist.
Učinkovitost je odvisna od vrste substrata, ostalih reagentov, raztopilnega sistema in širšega konteksta reakcijskih pogojev.
Raziskave sekvenc, občutljivih na agregacijo, so primerjale med drugim pristope, ki temeljijo na HATU, in sisteme Oxyma/karbodiimid v pogojih ponavljajočega se spajanja.
To kaže, zakaj so iskanja, kot je „HATU peptide”, treba razumeti kot vprašanja glede kemije vezave in izbire metode, in ne kot dokaz, da je en specifičen reagent univerzalna metoda sinteze peptidov.
Sama beseda aktivator ne zadostuje za ponazoritev niti za ustrezno interpretacijo objavljenega rezultata.
Pomembni so tudi pogoji reakcije, sekvenca peptida ter način analitične opredelitve uspeha procesa.
Aktivacija in stereokontrola zahtevata ohranjanje ravnovesja
Podaljšano ohranjanje aktivirane derivacije aminokisline v reakcijskem sistemu ni vedno koristno.
Želena reakcija vezave poteka ob drugem možnem kemijskem procesu.
Nekatere konkurenčne poti lahko spreminjajo stereotip.
Eksperimentalna raziskava zavarovanih epimernih produktov je preučevala vpliv kombinacije aminokislin, topila in drugih sestavin reakcije na stereokemijske spremembe, ki se dogajajo med vezavanjem s karbodiimidi.
To kaže na pomembno načelo: celotno okolje reakcije je lahko prav tako pomembno kot splošna skupina uporabljenih spojnih reagentov.
Strategija povezovanja mora torej zagotoviti zadostno odzivnost za ustvarjanje željenega vezanja, hkrati pa omejiti možnost nastanka neželenih reakcij.
Te pravila je mogoče razpravljati v izobraževalne namene, ne da bi jih pretvorili v gotov laboratorijski protokol. Natančne količine reagentov, vrstni red njihovega dodajanja in pogoji reakcije so odvisni od konkretnega razvijanega procesa sinteze.
Vloga zaščitnih skupin
Zaščita omejuje konkurenčne možnosti za odzive
Aminokislina lahko vsebuje več reaktivnih skupin kot le aminno in karboksilno skupino, potrebne za tvorbo peptidnega skrbca.
Njegov stranski lančnik lahko vsebuje dodatne reaktivne kemijske skupine.
Če bi bile vse potencialno reaktivne skupine med vsakim korakom vezave ostale odkrite, bi bila namenjena tvorba peptidnega vezanja lahko konkurentna z razvejanjem ali drugimi neželenimi reakcijami.
Strategija, ki uporablja zaščitne skupine, lahko začasno prikrije izbrane aktivne točke.
Na ta način ustrezne aminokislinske in karboksilne skupine lahko reagirajo med seboj, medtem ko ostale predele ostanejo nedostopne ali dovolj slabo reaktivne v določenih pogojih.
Zaščita torej zagotavlja kemijsko selektivnost.
Učinkovita strategija pa ne temelji le na pridobitvi stabilne kemijsko skupine.
Ohranitveno skupino je treba kasneje tudi odstraniti.
Zaščita, ki učinkovito preprečuje neželene reakcije med vezavo, vendar je pozneje ni mogoče odstraniti brez poškodbe ciljne molekule, ustvarja še en sintetični problem.
Celovita strategija mora torej upoštevati tako stabilnost v obdobju, ko je zaščita potrebna, kot tudi možnost selektivnega odstranitve varovanja, ko ta ne bo več potrebna.
Začasna in dolgoročna zavarovanja opravljajo različne funkcije
Določene zaščitne skupine lahko ostanejo na eni molekuli za različno dolgo obdobje.
V tipični sintezi v stalnem stanju, kjer se uporablja Fmoc za zavarovanje končne aminne skupine rastočega verige, se ta večkrat odstranjuje z zvišanjem dolžine verige.
Veliko skupin zaščitnih verig bočnih vezi pa ostaja prisotna skozi številne cikle spajanja in se odstrani šele v poznejšem obdobju.
Standardne metode, ki temeljijo na Fmoc, kažejo, kako se usklajujejo ponavljajoči se ciklusi selektivnega odstranjevanja zavarovalnih sredstev in vezave.
