Свързването на пептидите е химически процес, който води до образуването на връзка между компонент, съдържащ карбоксилна група, и компонент, съдържащ аминогрупа. В резултат на тази реакция се получава амидно свързване. Когато такова свързване свързва остатъчните аминокиселини по време на синтеза на пептид, то става част от това, което се нарича пептиден скелет.
Реактивните съставки не трябва да са отделни аминокиселини. Реакцията на свързване може да свърже един аминкиселин с друг, да свърже следващ аминкисел към растящия пептиден верига или да свърже по-големи фрагменти на пептидите, които преди това са били синтезирани поотделно.
На пръв поглед свързването на пептиди може да изглежда като проста задача: достатъчно е да се свърже един аминнокислот с друг.
От химическа гледна точка обаче създаването на амидна връзка е само част от целия процес.
Синтезата трябва да се осъществи на правилното място и при съответната стереохимична конфигурация, докато другите реактивни функционални групи трябва да останат подходящо контролирани. Реакцията може да протича успешно и да използва по-голямата част или дори целия изходен материал, но все пак да доведе до образуването на нежелана смес от целевия пептид и други структури.
Затова завършването на реакцията и правилното образуване на продукта не означават едно и също нещо.
Изследванията, сравняващи различни системи за свързване, стратегиите за защита на функционални групи и стереохимичните резултати, показват защо не съществува един универсално най-добър свързващ агент, независимо от вида на синтезирания пептид.
От научно гледище по-полезната въпроса не е:
„Кой свързващ агент е най-добрият?”
По-добрият въпрос е:
„Какво решение позволява получаването на целевия пептид с подходяща конверсия, запазване на стереохимията и подходящ контрол на замърсяванията при условия, подходящи за конкретната молекула?”
Това разграничение е от основно значение за разбирането на химията на свързването на пептидите.
Какво означава свързването на пептидите?
Синтезата свързва два компонента чрез създаването на нов връзък.
В типичната реакция, водеща до образуването на пептиден скелет, карбоксилната група, свързана с една от останалите аминокиселини, се свързва с аминогрупата на другата остатъчна аминокиселина.
Натрупващият се съединител е химиялно свързан амид.
Ако такова свързване свързва останалите аминокиселини в пептидния протеин, то обикновено се нарича пептидно свързване.
Точният физически разположение на реагиращите компоненти зависи от използваната стратегия на синтеза.
По време на синтеза на пептидите на стайната фаза, откритата аминогрупа обикновено принадлежи към растящия пептиден верига, свързан с целулозата, докато компонентът, съдържащ карбоксилната група, идва от въвеждания защитен аминокиселин.
При синтеза, извършван в разтвора, и двете съставки обаче могат да бъдат в течна фаза.
При свързването на фрагментите се свързват по-големи, защитени пептидни сегменти, вместо да се добавят отделни остатъци от аминокиселини един по един.
Различните стратегии променят начина на провеждане на реакциите, разделянето на материалите и тяхното почистване, но не решават основния химичен проблем: правилните функционални групи трябва да реагират помежду си, докато нежеланите реакции в други части на молекулата трябва да останат достатъчно ограничени.
Създаването на връзка, конверсията и ефективността са различни понятия
Няколко термини, често използвани при описанието на свързването на пептиди, могат да звучат подобно, въпреки че се отнасят до различни въпроси.
Конверсията определя каква част от дадения изходен материал е била подложена на реакция.
Това обаче не означава автоматично какво точно е превърнало този материал.
Ако 99% от изходния материал изчезне, но част от него образува нежелани странични продукти, 99%-ов процент на конверсия не означава, че е получено 99% от желания пептид.
Създаването на целевия продукт отговаря на друг въпрос: каква количество желана молекулярна структура действително е била създадена? Отговорът изисква аналитичен метод, който да позволява разграничаването на правилното изделие от значимите алтернативни структури.
Производителността на изолирането описва количеството определен продукт, което в крайна сметка е успяло да бъде възстановено спрямо дефинираното количество начално вещество. Следователно крайната производителност може да бъде повлияна и от етапите на обработката, разделянето и пречистването, дори ако самият процес на свързване протича ефективно.
Хроматографската чистота описва разпределението на съставните елементи, откривани при условията на определена хроматографска процедура. Тя може да предоставя много ценна информация за състава на пробата, но интерпретацията ѝ може да бъде ограничена от съвместната елюзия, разликите в отговора на детекторите или наличието на съставки, слабо откривани от дадена процедура.
Стереохимичната чистота отговаря на въпроса дали запазена е целенасочената пространствена конфигурация на молекулата. Това е отделно аналитично съображение, тъй като някои стереохимични варианти могат да имат точно същата маса на молекулата като целевия продукт.
Тези разлики помагат да се разберат резултатите, които на пръв поглед може да изглеждат противоречиви.
Реакцията може да показва висока конверсия на изходния материал и в същото време да води до образуването на няколко продукта. Суровият препарат може да има голямо количество възстановена маса, но да съдържа значително количество замърсявания. Интензивната пречистване може обаче да доведе до получаване на материал с висока чистота на цената на по-ниска ефективност на изолираната дейност.