Vrsta zaščite, potrebne za določen stranski lančnik, je odvisna od ostalih aminokislin, celotnega peptida in izbrane strategije sinteze.
Zato ne bi bilo pravilno trditi, da vsak aminokislina zahteva enako zaščito ali da vse sinteze uporabljajo iste zaščitne skupine.
Začasne zaščitne skupine je treba razlikovati tudi od kemičnih skupin, ki namenoma ostanejo v pripravljenem peptidu.
Na primer, načrtovana modifikacija N-konca ali amid na C-koncu lahko predstavlja del ciljne strukture.
Medtem pa začasna zaščitna skupina, ki se je naključno ohranila v končni molekuli, bi pomenila neželeno strukturno razliko.
Ortogonalnost je pogoj za kemijsko skladnost
Ortogonalna zaščita pomeni strategijo, v kateri lahko izbrane zaščitne skupine odstranimo, pri čemer ostanejo druge zaščitne ukrepe dovolj nedotaknjene.
To omogoča odkrivanje različnih reaktivnih mest na namenoma izbranih stopnjah sinteze.
Ortogonalnost ni mogoče razumeti le kot lastnost posameznega aktivnega sestavnega dela, zapisane na njegovi etiketi.
Opisuje skladnost celotne načrtovane sekvence kemičnih operacij.
Nameravano odstranjevanje zavarovanja mora potekati brez povzročitve nesprejemljivih sprememb v drugih delih rastočega peptida.
V sintezi v stalni fazi lahko ta skladnost vključuje tudi nosilno-spojno enoto ter neobičajne ali posebej kemijsko občutljive gradbene bloke.
Raziskave o nastajanju aspartimidov, v katerih so spremenili zaščitne elemente na obročnih verigah in skeletu v modelnem peptidu, so pokazale razlike v nastajanju stranskih produktov.
To kaže, da izbira varovanja lahko vpliva ne le na nastanek očitne reakcije stranske verige.
Lahko tudi spremeni druge poti nastajanja onesnaževal med sintezo.
Opremni skupini ne zagotavljajo, da se vsi zaporedji obnašajo enako
Čeprav obe sekvenci vsebujejo enak potencialno problematičen aminokislina, se ne morajo obnašati enako.
Sosednje ostanke lahko vplivajo na verjetnost nastanka konkurenčnih reakcij.
Sistemska raziskovanja modelnih zaporedij, ki vključujejo asparaginian, so pokazala, da je aminokislina, ki sledi tej sestavini, v obravnavanih pogojih vplivala na nastanek produktov, povezanih z aspartimidom.
To ne pomeni, da mora vsaka sekvenca, ki vsebuje tak motiv, povzročati težave.
Na drugi strani pa kaže, da je treba kontekst zaporedja upoštevati pri razvoju metode in oceni tveganja.
Strategija zavarovanja, ki je bila uspešna pri enem modelnem peptidu, ne zagotavlja enakega vedenja vsakega drugega peptida, ki vsebuje enako sestavino.
Rasizem in druge stranske reakcije
Rasemacija in epimeracija se nanašata na prostorski sistem delcev
Več aminokislinskih ostankov vsebuje stereokemično središče.
Modificiranje konfiguracije takšnega središča lahko povzroči nastanek strukturno drugačnega elementa, čeprav ostanejo njegova elementarna sestava in molekulska masa nespremenjena.
V resnici pomeni racemizacija izgubo enancijemernega bogatenja v smeri racemne mešanice.
V peptidu, ki vsebuje veliko stereogenih centrov, preusmeritev konfiguracije enega od teh centrov običajno vodi do nastanka epimera, torej vrste distezoimera.
V literaturi o sintezi peptidov pa se izraz „racemizacija” pogosto uporablja širše v zvezi z neželjenimi spremembami konfiguracije, ki se pojavijo med vezavo ali v drugih fazah sinteze.
Ta razlika je pomembna, saj identiteta peptida ni odvisna samo od tega, katera atoma so v molekuli.
Pomembno je tudi njihovo prostorsko razporejanje.
Ne vsa aminokislinska ostanka so povezana z enakim stereokemijskim tveganjem.
Na primer, glicin nima običajnega chiralnega atoma ogljika alfa, ki je prisoten v večini aminokislin.
Ostale dele se razlikujejo po svoji občutljivosti na spremembe konfiguracije glede na svojo strukturo in okolje reakcije.