Никое от тези наблюдения не противоречи само по себе си на останалите.
Те просто описват различните свойства на продукта или различните етапи на процеса.
Затова твърдението „анализът беше пълен” има много по-голяма стойност, ако също е известно каква аналитична методология е била използвана и какво точно е измерено.
Трудните субстрати разкриват различни ограничения на процеса
Не всяка реакция на свързване на пептиди е свързана с еднаква степен на химическа сложност.
Много натовареното стереореактивно място може да забавя образуването на свързването, тъй като реагиращите групи имат затруднен достъп до себе си.
Лошата разтворимост може да ограничи ефективния контакт между компонентите на реакцията.
При синтезата в стайна фаза растящият пептиден модел може да взаимодейства с близките модели или да приема структури, които ограничават достъпа до реактивни места, дори когато свързващите реагенти са налице в прекомерно количество.
Тези проблеми имат различни химични основи.
Поради това не може да се предполага, че едно решение автоматично ще бъде ефективно във всички случаи.
Проучванията, сравняващи стратегиите за многократно свързване при трудни пептидни последователности, анализираха действителния състав на получените сурови продукти, вместо да се основават оценката само на теоретичната реактивност или репутацията на отделните реагенти. Една от изследваните стратегии се представи добре в анализираните модели, но това не означава наличието на универсално решение подходящо за всяка пептидна последователност.
Най-важният извод е, че ефективността на метода трябва да се оценява въз основа на получения продукт от конкретен субстрат, а не само въз основа на репутацията на използваната реакция.
Активиране на карбоксилната група
Защо активирането обикновено е необходимо?
Само смесването на необработения карбоксилов кисел с амин в обикновени условия обикновено не води до ефективно образуване на чист пептиден свързване.
Вместо това могат да възникнат киселинно-алкални взаимодействия, а ефективното образуване на амидно свързване изисква подходяща химична пътека.
Ето защо свързването на пептидите обикновено включва активирането на компонент, който съдържа карбоксилна група.
Активацията увеличава неговата способност да реагира с подходящата аминогрупа. Правилната среда на реакция и подходящата отстъпваща група улесняват образуването на нов амиден връзка.
Активираният междинен продукт може да съществува само за кратко време и не е необходимо да бъде изолиран.
Целта обаче не е да се постигне максимална възможна химична реактивност.
Целта е контролирана реактивност.
Активираният междинен продукт, който реагира много бързо с водата, с друг нежелано нуклеофил или участва в конкурентна реакция, може бързо да изчезне, като в същото време води до образуването на сравнително малко количество целевия пептид.
Високата реактивност е благоприятна само когато може да бъде насочена правилно към постигането на целите свързвания.
Специфичните разтворители и добавките изпълняват различни функции
При свързването на пептидите могат да участват няколко вида химични съставки, изпълняващи различни функции.
Карбодиимидите са една от семействата на реагенти, използвани за активиране на карбоксилни групи.
Други системи за свързване използват различни механизми за активиране, включително често срещаните механизми на типа „онионов“, като например системи, базирани на HATU.
Допълнителните съединения могат да изпълняват функцията на добавки.
Терминът „добавка” обаче не означава, че даден съединение е химически безполезен. Добавката може да повлияе на междинните продукти, ефективността на свързването, конкурентните пътеки на реакциите и стереохимичните резултати.
Изследванията върху Oxyma в синтеза на пептиди с участието на карбодиимиди анализираха както ефективността на свързването, така и ограничаването на рацемизацията при избрани модели.
Такива данни са ценни за изследваните системи и конкретни модели.
Те обаче не означават, че прилагането на същия съединител във всеки възможен вариант на свързване на пептидите ще доведе до идентичен резултат.
По-късни изследвания на Oxyma-B сравняваха резултатите за оптичната чистота при няколко модели пептиди.
Изследването на множество субстрати е особено важно, тъй като много добри резултати при лесно химично свързване не трябва да предсказват поведението на реагента в място, където има висока степен на агрегация или където има висока степен на стереохимия.
Какво означава HATU в синтеза на пептиди?
HATU е свързващ агент, използван за улесняване на образуването на амидно свързване, включително при синтеза на пептиди.
HATU не е пептид.
Той също не е охранителна група.
Самото му присъствие не е доказателство, че свързването е завършило или че полученият пептид е чист.
Ефективността зависи от вида на субстрата, останалите реактивни вещества, системата на разтворителите и по-широкия контекст на условията на реакцията.
Проучванията на секвенции, податливи на агрегация, сравняваха, наред с другото, подходи, базирани на HATU, и системи Oxyma/карбодиимид при условия на повтарящо се свързване.
Това показва защо търсения като „HATU peptide” трябва да се разбират като въпроси относно химията на свързването и избора на метода, а не като доказателство, че един конкретен реагент представлява универсална методология за синтеза на пептиди.
Самата наименование на реактива не е достатъчно, за да се възпроизведе и да се направи правилна интерпретация на публикувания резултат.