Normalni razmeram mase lahko spremlja nepravilna stereokemija
Epimerni peptid lahko ima točno enako masno enoto kot ciljni peptid.
Zato opazovanje pričakovane mase s spektrometrijo mas ne pomeni samodejno, da je vsaka aminokislinska sestavina ohranila namenjeno stereokemijsko konfiguracijo.
Kromatografski testi so omogočili ločevanje zavarovanih epimernih peptidov in uporabo teh razvrščenj za analizo stereokemijskih sprememb, povezanih s kemijo vezave.
Odvisno od molekule se lahko ustrezna stereokemijska ocena zahteva z ustreznimi kromatografskimi metodami, referenčnimi spojinami, strategijami derivacije ali drugimi analitičnimi metodami, ki omogočajo razločevanje pomembnih struktur.
Osebni analitični testi so tudi analizirali stereokemijske spremembe, ki se dogajajo med vezavo aminokislin na stalne nosilce.
To vodi do naslednjega pomembnega sklepa: onesnaženje, zaznano v pripravljenem peptidu, ni nujno moralo nastati v zadnji reakciji vezave.
To se je lahko zgodilo v zgodnejšem obdobju in ostalo prisotno tudi v kasnejših fazah sinteze.
Vzroki aspartimiduma so drugačen problem
Vzpostavitev aspartimida je specifičen pot stranskih reakcij, povezan z občutljivimi peptidnimi sekvencami, ki vsebujejo aspartin.
Postopek vključuje ustvarjanje cikličnega posrednega izdelka, iz katerega se lahko nato oblikujejo različne sorodne strukture.
Lahko vključujejo spremenjene vezi v strukturi peptida ter stereokemične variante.
Vzroka aspartimiduma torej ni mogoče opisati zgolj kot drugačno ime za nepopolno vezavo.
Peptidni veriga lahko že vsebuje ustrezne aminokislinske ostanke, poznejša stranska reakcija pa lahko spremeni del njegove strukture.
Eksperimentalna raziskovanja kažejo, da na ta proces lahko vplivajo strategija varovanja, sosednje ostanke ter ponavljajoči se pogoji, povezani z odstranjevanjem zaščitnih skupin.
Ta razlika je še posebej pomembna pri razlaganju težav, ki se pojavljajo pri sintezi.
Samo ponovitev spajanja ali dodajanje večjega števila spojnega dejavnika ne bo samodejno odpravilo onesnaženja, ki je nastalo zaradi povsem drugega kemijskega poteka.
Nepopolne reakcije povzročajo drugačne težave
Nepopolno združevanje ustvarja ločeno kategorijo onesnaževalcev.
Če en lančnik z vezivno snovjo ne prejme načrtovanega aminokislina, vendar se med kasnejšim ciklom pravilno reagira, lahko nastal peptid brez te ostanke ostane.
Takšno molekulo običajno označujemo kot delecijsko verigo.
Drugi verižniki se lahko nehajo podaljševati in ostanejo skrajšani.
Te izdelke se v bistvu razlikujejo od epimerov.
Epimer lahko ima pravilno aminokislinsko sekvenco in skupni formulo, vendar ima nepravilno stereokemijo enega od središč.
Delecionalni peptid ima pa drugačno sekvenco ali dolžino.
Nekatere strategije sinteze uporabljajo tako imenovani capping, da preprečijo nadaljnje podaljšanje določenih neprekinjenih verig.
Zaradi omejevanja pa se nepravilen verig ni mogoče popraviti in ga ni mogoče pretvoriti v ciljni peptid.
Samo njegovo vedenje se spremeni v naslednjih fazah.
Stroga mešanica, pridobljena pri sintezi, lahko torej vsebuje izdelke, ki nastajajo v več različnih mehanizmov.
Enota skupne vrednosti učinkovitosti ne omogoča določitve, kateri mehanizmi nastajanja onesnaženja so bili odgovorni za končni izid.
Temperatura in pogoji procesa vplivajo na kompromis med hitrostjo in kakovostjo
Zvišanje temperature ali drugi načini pospešitve sinteze lahko povečajo hitrost želenih reakcij.
Hkrati pa lahko pospešijo neželene reakcije.
Raziskave SPPS z uporabo mikrovibracij so analizirale racemizacijo in nastanek aspartimida v modelnih sistemih ter pokazale odvisnost vrste ostanka od pogojev uporabe.
To ne pomeni, da je ogrevanje po naravi nepravilno pri sintezi peptidov.
To tudi ne pomeni, da je nižja temperatura vedno boljša.
Najpomembnejša načela so: hitrost procesa in kemijsko kakovost je treba ocenjevati hkrati.
Višja temperatura, daljša izpostavljenost ali večkratno predelavo lahko vplivajo tako na želeno tvorbo vezav kot tudi na konkurenčne reakcije.
Ustrezni kompromis bi se torej moral oceniti eksperimentalno za določeno sekvenco.
Modifikacije končnega izdelka se lahko zgodijo tudi po zaključku samega spajanja.
Raziskave, ki so primerjale različne sredstva za odstranjevanje peptida iz žveplove smole, so pokazale različne profile onesnaženja.
To pomeni, da končnega onesnaženja ni mogoče avtomatično pripisati reakciji vezave.
Sinteza peptida je večstopenjski proces, poznejše razbijanje vezav, odstranjevanje in nadaljnja obdelava pa lahko spremenijo material, ki je bil prej ustvarjen pravilno.
Kako se ocenjuje učinkovitost povezovanja?
Testi, ki se izvajajo med postopkom, odgovarjajo le na določena vprašanja.
Med spajanjem v stalni fazi lahko test za odkrivanje ostalih razpoložljivih aminokislinskih skupin pomaga oceniti, ali je bila acilacijska faza lahko potekala le delno.
Takšni testi so lahko zelo koristni.
Njihova interpretacija pa bi se morala omejiti na kemijsko vprašanje, na katero dejansko odgovarja uporabljena metoda.
Od analitske metode in vrste aminokisline odvisno, lahko testi, ki temeljijo na spremembi barve, reagirajo na različne aminokisline na različne načine.
Pomembno je tudi dostopnost pregledanega kraja.
Reaktivna aminokislinska skupina, do katere testni reagent fizično nima dostopa, ni ista kot skupina aminokisline, ki je uspešno dosegla vezavo – tudi če določen test ne more jasno razlikovati med temi situacijami.
Omejitve lahko torej vključujejo razpoložljivost reaktivnega prostora, občutljivost testa, kemijske interference in vrsto zaznane funkcionalne skupine.
Negativni rezultat testa, opravljenega med procesom, ni treba samodejno interpretirati kot dokaz, da ima celoten peptid pravilno sekvenco, stereokemično strukturo in čistost.
Monitoriranje procesa je najbolj koristno, kadar lahko rezultate kasneje primerjamo z analizo dejanskega peptidnega proizvoda.
Kromatografija razdvaja, masna spektrometrija pa pomaga opredeliti sestavine
Kromatografija in masna spektrometrija zagotavljata informacije, ki se dopolnjujeta.
Kromatografija lahko loči sestavine vzorca in kaže prisotnost več kot enega zaznavnega sestavnega dela.
Masna spektrometrija lahko zagotavlja informacije o masni sestavi molekule in tako pomaga pri karakterizaciji ali določanju posameznih sestavin.
Raziskave, ki so povezovale obe tehniki, so omogočale analizo surovih proizvodov sinteze peptidov v stalni fazi in pridobivanje informacij o njihovi identiteti ter stopnji odstranjevanja zaščitnih skupin.
Združevanje obeh metod običajno zagotavlja več informacij kot domneva, da je vsak kromatski pik že identificiran ali da vsaka zaznana masa ustreza čistemu in strukturno popolnemu frakciji.
Vendar pa obstajajo omejitve.
Različni sestavni deli se lahko združijo, kar pomeni, da jih ni mogoče popolnoma ločiti s kromatografijo.
Določene snovi lahko prav tako povzročijo različno odziv detektorja.
Strukturne izomere in stereoizomere lahko zahtevajo uporabo dodatnih analitskih metod.
Iz istega razloga samo navajanje, da je peptid preizkušen s metodo HPLC, ne pomeni samodejno, da so bili razkrojeni vsi pomembni kontaminanti.
Upornost določene metode HPLC je odvisna od dejansko pridobljenega razdelka in od analitičnega vprašanja, na katero mora odgovoriti.
Je treba pojasniti, kako je bil izračunan izid
Percentualna vrednost, navedena v zvezi s povezovanjem peptidov, lahko pomeni nekaj povsem različnih stvari.