Важни са също условията на реакцията, последователността на пептида и начинът за аналитично определяне на успеха на процеса.
Активирането и стереохимичната контрола изискват запазване на равновесието.
По-дългото запазване на активираната производна на аминокиселина в реактивната система не винаги е от полза.
Желаната реакция на свързване възниква успоредно с други възможни химични процеси.
Някои конкурентни маршрути могат да променят стереотипа.
Експерименталните изследвания върху защитените епимерни продукти анализират влиянието на комбинациите от аминокиселини, разтворител и други компоненти на реакцията върху стереохимичните промени, протичащи по време на свързването с участието на карбодиимиди.
Това показва важната принципа: цялата среда на реакцията може да бъде също толкова важна, колкото и общата група на свързващия реагент, използван.
Стратегията за свързване трябва следователно да осигурява достатъчна реактивност за постигане на желаното свързване, като същевременно се ограничава възможността за възникване на нежелани реакции.
Тези правила могат да бъдат обсъждани с образователна цел, без да се превръщат в готов лабораторен протокол. Точните количества реагенти, редът на добавянето им и условията на реакцията зависят от конкретния синтез, който се разработва.
Ролята на охранителните групи
Сигурността ограничава местата за реакция на конкуренцията
Аминокиселината може да съдържа повече реактивни групи, отколкото само амино- и карбоксилната група, необходими за създаването на пептидната структура.
Неговият страничен верига може да съдържа допълнителни реактивни химични групи.
Ако всички потенциално реактивни групи оставаха открити по време на всеки етап на свързването, целенасоченото образуване на пептидно свързване би могло да се конкурира с разклоняването или други нежелани реакции.
Стратегията, която използва защитни групи, позволява временно да се прикрият избрани места за реакция.
Благодарение на това подходящите амино- и карбоксилни групи могат да реагират помежду си, докато други места остават недостъпни или достатъчно слабо реактивни при тези условия.
По този начин защитата осигурява химическа селективност.
Ефективната стратегия обаче не се състои само в свързването на стабилно химично свързана група.
Групата за охрана трябва също да бъде премахната по-късно.
Защитата, която ефективно предотвратява нежеланите реакции по време на свързването, но която не може да бъде отстранена по-късно без повреда на целевата молекула, създава още един синтетичен проблем.
Поради това пълната стратегия трябва да отчита както стабилността през периода, в който е необходима защитата, така и възможността за избирателно отстраняване на защитата, когато тя вече не е необходима.
Временните и дългосрочните гаранции изпълняват различни функции
Отделните групи от защитници могат да останат на частица за различен период от време.
При типичната синтеза на постоянна фаза, използваща Fmoc като защитна група за крайната аминогрупа на растящия верижен фрагмент, тя се отстранява многократно с увеличаването на продължителността на последователността.
Много от групите на защитните вериги на страничните зъби обаче остават активни през много цикли на свързване и се отстраняват едва на по-късен етап.
Стандартните методи, базирани на Fmoc, показват как се координират повтарящите се цикли на избирателно отстраняване на защити и свързване.
Видът на защита, необходим за конкретен бонен протеин, зависи от останалите аминокиселини, целия пептид и избраната стратегия на синтеза.
Не би било правилно да се твърди, че всеки амин-основен протеин изисква идентично защитно покритие или че всички синтезирани протеини използват същите защитни групи.
Временното защитно тяло също трябва да се различава от химичните групи, които умишлено остават в готовия пептид.
Планираното модифициране на N-концето или на amid на C-концето например може да представлява част от целната структура.
От друга страна, временната защитна група, която случайно остава в крайната молекула, би означавала нежелана структурна разлика.
Ортональничността е условие за химичната съвместимост
Ортонаталната защита представлява стратегия, при която избрани групи за защита могат да бъдат отстранени, като остават други защити достатъчно непроменени.
Това позволява да се открият различни места на реакция на целенасочени етапи на синтеза.
Ортональничността не трябва да се разбира просто като свойство на отделния активен компонент, записан върху етикета му.
Тя описва съвместимостта на цялата планирана последователност на химическите операции.
Планираното отстраняване на защитния механизъм трябва да протича без да причинява нежелани промени в другите части на растящия пептид.
В синтеза в стационарна фаза тази съвместимост може да включва също така носително-контактен комплекс и нестандартни или особено химично чувствителни строителни блокове.
Изследванията върху образуването на аспартимид, при които се модифицираха защитните механизми на страничните вериги и скелетната част в моделния пептид, показаха разлики в образуването на странични продукти.
Това показва, че изборът на защитата може да повлияе не само на появата на очевидна реакция на страничния верижен механизъм.
Той може също така да променя други пътища на образуване на замърсявания по време на синтеза.
Охранителните групи не гарантират, че всички последователности се държат по същия начин
Дори ако две последователности съдържат същия потенциално проблемен аминнокинеин, те не трябва да се държат еднакво.
Другите съседни останки могат да повлияят на вероятността от поява на конкурентни реакции.