Lahko se nanaša na pretvorbo vhodnega materiala, relativno površino kromatografskega pikta, izmerjeno vsebnost končnega proizvoda, zmogljivost surovega materiala ali izolirano zmogljivost.
Navajanje samega števila brez pojasnitve, o čem govori, lahko torej ustvari zavajajoč vtis velike natančnosti.
Zanesljive primerjave morajo opredeliti substrat, analizirani fazo vezave, uporabljeno analitsko metodo, čas odvzema vzorca ter vrste preučevanih onesnaževal.
Če je bila uporabljena ponavljajoča se kombinacija, je to tudi treba upoštevati.
Končni rezultat po dveh operacijah združevanja ne sme odražati tega, kar se je zgodilo med prvo reakcijo.
Podobno previdnost zahteva meje zaznavnosti analitskih metod.
Izjava „nietrpeljiv” pomeni, da se določena snov v določenih pogojih in z omejitvami uporabljenega postopka ne odkrije.
Ne bi smelo biti avtomatično podana kot absolutno trditev, da takšna onesnaženost sploh ne obstaja.
Podatki o reagentu morajo vključevati več kot le enostaven model.
Spojni faktor, ki deluje izjemno dobro v preprosti modelni reakciji, se lahko obnaša drugače pri aminokislini z veliko stereoizomerno napetostjo, občutljivem stereohemičnem centru, slabo topnim substratu ali peptidnem verigu za katero je značilna agregacija.
Raziskave, ki primerjajo Oxyma-B z več modelnimi peptidnimi spojinami, kažejo, zakaj je ocena kemijske vezi na več kot enem substratu koristna.
Končno koristna metoda spajanja bi morala omogočiti pridobitev želenega strukture z sprejemljivim profilom onesnaženja in ponovljivim rezultatom za ciljno sintezo.
Zato je učinkovitost povezovanja bolje razumeti kot zbirko različnih meritev kot pa kot lastnost opisano z imenom posameznega reagenta ali rezultatom enega testa za izločanje substrata.
Pogosto zastavljena vprašanja
1. Zakaj so med sintezo peptidov potrebni zaščitni skupini?
Zaščitne skupine začasno omejujejo neželene reakcije, zaradi česar ustrezne funkcionalne skupine lahko ustvarijo namenjeno peptidno vezavo. Aminokisline lahko vsebujejo več reaktivnih mest in njihovo hkrati dostopno ohranjanje lahko vodi do konkurenčnih reakcij. Učinkovita varnostna strategija mora prav tako upoštevati možnost poznejšega odstranjevanja varnostnih mehanizmov ter njeno skladnost z ostalim delom molekule. Modelične raziskave kažejo, da lahko izbira zaščitnih skupin vpliva ne le na osnovno selektivnost reakcije, temveč tudi na nastanek stranskih produktov. Zaščitna skupina je torej eno od elementov celotne sintezne strategije in ne univerzalna rešitev za vse kemijske težave.
2. Ali pravilno povezovanje lahko še vedno povzroči nastanek onesnaženja?
Da. Namerjeni peptidni vezavi se lahko zgodi, medtem ko druge molekule v isti mešanici nepopolnoma konvertirajo ali povzročajo neželene stranske reakcije. To še posebej dobro kažejo raziskave epimernih produktov, saj je nastanek ustreznega vezave in ohranjanje ustrezne stereokemije ločeni problemi. Ugotovitev ciljnega peptida torej ne pomeni, da je to edini prisoten produkt. Znanstveno utemeljena ocena uspešnosti vezave zahteva določen končni izid analize in informacije o pomembnih onesnaževalih.
3. Ali je vezava peptidov enako kot celotna sinteza peptida?
Ne. Pridružitev je posamičen proces tvorjenja vezi v okviru precej širšega procesa sinteze. Sintetizacija na stalni fazi lahko vključuje tudi vezavo na nosilec, zavarovanje, odstranjevanje zaščitnih skupin, večkratno prečiščevanje, odstranjevanje, obdelavo, čiščenje in končno karakterizacijo. Ker so lahko tudi neželeni produkti nastajali tudi izven faze pridružitve, končnega onesnaženja ni treba samodejno pripisovati nepravilnemu pridruževanju brez podatkov, ki bi kazali na njegovo dejansko izvor.
4. Zakaj se karboksilna skupina aktivira?
Aktywacija karboksilne skupine ustvarja bolj ugodno pot njene reakcije z ustreznim aminokislinskim skupino, kar olajša nastanek amidnega vezanja. Zvišana aktivnost pa lahko omogoča tudi konkurenčne reakcije. Zato pri oceni spojnih sistemov analiziramo ne le učinkovitost tvorjenja vezave, temveč tudi stereokemijske učinke in nastanek stranskih produktov. Namen aktivacije ni maksimalno povečanje reakcijske aktivnosti molekule, ampak doseganje ustrezne selektivnosti reakcije.
5. Kaj služi HATU?
HATU je vezivno sredstvo, ki se uporablja za lažje tvorjenje amidnih vezi, vključno z vezavo peptidov. Ni peptid ali zaščitna skupina. Primerjalne raziskave težkih peptidnih zaporedij kažejo, da je treba metode, ki uporabljajo HATU, ocenjevati v celotnem kontekstu reakcijskih pogojev. Sama informacija, da se je uporabljalo HATU, ne potrjuje popolne konverzije, ohranjanja stereokemije ali boljšega profila onesnaženja.
6. Ali obstaja eden najboljših reagentov za vezavo peptidov?
Ne. Ne obstaja univerzalni razvrščeni seznam reagentov, ki bi bil primeren za vsak peptid in vsako reakcijo. Stresna koncentracija, topnost substrata, agregacija, stereokemijska občutljivost in kontekst sekvence lahko vplivajo na rezultat. Izbira reagensa bi se torej morala temeljiti na izmerjenih rezultatih za določeno reakcijo in ne le na njegovi reputaciji ali priljubljenosti.
7. Ali sta „spojna snov” in „dodatek” enaka?
Ne. Te izraze lahko opisujejo različne funkcije v sistemu vezave. Aktivator lahko neposredno sodeluje pri aktivaciji, medtem ko lahko dodatek vpliva na nastanek posrednih produktov, učinkovitost reakcije, stereokemijsko integriteto ali konkurenčne kemijske poti. Zato je treba analizirati celoten reakcijski sistem in ne obravnavati vseh njegovih komponent kot zamenljivih analogov.
8. Ali je mogoče združiti celotne dele peptidov namesto posameznih aminokislin?
Da. Reakcija vezave lahko združuje več zaščitenih peptidnih fragmentov in ne le posamezne aminokisline. Zvečanje velikosti reagirajočih sestavin pa ne odpravlja potrebe po nadzoru selektivnosti reakcijskega mesta, stereokemije ali končne karakteristike izdelka. V primeru vezave fragmentov so še vedno potrebni podatki, ki potrjujejo, da je ustrezno vezavo dejansko ustvarjeno pravilno.
9. Kakšna je razlika med rasemacijo in epimerezacijo?
Rasemacija v pravem pomenu pomeni izgubo enantiomernega bogastva v smeri racemne mešanice, medtem ko epimerizacija pomeni spremembo konfiguracije enega od središč stereogenosti v molekuli, ki vsebuje več takih središč. V literaturi o sintezi peptidov se termin racemacija pogosto širše uporablja za opis neželenih sprememb konfiguracije aminokislinskih ostankov. Zato mora natančen izraz ustrezati dejanski strukturni spremembi.
10. Ali lahko spektrometrija mas odkrije vsak stereokemijski napako?
Ne. Stereoizomere lahko imajo točno enako masno enoto. Zato pridobitev pričakovane mase ne potrjuje pravilne konfiguracije vsakega stereogenega centra. Za oceno takšnih razlik so lahko potrebne dodatne metode, na primer ustrezne kromatografske tehnike ali strategije derivacije. Masna spektrometrija ostaja izjemno uporabno orodje za karakterizacijo molekul, vendar je njene rezultate treba interpretirati v skladu z omejitvami konkretnega strukturnega vprašanja.
11. Ali nastanek aspartimidov pomeni preprosto neuspeh vezave?
Ne. Nastanek aspartimida je ločen pot sekundarne reakcije, povezan z občutljivimi sekvencami, ki vsebujejo asparaginin. Na njegovo nastanek lahko vplivajo sosednje ostanke in pogoji vezave zaščitnih skupin. Zato se lahko pojavi neželena strukturna sprememba, tudi če je ustrezni aminokislina že pravilno vezana. Določitev izvora onesnaženja je pomembno, saj ponovitev vezave ne sme rešiti težave, ki izhaja iz popolnoma druge reakcijske poti.