Систематичните изследвания на моделирани последователности, съдържащи аспарагинин, показаха, че аминокиселината, която следва тази остатъчна част, влияе върху образуването на продукти, свързани с аспартимид, при изследваните условия.
Това не означава, че всяка последователност, съдържаща такъв мотив, трябва да причинява проблеми.
Вместо това показва, че контекстът на последователността трябва да бъде взет под внимание при разработването на метода и оценката на риска.
Стратегията за защита, която се оказа успешна при един модел пептид, не гарантира идентично поведение на всеки друг пептид, съдържащ същата оста.
Рацемизация и други странични реакции
Рацемизацията и епимеризацията се отнасят до пространствената структура на молекулата
Много от остатъчните аминокиселини съдържат стереоцентър.
Промяна в конфигурацията на такова ядро може да доведе до образуването на структурално различна частица, дори ако нейният химичен състав и молекулярната маса останат непроменени.
Строго казано, рацемизацията означава загуба на енанцемеричното обогатяване в посока на рацемична смес.
В пептид, съдържащ много стереоцентрали, обръщането на конфигурацията на един конкретен център обикновено води до образуването на ептимер, т.е. вид дистареоизомер.
В литературата, свързана със синтезата на пептиди, обаче терминът „рацемизация” се използва по-широко по отношение на нежеланите промени в конфигурацията, които възникват по време на свързването или други етапи на синтеза.
Това разграничение е важно, тъй като идентичността на пептида не зависи само от това кои атоми се намират в молекулата.
Значението има и тяхното пространствено разпределение.
Не всяка остатъчна аминокиселина е свързана с такова същото стереохимично рисково състояние.
Например, глицинът не съдържа типичния хирален атом на въглерод алфа, който се среща в повечето аминокиселини.
Другите остатъци се различават по своята чувствителност към промени в конфигурацията в зависимост от структурата и средата на реакцията.
Натуралната маса може да бъде съпроводена от неправилна стереохимия
Пептидът епимеричен може да има точно същата молекулна маса като целевия пептид.
Ето защо наблюдението на очакваната маса с помощта на масовия спектрометър не доказва автоматично, че всяка остатъчна аминокиселина запазва желаната стереохимична конфигурация.
Хроматографските изследвания позволяваха отделянето на защитените епимерични пептиди и използването на тези отделни части за анализ на стереохимичните промени, свързани с химичната структура на свързването.
В зависимост от молекулата, подходящата стереохимична оценка може да изисква подходящи хроматографски методи, референтни съединения, стратегии за деривация или други аналитични методи, способни да различават значимите структури.
Индивидуални аналитични изследвания също така анализираха стереохимичните промени, протичащи по време на свързването на аминокиселините с неподвижни носители.
Това води до следващ важен извод: замърсяването, открито в готовия пептид, не трябва да произхожда от последната реакция на свързване.
Това може да е възникнало на по-ранен етап и да е останало присъстващо по време на следващите етапи на синтеза.
Образуването на аспартимид е отделен проблем
Образуването на аспартимид е специфичен път на странични реакции, свързан с податливите пептидни секвенции, съдържащи аспарагинин.
Процесът включва създаването на циклична междинна структура, от която могат да се образуват различни родствени структури.
Те могат да включват променени връзки в скелетната част на пептида и стереохимични варианти.
Поради това появата на аспартимид не трябва да се описва просто като друго наименование за непълно свързване.
Пептидният верига вече може да съдържа подходящите аминокиселинни остатъци, а последващата странична реакция може да промени част от структурата му.
Експерименталните изследвания показват, че този процес може да бъде повлиян от защитната стратегия, съседните остатъци и повтарящите се условия, свързани с отстраняването на защитните групи.
Това разграничение е особено важно при интерпретирането на проблемите, възникващи при синтеза.
Само повторното свързване или добавянето на по-голямо количество свързващо вещество не ще поправи автоматично замърсяването, което е възникнало в резултат на напълно различен химичен път.
Непълните реакции водят до други видове проблеми
Непълното свързване създава отделна категория замърсители.
Ако един верижен протеин, свързан с протеин, не получи планирания аминнокиселинен остатък, но реагира правилно по време на следващия цикъл, образуваният пептид може да бъде лишен от този остатък.
Такава молекула обикновено се определя като делеционна последователност.
Други вериги могат да спрат да се удължават и да останат съкратени.
Тези продукти се различават основно от ептимерите.
Епимерът може да има правилна аминокиселинна последователност и обобщен модел, но неправилна стереохимия на едно от центровете.
Пептидът делециен, от друга страна, има друга последователност или дължина.
Някои стратегии за синтез използват така нареченото capping, за да не се позволи продължаващо удължаване на определени нереактивни вериги.
Но капчирането не поправя неправилното верижно тяло и не го превръща в целевия пептид.
Това променя само поведението му през следващите етапи.
Сорбената смес, получена при синтезата, може следователно да съдържа продукти, получени в резултат на няколко различни механизма.
Една обща стойност на ефективността не позволява да се определи кои механизми на образуване на замърсявания са отговорни за крайния резултат.
Температурата и условията на процеса оказват влияние върху компромиса между скоростта и качеството.
Повишаването на температурата или други начини за ускоряване на синтеза могат да увеличат скоростта на желаните реакции.
В същото време обаче те могат да ускорят нежеланите реакции.
Проучванията на SPPS с помощта на микроволнови лъчи анализираха рацемизирането и образуването на аспартимид в моделирани системи и показаха зависимост на оста на типа от използваните условия.
Това не означава, че отоплението по природа е неправилно за синтеза на пептиди.
Това също така не означава, че по-ниската температура винаги е по-добра.
Най-важната принципа гласи: скоростта на процеса и химичната чистота трябва да се оценяват едновременно.
По-високата температура, по-дългото излагане или многократното обработване могат да повлияят както на желаното образуване на връзките, така и на конкурентните реакции.
Поради това подходящият компромис трябва да бъде оценен експериментално за конкретната последователност.
Модификациите на крайния продукт могат да възникнат и след завършването на самия процес на свързване.
Проучванията, сравняващи различните средства за отстраняване на пептида от целулозата, показват различни профили на замърсяването.
Това напомня, че крайното замърсяване не трябва автоматично да се свързва с реакцията на свързване.
Синтезата на пептида е многостепенен процес, а последващото разцепване, откъсване и по-нататъшна обработка могат да променят материала, който по-рано е бил построен правилно.
Как се оценява ефективността на свързването?
Тестовете, проведени по време на процеса, отговарят само на определени въпроси.
По време на синтеза на постоянна фаза, тестовият тест за откриване на останалите налични аминогрупи може да помогне за оценка дали етапът на ацилиране не е завършил напълно.
Такива тестове могат да бъдат много полезни.
Тяхната интерпретация обаче трябва да се ограничи до химическия въпрос, на който действително отговаря прилаганата методология.
В зависимост от аналитичната методология и вида на аминокиселината, тестовете, базирани на промяна в цвета, могат да реагират по различен начин при взаимодействие с различни амини.
Важно е също така наличието на мястото, в което се провежда изпитът.
Реактивната аминогрупа, до която тестовият реагент няма физически достъп, не е същата като аминогрупата, която успешно е преминала реакцията на свързване — дори ако даден тест не може да различи ясно тези ситуации.
Ограниченията могат да включват наличието на реактивен център, чувствителността на теста, химичните интерференции и вида на откриваната функционална група.
Негативният резултат от теста, проведен по време на процеса, не трябва автоматично да се тълкува като доказателство, че целия пептид има правилна последователност, стереохимия и чистота.
Мониторингът на процеса е най-ценен, когато резултатите от него могат по-късно да бъдат съпоставени с анализа на реалния пептиден продукт.
Хроматографията разделя, а спектрометрията на масите помага да се характеризират съставните елементи.
Хроматографията и масовата спектроскопия предоставят допълващи се данни.
Хроматографията може да раздели съставките на пробата и да покаже наличието на повече от един откриваем компонент.
Масометрията може да предоставя информация за масовия размер на молекулата, като помага при характеризирането или определянето на отделните компоненти.
Изследванията, които съчетават и двете техники, позволяваха да се анализират суровите продукти на синтеза на пептиди на стайната фаза и да се получат информация относно тяхната идентичност и степента на отстраняване на защитните групи.
Комбинацията на двете методи обикновено предоставя повече информация, отколкото предположението, че всеки хроматографски пик вече е идентифициран или че всяка открита маса отговаря на чиста и структурно пълна фракция.
Но все пак има ограничения.
Различните компоненти могат да съвместно селективират, т.е. да не бъдат напълно разделени хроматографски.
Индивидуалните вещества също могат да предизвикат различен отговор на детекторите.
Структурните изомери и стереоизомерите могат да изискват използването на допълнителни аналитични методи.
По същата причина самото твърдение, че пептидът е бил изследван по метода HPLC, не означава автоматично, че всички значими замърсители са били разграничени.
Ползата от конкретния метод на HPLC зависи от действително полученото разделение и от аналитичното въпросно, на което трябва да отговори.
Трябва да се обясни как е изчислен резултатът
Процентната стойност, посочена по отношение на свързването на пептидите, може да означава няколко съвсем различни неща.
Това може да се отнася до конверсията на изходния материал, относителната повърхност на хроматографския пик, измерената съдържание на целевия продукт, ефективността на суровината или ефективността на изолираната продукция.
Поставянето на самата цифра без уточняване на предмета, може следователно да създаде подвеждащ образ на голяма прецизност.
Търпеливите сравнения трябва да определят субстрата, анализирания етап на свързване, използваната аналитична методология, момента на вземане на пробата и видовете разглеждани замърсители.
Ако е била използвана повторна комбинация, това също трябва да бъде взето под внимание.
Краен резултат след две операции за свързване не трябва да отразява това, което се е случило по време на първата реакция.
Същата предпазливост се изисква и по отношение на границите на откриваемост на аналитичните методи.
Резултатът „не е открит” означава, че дадена субстанция не е открита при определени условия и при ограниченията на използваната методология.
Това не би трябвало автоматично да се превръща в абсолютно твърдение, че данните за замърсяването изобщо не съществуват.
Данните за активатора трябва да обхващат повече от обикновен модел.
Специфичният свързващ агент, който работи изключително добре при простата моделна реакция, може да се държи по различен начин при аминокиселина с голямо стереохимично натоварване, чувствително стереохимично център, слабо разтворим субстрат или пептиден верига, податлив на агрегация.
Проучванията, сравняващи Oxyma-B с няколко модела пептиди, показват защо оценката на химичната свързаност с повече от един субстрат е важна.
В крайна сметка, полезната методология за свързване трябва да води до получаване на желаната структура с приемлив профил на замърсяванията и повторяем резултат при целенасоченото синтезиране.
Ето защо ефективността на свързването може по-добре да се разбира като сбор от различни измервания, отколкото като свойство, описано с названието на отделен ензим или като резултат от един тест за изчезване на субстрата.
Често задавани въпроси
1. Защо при синтезата на пептиди се използват защитни групи?
Охранителните групи временно ограничават нежеланите реакции, така че подходящите функционални групи могат да извършат планираното пептидно свързване. Аминокиселините могат да съдържат няколко реактивни места и оставянето на всички тях едновременно достъпни може да доведе до конкурентни реакции. Ефективната стратегия за защита също трябва да взема предвид възможността за по-нататъшно отстраняване на защитите и тяхната съвместимост с останалата част от молекулата. Моделите показват, че изборът на охранителни групи може да повлияе не само върху основната селективност на реакцията, но и върху образуването на странични продукти. Следователно охранителната група е един от елементите на цялата стратегия за синтез, а не универсално решение на всички химически проблеми.
2. Може ли правилното свързване да продължи да води до образуването на замърсявания?
Да. Целевото свързване с пептиди може да възникне, докато други частици в същата смес не се преобразуват напълно или нежелани странични реакции възникват. Това особено добре се вижда при изследванията на епимерните продукти, тъй като създаването на правилното свързване и запазването на правилната стереохимия са отделни процеси. Следователно откриването на целевия пептид не означава, че той е единственият присъстващ продукт. Научно обоснованото оценяване на успеха на свързването изисква дефиниран краен момент на анализа и информация относно значимите примеси.
3. Едно ли е свързването на пептидите с цялата синтеза на пептид?
Не. Сортирането е отделна операция за създаване на връзка в рамките на много по-широк процес на синтеза. Синтезата на постоянна фаза може да включва също така свързване към носител, защита, отстраняване на защитни групи, многократно промиване, откъсване, обработка, почистване и крайна характеристика. Тъй като нежелани продукти могат да се образуват и извън етапа на свързване, крайното замърсяване не трябва автоматично да се приписва на неправилно свързване без данни, които да сочат за неговото реално произход.
4. Защо карбоксилната група се активира?
Активирането на карбоксилната група създава по-благоприятна пътека за нейното реакция с подходяща аминогрупа, улеснявайки по този начин образуването на амидни връзки. Увеличената реактивност обаче може да позволи и конкурентни реакции. Поради това при оценяването на свързващите системи се анализират не само ефективността на образуването на връзка, но и стереохимичните ефекти и образуването на странични продукти. Целта на активацията не е максимално увеличаване на реактивността на молекулата, а постигане на подходяща селективност на реакцията.
5. Какво служи HATU?
HATU е свързващо вещество, използвано за улесняване на образуването на амидни връзки, включително при свързването на пептиди. Не е пептид и не съдържа защитна група. Сравнителни изследвания на трудни пептидни последователности показват, че методите, използващи HATU, трябва да се оценяват в пълния контекст на условията на реакцията. Самото съобщение, че се използва HATU, не потвърждава пълното преобразуване, запазването на стереохимията и по-добрия профил на замърсяванията.
6. Има ли единствен най-добър реагент за свързване на пептиди?
Не. Не съществува универсален рейтинг на реагентите, подходящи за всеки пептид и реакция. Натоварването с кислород, разтворимостта на субстрата, агрегацията, стереохимичната чувствителност и контекстът на последователността могат да повлияят на резултата. Изборът на реагент трябва да се основава на измерените резултати за конкретна реакция, а не само на неговата репутация или популярност.
7. Азбуката „композиционен агент” и „добавка” означават ли едно и също нещо?
Не. Тези определения могат да описват различни функции в системата на свързване. Активенният агент може директно да участва в активацията, докато добавката може да повлияе върху образуването на междинни продукти, ефективността на реакцията, стереохимичната цялостност или конкурентните химични пътеки. Поради това е необходимо да се анализира целия реакционен процес, а не да се разглеждат всички негови компоненти като взаимозаменяеми заместители.
8. Може ли да се свържат цели фрагменти на пептиди вместо отделни аминокиселини?
Да. Реакцията на свързване може да свързва по-големи защитени пептидни фрагменти, а не само отделни аминокиселини. Увеличаването на размера на свързаните компоненти обаче не премахва необходимостта от контрол върху избирателността на мястото на реакцията, стереохимията и крайната характеристика на продукта. При свързването на фрагментите все още са необходими данни, потвърждаващи, че правилното свързване действително е настъпило правилно.
9. Каква е разликата между рацезимацията и епимеризацията?
Рацемизацията в строго преносен смисъл означава загуба на енанцеморичното обогатяване в посока на смес от рацемични съединения, докато епимеризацията означава промяна в конфигурацията на едно стереоцентър в молекула, съдържаща много такива центрове. В литературата, свързана със синтезата на пептиди, терминът „рацемизация“ често се използва по-широко, за да опише нежелани промени в конфигурацията на аминокиселинните остатъци. Точното определение следователно трябва да отговаря на реалната структурна промяна.
10. Може ли спектрометрията на масите да открие всеки стереохимичен грешка?
Не. Стериоизомерите могат да имат точно същата молекулна маса. Следователно получаването на очакваната маса не потвърждава правилното конфигурация на всеки стереоцентър. За оценка на тези разлики може да са необходими допълнителни методи, например подходящи хроматографски техники или стратегии за деривация. Масометрията остава изключително полезно средство за характеризиране на молекулите, но резултатите от нея трябва да се интерпретират в съответствие с ограниченията на конкретното структурно въпросно.
11. Значи ли появата на аспартимид просто неуспешно свързване?
Не. Образуването на аспартимид е отделен път на странични реакции, свързан с податливи последователности, съдържащи аспарагинин. На неговото появяване могат да влияят съседни остатъци и условията, свързани с отстраняването на защитните групи. Поради това нежеланата структурна промяна може да възникне дори когато съответният аминносин остава правилно свързан с предшественика си. Определянето на произхода на замърсяването е важно, тъй като повторното свързване не трябва да реши проблема, произтичащ от напълно различен път на реакция.
12. Доверява ли се повторното свързване към успеха на реакцията?
Не. Повторното свързване може в някои случаи да подобри конверсията, но не гарантира, че всички активни места ще станат достъпни или че други странични реакции ще бъдат елиминирани. Резултатът все още зависи от субстрата и използваната методология. Следователно анализът на продукта е необходим, за да се установи какво действително е довело до допълнително свързване.
13. Поправя ли по-високата температура винаги качеството на сцеплението?
Не. Повишаването на температурата може да ускори желаната реакция, но също така може да ускори и нежелани химични процеси. Поради това по-бързото преобразуване не трябва автоматично да се тълкува като подобрение на химичната чистота. Температурата трябва да се оценява както по отношение на получаването на целевия продукт, така и по отношение на профила на образуваните замърсители.
14. Доказва ли отпадането на свободната аминогрупа появата на правилен пептид?
Не. Отсъствието на откриваема свободна аминогрупа отговаря на много по-ограничено въпросно за определена функционална група при условията на прилагания тест. Нетогавава самостоятелно пълната последователност на пептида, нейната стереохимия и чистота. Мониторингът на свободните аминогрупи може да бъде полезен елемент при контрола на процеса, но не замества окончателната характеристика на продукта.
15. Ефективността на свързването с HPLC е същата като чистотата на HC?
Не. Чистотата на HPLC и ефективността се описват с различни характеристики. Чистотата на HPLC зависи от метода за определяне на състава на откриваните компоненти в пробата, докато ефективността се отнася до количеството на определения продукт, получен спрямо определеното количество начално вещество. Пречистването може да увеличи хроматографската чистота, като същевременно намали количеството на получения крайния продукт. Поради тази причина процентната стойност е с ограничена значимост, ако не е точно определено какво представлява това.
16. Могат ли замърсяванията да възникнат и след завършване на свързването?
Да. След завършването на свързващата реакция синтезата на пептида включва следващи химически етапи. Премахването на защитните групи, отделянето и последващата обработка могат да модифицират молекулата или да доведат до образуването на допълнителни замърсители. Това не означава, че всяко окончателно замърсяване възниква в по-късните етапи, а показва защо правилното свързване не е гаранция за качеството на крайния продукт.
17. Какво прави сравнението на методите за свързване достоверно?
Достоверното сравнение трябва да оценява алтернативни методи за постигане на същата ясно определена цел и при достатъчно сравними условия. Трябва да се посочват използваните субстрати, етапът на вземане на пробата, аналитичните методи и оценяваният вид замърсявания, вместо да се представя необяснена процентна стойност или да се базира на репутацията на активатора. Сравненията, обхващащи няколко различни моделни пептиди, могат да предоставят повече информация от еднократното високо ефективно постигане на резултати при лесен субстрат, тъй като показват как ефективността се променя в зависимост от молекулярния контекст. Даже и тогава заключенията трябва да бъдат ограничени до действително изследваните химични системи.
Резюме
Сортирането на пептидите е основен компонент на химичната синтеза на пептидите, тъй като води до образуването на амидно свързване, което свързва останалите аминокиселини в пептидния скелет. Описването на свързването само като „свързване на два аминокиселина” пропуска обаче значителна част от химията, която определя дали получения продукт действително е желаният пептид.
Компонентът, съдържащ карбоксилна група, обикновено се нуждае от активация, за да може ефективното образуване на амидния свързване да протича правилно. Специфичните свързващи вещества и добавките могат да улеснят този процес, но тяхната ефективност зависи от субстрата, средата на реакцията и начина на аналитична оценка на резултата. Поради това активната субстанция трябва да се анализира в пълния експериментален контекст и не трябва да се класифицира независимо от синтезирания пептид.
Охранителните групи осигуряват допълнителен слой контрол чрез временно възпрепятстване на нежеланите функционални групи да участват в реакцията. Нейната полезност зависи не само от ефективното защитно действие, но и от възможността за селективно отстраняване и съответствие с следващите етапи на синтеза. Стратегията за защита и съседните остатъчни аминокиселини също могат да повлияят на образуването на определени странични продукти.
Стереохимичната цялост е друг важен елемент. Реакцията на свързване може да доведе до образуването на амидно свързване, като същевременно генерира епимерен материал. Тъй като епимерът може да има същата молекулна маса като съответния пептид, самата съвместимост на масите не потвърждава пълната структурна точност. Промени в конфигурацията също могат да възникнат на други етапи, като например първоначалното свързване на аминокиселината с фиксираната фаза.
Други замърсявания се получават чрез различни механизми. Непълното свързване може да доведе до образуване на делеционни или съкратени последователности, докато реакциите, свързани с аспартимид, могат да модифицират пептид, който вече съдържа подходящите аминокиселинни остатъци. Ускоряването на процеса може да повлияе както на желаните реакции, така и на страничните пътеки, а допълнителните замърсявания също могат да се образуват и по-късни етапи, като например отцепването.
Поради тези причини оценката на свързването на пептидите изисква нещо повече от установяване дали изходният материал е изчезнал.
Конверсията, създаването на целевия продукт, ефективността при изолиране, хроматографската чистота и стереохимичната чистота отговарят на различни въпроси.
Тестовете, извършвани по време на синтеза, могат да помогнат за откриването на непълни реакции, но не потвърждават самостоятелно пълната структура на пептида. Кроматометрията и масовата спектроскопия предоставят допълнителна информация, докато въпросите относно стереохимията или много сходните структури може да изискват допълнителни аналитични методи.
Най-обоснованият подход към свързването на пептиди е следователно насочен към конкретна молекула и основан на данните.
Полезният метод на свързване не е просто метод, който използва най-известния или най-реактивния реагент. Това е метод, който постоянен процес води до образуването на целенасочено молекулярно свързване, като същевременно се запазва подходящата стереохимия и се контролират значимите замърсители за конкретния синтезиран пептид.
Препратки
- Суирос-Фуносас, Р., Проенс, Р., Бабрас, Р., Ел-Фахам, А., и Алберико, Ф. (2009). Оксима: ефективна добавка за пептидна синтеза, която замества HOBt и HOAt, базирани на бензотриазола, с по-нисък риск от експлозия. Химия — Европейски журнал, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Миязава, Т., Отомацу, Т., Ямада, Т. и Кувата, С. (1992). Изследвания на рацемирацията при пептидната синтеза чрез отделяне на защитени епимерични пептиди чрез обратна флуктуационна високоефективна течна хроматография. Международен журнал за пептидни и протеинови изследвания, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Оценка на комбинираното използване на Oxyma и HATU при агрегиране на пептидни последователности. Журнал за пептидна наука, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, отличен потискател на рацемирането при пептидната синтеза. Биомедицинска химия и биомолекулярна химия, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Синтез на пептиди на твърда фаза: От стандартни процедури до синтеза на трудни последователности. Природопротоколи, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Мерглер, М., Дик, Ф., Сакс, Б., Вайлер, П. и Вохер, Т. (2003). Проблемът с аспартимида в SPPS, базиран на Fmoc. Част I. Журналът за пептидна наука, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Мерглер, М., Дик, Ф., Сакс, Б., Стахелин, К., и Ворхер, Т. (2003). Проблемът с аспартимида в SPPS, базиран на Fmoc. Част II. Журналът за пептидна наука, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Адамсън, Дж. Г., Хоанг, Т., Кривичи, А., и Лажой, Г. А. (1992). Използване на реагент на Марфи за количествено определяне на рацемирането при свързването на аминокиселини към твърди носители за пептидна синтеза. Аналитична биохимия, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Паласек, С. А., Кокс, З. Дж. и Колинс, Дж. М. (2007). Ограничаване на рацемизацията и образуването на аспартимид при синтеза на пептиди в твърда фаза по метода Fmoc, подсилен с микровълнова енергия. Списание „Journal of Peptide Science“, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-бензендемитаноил (1,4-BDMT) като отстраняващ агент при разцепванията на зелени пептидни смоли. RSC напредва, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- Маккелоп, К., Дейвидсън, У., Хансен, Г., Фрийман, Д. и Палай, П. (1991). Описанието на суровите продукти от пептидната синтеза на твърда фаза чрез масспектрометрия с му-HPLC/бърз атомен взрив. Пептидни изследвания, 4(1), 40–46. PubMed