12. Ali ponovitev spajanja zagotavlja uspeh reakcije?
Ne. Ponovni spoj ni v nekaterih primerih ne izboljša konverzije, niti ne zagotavlja, da bodo vsi reaktivni mesti postali dostopni ali da bodo druga neželena reakcija odpravljena. Rezultat je še vedno odvisen od substrata in metode uporabe. Zato je analiza izdelka potrebna za ugotovitev, kaj je dejansko povzročilo dodatno vezavo.
13. Ali vedno višja temperatura izboljša kakovost spajanja?
Ne. Zvišanje temperature lahko pospeši željeno reakcijo, vendar lahko tudi pospeši neželene kemijske procese. Hitrejši prenos ne sme biti zato samodejno interpretiran kot izboljšanje kemijske kakovosti. Temperaturo je treba ocenjevati tako z vidika nastajanja končnega proizvoda kot tudi profila nastajajočih onesnaževal.
14. Ali izginotje proste aminokislinske skupine potrjuje nastanek pravilnega peptida?
Ne. Pomanjkanje zaznavne proste aminokislinske skupine odgovarja na veliko ožje vprašanje glede določene funkcionalne skupine v pogojih uporabljenega testa. Ne potrjuje samostojno celotne sekvence peptida, njegove stereokemije ali čistosti. Nadzor proste aminokislinske skupine lahko predstavlja koristen element kontrole procesa, vendar ne nadomesti končne karakterizacije proizvoda.
15. Ali je čistost HPLC enaka učinkovitosti spajanja?
Ne. Čistost HPLC in zmogljivost opisujeta različne lastnosti. Čistost HPLC je odvisna od metode za opisovanje sestave zaznanih sestavin vzorca, medtem ko se zmogljivost nanaša na količino določenega proizvoda, dobljenega glede na določeno količino začetnega materiala. Čiščenje lahko poveča kemijsko čistost, hkrati pa zmanjša količino pridobljenega končnega proizvoda. Zato je odstotni delež omejen, če ni natančno določeno, kaj to predstavlja.
16. Ali lahko nastanejo onesnaženja že po zaključku spajanja?
Da. Po zaključku procesa vezave se sinteza peptida nadaljuje z nadaljnjimi kemijskimi fazami. Odstranjevanje zaščitnih skupin, odvajanje in nadaljnja obdelava lahko spremenijo molekulo ali povzročijo nastanek dodatnih onesnaževal. To ne pomeni, da se vsako končno onesnaženje pojavi v poznejših fazah, ampak kaže, zakaj pravilno vezavo ne more zagotoviti kakovosti končnega izdelka.
17. Kaj naredi primerjavo metod povezovanja verodostojno?
Zanesljiv primerjava bi morala ocenjevati alternativne metode za isti jasno določen cilj in v dovolj primerljivih pogojih. Morala bi navajati uporabljene substrate, fazo odvzemov vzorcev, analitske metode ter ocenjene vrste onesnaženja, namesto da bi predstavljala nepojasnjeno odstotno vrednost ali temeljila na reputaciji aktivatorja. Primerjave, ki zajemajo več različnih modelnih peptidov, lahko zagotovijo več informacij kot ena sama visoka učinkovitost za enostaven substrat, saj kažejo, kako se učinkovitost spreminja v skladu s molekularnim kontekstom. Vendar bi morali sklepi ostati omejeni na dejansko preizkušene kemijske sisteme.
Povzetek
Spojenje peptidov je temeljni element kemijske sinteze peptidov, saj vodi do nastanka amidnih vezi, ki povezujejo aminokislinske ostanke v peptidni sklop. Opisovanje spajanja le kot „združevanja dveh aminokislin” pa prikriva velik del kemije, ki odloča o tem, ali je pridobljen izdelek resnično namenjeni peptid.
Sestavina, ki vsebuje karboksilno skupino, običajno potrebuje aktivacijo, da lahko učinkovito nastane amidno vezavo. Združevalna sredstva in dodatki lahko ta proces olajšajo, vendar je njihova učinkovitost odvisna od substrata, okolja reakcije in načina analize rezultata. Zato je treba aktivator analizirati v celotnem eksperimentalnem kontekstu in ga ne razvrščati neodvisno od sintetiziranega peptida.
Zaščitne skupine zagotavljajo dodatni nivo kontrole z začasnim onemogočanjem neželenim funkcionalnim skupinam sodelovanja pri reakciji. Njihova uporabnost je odvisna ne le od učinkovite zaščite, temveč tudi od možnosti selektivnega odstranjevanja in skladnosti z naslednjimi stopnjami sinteze. Strategija zaščite ter sosednje ostale aminokisline lahko prav tako vplivajo na nastanek določenih stranskih produktov.
Integralna stereokemija je še en pomemben element. Reakcija vezave lahko povzroči nastanek amidnega vezanja, hkrati pa ustvari epimero. Ker lahko epimer ima enako masno enoto kot pravi peptid, sama skladnost mase ne potrjuje popolne strukturne pravilnosti. Spremembe konfiguracije se lahko pojavijo tudi na drugih stopnjah, kot je začetno vezanje aminokisline na fazo stalnega stanja.
Drugi onesnaževalci nastajajo z različnimi mehanizmi. Nedokončano vezanje lahko povzroči nastanek delecijskih ali skrajšanih sekvenc, medtem ko reakcije, povezane z aspartimidom, lahko spreminjajo peptid, ki že vsebuje ustrezne aminokislinske ostanke. Pospešitev procesa lahko vpliva tako na želene reakcije kot tudi na stranski poti, dodatna onesnaženja pa se lahko tudi pojavijo v kasnejših fazah, kot je odcepitev.
Iz teh razlogov ocena povezave peptidov zahteva nekaj več kot ugotovitev, ali je izvirni material izginil.
Konverzija, nastanek končnega izdelka, izolirana zmogljivost, kromatografska čistost in stereokemijska čistost odgovarjajo na različna vprašanja.
Testi, ki se izvajajo med sintezo, lahko pomagajo pri odkrivanju nepopolnih reakcij, vendar ne potrjujejo samega kompleta peptidne strukture. Kromatografija in masna spektrometrija zagotavljata dopolnjujoče se informacije, medtem ko vprašanja glede stereokemije ali zelo podobnih struktur lahko zahtevajo dodatne analitske metode.
Najbolj utemeljjen pristop k povezovanju peptidov je torej usmerjen na določeno molekulo in temelji na podatkih.
Uporabna metoda povezovanja ni preprosto metoda, ki uporablja najznaniji ali najaktivnejši reagent. To je metoda, ki na ponovljiv način vodi do nastanka želenega molekularnega povezovanja, hkrati pa ohranja ustrezno stereokemijsko integralnost in nadzor pomembnih onesnaževal za specifičen sintetiziran peptid.
Reference
- Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: učinkovita dodatna snov za sintezo peptidov, ki nadomesti HOBt in HOAt na osnovi benzotriazola z manjšim tveganjem za eksplozijo. Kemija—European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Študije racemizacije pri sintezi peptidov z ločevanjem zaščitenih epimernih peptidov s pomočjo visoko zmogljive tekočinsko-tehnične kromatografije (HPLC). International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluacija kombinirane uporabe Oxyme in HATU pri združevanju peptidnih zaporedij. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, odličen zaviralec racemizacije pri sintezi peptidov. Ekološka in biomolekularna kemija, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Sintetična peptidna sinteza na trdni fazi: Od standardnih postopkov do sinteze težkih sekvenc. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Problem aspartimida v spletni metodi za dobavo fosforne kisline (FMOC) del I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Problem aspartimida v spletni metodi za sintezo fosfornih spojin na osnovi Fmoc. Del II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Uporaba Marfeyjevega reagenta za kvantifikacijo racemizacije ob vezavi aminokislin na trdne nosilce za sintezo peptidov. Analitična biokemija, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Zmanjšanje racemizacije in tvorbe aspartimida pri sintezi peptidov v trdni fazi z uporabo mikrovalovnega sistema Fmoc. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzendimetanitol (1,4-BDMT) kot odstranjevalec sledi po razcepitvi zelenih peptidnih smol. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D. in Pallai, P. (1991). Opisovanje surovih produktov pri sintezi peptidov v trdni fazi z masno spektrometrijo z mu-HPLC/hitrim atomskim bombardiranjem. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed