Sprzęganie peptydów to proces chemiczny prowadzący do utworzenia wiązania pomiędzy składnikiem zawierającym grupę karboksylową a składnikiem zawierającym grupę aminową. W wyniku tej reakcji powstaje wiązanie amidowe. Gdy takie wiązanie łączy reszty aminokwasowe podczas syntezy peptydu, staje się częścią tego, co określa się jako szkielet peptydowy.
Reagującymi składnikami nie muszą być pojedyncze aminokwasy. Reakcja sprzęgania może połączyć jeden aminokwas z drugim, przyłączyć kolejny aminokwas do rosnącego łańcucha peptydowego albo połączyć większe fragmenty peptydów, które wcześniej zostały zsyntetyzowane oddzielnie.
Na pierwszy rzut oka sprzęganie peptydów może wydawać się prostym zadaniem: wystarczy połączyć jeden aminokwas z następnym.
Z chemicznego punktu widzenia utworzenie wiązania amidowego jest jednak tylko częścią całego celu.
Połączenie musi powstać we właściwym miejscu i z zachowaniem odpowiedniej konfiguracji stereochemicznej, podczas gdy inne reaktywne grupy funkcyjne muszą pozostawać odpowiednio kontrolowane. Reakcja może pozornie przebiec pomyślnie i zużyć większość lub nawet cały materiał wyjściowy, a mimo to doprowadzić do powstania niepożądanej mieszaniny docelowego peptydu i innych struktur.
Dlatego zakończenie reakcji i prawidłowe powstanie produktu nie oznaczają tego samego.
Badania porównujące różne systemy sprzęgania, strategie zabezpieczania grup funkcyjnych oraz wyniki stereochemiczne pokazują, dlaczego nie istnieje jeden uniwersalnie najlepszy odczynnik sprzęgający, niezależny od rodzaju syntetyzowanego peptydu.
Z naukowego punktu widzenia bardziej użyteczne pytanie nie brzmi więc:
„Który odczynnik sprzęgający jest najlepszy?”
Lepsze pytanie brzmi:
„Które podejście pozwala uzyskać zamierzony peptyd z odpowiednią konwersją, zachowaniem integralności stereochemicznej i właściwą kontrolą zanieczyszczeń w warunkach odpowiednich dla konkretnej cząsteczki?”
To rozróżnienie ma podstawowe znaczenie dla zrozumienia chemii sprzęgania peptydów.
Co oznacza sprzęganie peptydów?
Sprzęganie łączy dwa składniki poprzez utworzenie nowego wiązania
W typowej reakcji prowadzącej do powstania szkieletu peptydowego grupa karboksylowa związana z jedną resztą aminokwasową zostaje połączona z grupą aminową drugiej reszty.
Powstające połączenie jest chemicznie wiązaniem amidowym.
Jeżeli takie wiązanie łączy reszty aminokwasowe w łańcuchu peptydowym, powszechnie określa się je jako wiązanie peptydowe.
Dokładne fizyczne rozmieszczenie reagujących składników zależy od zastosowanej strategii syntezy.
Podczas syntezy peptydów na fazie stałej odsłonięta grupa aminowa zazwyczaj należy do rosnącego łańcucha peptydowego przyłączonego do żywicy, natomiast składnik zawierający grupę karboksylową pochodzi z wprowadzanego zabezpieczonego aminokwasu.
W syntezie prowadzonej w roztworze oba składniki mogą natomiast znajdować się w fazie ciekłej.
W przypadku sprzęgania fragmentów łączy się większe, zabezpieczone segmenty peptydowe, zamiast dodawać pojedyncze reszty aminokwasowe jedna po drugiej.
Różne strategie zmieniają sposób prowadzenia reakcji, rozdzielania materiałów i ich oczyszczania, ale nie eliminują podstawowego problemu chemicznego: właściwe grupy funkcyjne muszą ze sobą zareagować, podczas gdy niepożądane reakcje w innych częściach cząsteczki powinny pozostać odpowiednio ograniczone.
Powstanie wiązania, konwersja i wydajność to różne pojęcia
Kilka terminów często stosowanych przy opisywaniu sprzęgania peptydów może brzmieć podobnie, mimo że odnoszą się do różnych zagadnień.
Konwersja określa, jaka część danego materiału wyjściowego uległa reakcji.
Nie mówi jednak automatycznie, w co ten materiał się przekształcił.
Jeżeli 99% materiału wyjściowego zniknie, ale część z niego utworzy niepożądane produkty uboczne, 99-procentowa konwersja nie oznacza, że powstało 99% zamierzonego peptydu.
Powstanie produktu docelowego odpowiada na inne pytanie: jaka ilość zamierzonej struktury molekularnej rzeczywiście została utworzona? Odpowiedź wymaga metody analitycznej pozwalającej odróżnić właściwy produkt od istotnych struktur alternatywnych.
Wydajność izolowana opisuje ilość określonego produktu, którą ostatecznie udało się odzyskać w odniesieniu do zdefiniowanej ilości materiału początkowego. Na końcową wydajność mogą więc wpływać również etapy obróbki, rozdzielania i oczyszczania, nawet jeżeli samo sprzęganie przebiegało efektywnie.
Czystość chromatograficzna opisuje rozkład składników wykrywanych w warunkach określonej metody chromatograficznej. Może dostarczać bardzo cennych informacji o składzie próbki, ale jej interpretację mogą ograniczać współelucja, różnice w odpowiedzi detektora czy obecność składników słabo wykrywanych przez daną metodę.
Czystość stereochemiczna odpowiada natomiast na pytanie, czy zachowana została zamierzona konfiguracja przestrzenna cząsteczki. Jest to odrębne zagadnienie analityczne, ponieważ niektóre warianty stereochemiczne mogą mieć dokładnie taką samą masę cząsteczkową jak produkt docelowy.
Te różnice pomagają zrozumieć wyniki, które na pierwszy rzut oka mogą wydawać się sprzeczne.
Reakcja może wykazywać wysoką konwersję materiału wyjściowego, a jednocześnie prowadzić do powstania kilku produktów. Surowy preparat może mieć dużą odzyskaną masę, ale zawierać znaczną ilość zanieczyszczeń. Intensywne oczyszczanie może natomiast prowadzić do uzyskania materiału o wysokiej czystości kosztem niższej wydajności izolowanej.
Żadna z tych obserwacji nie jest sama w sobie sprzeczna z pozostałymi.
Opisują po prostu różne właściwości produktu lub różne etapy procesu.
Dlatego stwierdzenie „sprzęganie było kompletne” ma znacznie większą wartość, jeżeli wiadomo również, jakiej metody analitycznej użyto i co dokładnie zostało zmierzone.
Trudne substraty ujawniają różne ograniczenia procesu
Nie każda reakcja sprzęgania peptydów wiąże się z takim samym stopniem trudności chemicznej.
Silnie zatłoczone sterycznie miejsce reaktywne może spowalniać tworzenie wiązania, ponieważ reagujące grupy mają utrudniony dostęp do siebie.
Słaba rozpuszczalność może ograniczać efektywny kontakt pomiędzy składnikami reakcji.
W syntezie na fazie stałej rosnący łańcuch peptydowy może oddziaływać z sąsiednimi łańcuchami lub przyjmować struktury ograniczające dostęp do miejsc reaktywnych, nawet jeżeli odczynniki sprzęgające są obecne w pozornym nadmiarze.
Problemy te mają różne podłoże chemiczne.
Nie można więc zakładać, że jedno rozwiązanie będzie automatycznie skuteczne we wszystkich przypadkach.
Badania porównujące strategie powtarzanego sprzęgania dla trudnych sekwencji peptydowych analizowały rzeczywisty skład otrzymanych produktów surowych, zamiast opierać ocenę wyłącznie na teoretycznej reaktywności lub reputacji poszczególnych odczynników. Jedna z badanych strategii wypadła korzystnie w analizowanych modelach, ale nie oznacza to istnienia uniwersalnego rozwiązania odpowiedniego dla każdej sekwencji peptydowej.
Najważniejszy wniosek jest taki, że skuteczność metody należy oceniać na podstawie produktu otrzymanego z konkretnego substratu, a nie wyłącznie na podstawie reputacji użytego odczynnika.
Aktywacja grupy karboksylowej
Dlaczego aktywacja jest zazwyczaj potrzebna?
Samo zmieszanie niezmodyfikowanego kwasu karboksylowego z aminą w zwykłych warunkach zazwyczaj nie prowadzi wydajnie do powstania czystego wiązania peptydowego.
Zamiast tego mogą zachodzić oddziaływania kwas–zasada, a efektywne tworzenie wiązania amidowego wymaga odpowiedniej drogi chemicznej.
Dlatego sprzęganie peptydów zazwyczaj obejmuje aktywację składnika zawierającego grupę karboksylową.
Aktywacja zwiększa jego podatność na reakcję z odpowiednią grupą aminową. Właściwe środowisko reakcji oraz odpowiednia grupa odchodząca ułatwiają powstanie nowego wiązania amidowego.
Aktywowany produkt pośredni może istnieć jedynie przez krótki czas i nie musi być izolowany.
Celem nie jest jednak uzyskanie maksymalnej możliwej reaktywności chemicznej.
Celem jest reaktywność kontrolowana.
Aktywowany produkt pośredni, który bardzo szybko reaguje z wodą, innym niepożądanym nukleofilem albo uczestniczy w konkurencyjnej reakcji, może szybko zniknąć, a jednocześnie prowadzić do powstania stosunkowo niewielkiej ilości zamierzonego peptydu.
Wysoka reaktywność jest więc korzystna tylko wtedy, gdy można ją odpowiednio ukierunkować na powstanie zamierzonego wiązania.
Odczynniki sprzęgające i dodatki pełnią różne funkcje
W sprzęganiu peptydów może uczestniczyć kilka rodzajów składników chemicznych pełniących odmienne funkcje.
Karbodiimidy stanowią jedną z rodzin odczynników wykorzystywanych do aktywacji grup karboksylowych.
Inne systemy sprzęgające wykorzystują odmienne mechanizmy aktywacji, w tym często spotykane odczynniki typu oniowego, takie jak systemy oparte na HATU.
Dodatkowe związki mogą pełnić funkcję dodatków.
Określenie „dodatek” nie oznacza jednak, że dany związek jest chemicznie nieistotny. Dodatek może wpływać na produkty pośrednie, wydajność sprzęgania, konkurencyjne szlaki reakcji oraz wyniki stereochemiczne.
Badania nad Oxyma w syntezie peptydów z udziałem karbodiimidów analizowały zarówno efektywność sprzęgania, jak i ograniczanie racemizacji w wybranych modelach.
Takie dane są wartościowe dla badanych systemów i konkretnych modeli.
Nie oznaczają jednak, że zastosowanie tego samego związku w każdym możliwym sprzęganiu peptydów przyniesie identyczny rezultat.
Późniejsze badania Oxyma-B porównywały wyniki dotyczące czystości optycznej w kilku modelowych peptydach.
Badanie wielu substratów jest szczególnie istotne, ponieważ bardzo dobre wyniki w łatwym chemicznie sprzęganiu nie muszą przewidywać zachowania odczynnika w miejscu zatłoczonym sterycznie, podatnym na agregację lub wrażliwym stereochemicznie.
Co oznacza HATU w syntezie peptydów?
HATU jest odczynnikiem sprzęgającym wykorzystywanym do ułatwiania tworzenia wiązań amidowych, w tym podczas syntezy peptydów.
HATU nie jest peptydem.
Nie jest również grupą ochronną.
Sama jego obecność nie stanowi dowodu, że sprzęganie zostało zakończone ani że otrzymany peptyd jest czysty.
Skuteczność zależy od rodzaju substratu, pozostałych odczynników, systemu rozpuszczalników oraz szerszego kontekstu warunków reakcji.
Badania sekwencji podatnych na agregację porównywały między innymi podejścia oparte na HATU oraz systemach Oxyma/karbodiimid w warunkach powtarzanego sprzęgania.
Pokazuje to, dlaczego wyszukiwania takie jak „HATU peptide” należy rozumieć jako pytania dotyczące chemii sprzęgania i wyboru metody, a nie jako dowód, że jeden konkretny odczynnik stanowi uniwersalną metodę syntezy peptydów.
Sama nazwa odczynnika nie wystarcza do odtworzenia ani właściwej interpretacji opublikowanego wyniku.
Znaczenie mają również warunki reakcji, sekwencja peptydu oraz sposób analitycznego zdefiniowania powodzenia procesu.
Aktywacja i kontrola stereochemiczna wymagają zachowania równowagi
Dłuższe utrzymywanie aktywowanej pochodnej aminokwasu w układzie reakcyjnym nie zawsze jest korzystne.
Pożądana reakcja sprzęgania zachodzi obok innych możliwych procesów chemicznych.
Niektóre konkurencyjne szlaki mogą zmieniać stereochemię.
Badania eksperymentalne nad zabezpieczonymi produktami epimerycznymi analizowały wpływ kombinacji aminokwasów, rozpuszczalnika i innych składników reakcji na zmiany stereochemiczne zachodzące podczas sprzęgania z udziałem karbodiimidów.
Pokazuje to ważną zasadę: całe środowisko reakcji może być równie istotne jak ogólna rodzina zastosowanego odczynnika sprzęgającego.
Strategia sprzęgania musi więc zapewniać wystarczającą reaktywność do utworzenia pożądanego wiązania, jednocześnie ograniczając możliwość zachodzenia niepożądanych reakcji.
Zasady te można omawiać w celach edukacyjnych bez przekształcania ich w gotowy protokół laboratoryjny. Dokładne ilości odczynników, kolejność ich dodawania i warunki reakcji zależą od konkretnego opracowywanego procesu syntezy.
Rola grup ochronnych
Zabezpieczanie ogranicza konkurencyjne miejsca reakcji
Aminokwas może zawierać więcej grup reaktywnych niż tylko grupę aminową i karboksylową potrzebne do tworzenia szkieletu peptydowego.
Jego łańcuch boczny może zawierać dodatkowe reaktywne grupy chemiczne.
Gdyby wszystkie potencjalnie reaktywne grupy pozostawały odsłonięte podczas każdego etapu sprzęgania, zamierzone tworzenie wiązania peptydowego mogłoby konkurować z rozgałęzianiem lub innymi niepożądanymi reakcjami.
Strategia wykorzystująca grupy ochronne pozwala tymczasowo zamaskować wybrane miejsca reaktywne.
Dzięki temu odpowiednie grupy aminowa i karboksylowa mogą ze sobą reagować, podczas gdy inne miejsca pozostają niedostępne lub wystarczająco mało reaktywne w danych warunkach.
Zabezpieczanie zapewnia więc selektywność chemiczną.
Skuteczna strategia nie polega jednak wyłącznie na przyłączeniu stabilnej chemicznie grupy.
Grupę ochronną trzeba później również usunąć.
Zabezpieczenie, które skutecznie zapobiega niepożądanym reakcjom podczas sprzęgania, ale nie może później zostać usunięte bez uszkodzenia docelowej cząsteczki, tworzy kolejny problem syntetyczny.
Pełna strategia musi więc uwzględniać zarówno stabilność w okresie, w którym ochrona jest potrzebna, jak i możliwość selektywnego usunięcia zabezpieczenia, gdy przestaje być potrzebne.
Tymczasowe i długotrwałe zabezpieczenia pełnią różne funkcje
Poszczególne grupy ochronne mogą pozostawać na cząsteczce przez różny czas.
W typowej syntezie na fazie stałej wykorzystującej Fmoc zabezpieczenie końcowej grupy aminowej rosnącego łańcucha jest wielokrotnie usuwane w miarę wydłużania sekwencji.
Wiele grup ochronnych łańcuchów bocznych pozostaje natomiast obecnych przez liczne cykle sprzęgania i jest usuwanych dopiero na późniejszym etapie.
Standardowe metody oparte na Fmoc pokazują, w jaki sposób koordynowane są powtarzające się cykle selektywnego usuwania zabezpieczeń i sprzęgania.
Rodzaj ochrony potrzebnej dla konkretnego łańcucha bocznego zależy od reszty aminokwasowej, całego peptydu i wybranej strategii syntezy.
Nie byłoby więc prawidłowe stwierdzenie, że każdy aminokwas wymaga identycznego zabezpieczenia albo że wszystkie syntezy wykorzystują te same grupy ochronne.
Tymczasowe grupy ochronne należy również odróżniać od grup chemicznych, które celowo pozostają w gotowym peptydzie.
Zaplanowana modyfikacja N-końcowa albo amid na C-końcu mogą na przykład stanowić element docelowej struktury.
Natomiast tymczasowa grupa ochronna, która przypadkowo pozostała w końcowej cząsteczce, oznaczałaby niepożądaną różnicę strukturalną.
Ortogonalność jest wymogiem zgodności chemicznej
Ortogonalna ochrona oznacza strategię, w której wybrane grupy ochronne można usunąć, pozostawiając inne zabezpieczenia w wystarczającym stopniu nienaruszone.
Pozwala to odsłaniać różne miejsca reaktywne na celowo wybranych etapach syntezy.
Ortogonalności nie należy rozumieć po prostu jako właściwości pojedynczego odczynnika zapisanej na jego etykiecie.
Opisuje ona zgodność całej zaplanowanej sekwencji operacji chemicznych.
Zamierzone usunięcie zabezpieczenia powinno przebiegać bez powodowania niedopuszczalnych zmian w innych częściach rosnącego peptydu.
W syntezie na fazie stałej zgodność ta może również obejmować układ nośnik–łącznik oraz nietypowe lub szczególnie wrażliwe chemicznie bloki budulcowe.
Badania nad powstawaniem aspartimidu, w których modyfikowano zabezpieczenia łańcuchów bocznych i szkieletu w modelowym peptydzie, wykazały różnice w powstawaniu produktów ubocznych.
Pokazuje to, że wybór zabezpieczenia może wpływać nie tylko na wystąpienie oczywistej reakcji łańcucha bocznego.
Może również zmieniać inne szlaki powstawania zanieczyszczeń podczas syntezy.
Grupy ochronne nie sprawiają, że wszystkie sekwencje zachowują się tak samo
Nawet jeżeli dwie sekwencje zawierają ten sam potencjalnie problematyczny aminokwas, nie muszą zachowywać się identycznie.
Sąsiednie reszty mogą wpływać na prawdopodobieństwo wystąpienia konkurencyjnych reakcji.
Systematyczne badania modelowych sekwencji zawierających asparaginian wykazały, że aminokwas następujący po tej reszcie wpływał na powstawanie produktów związanych z aspartimidem w badanych warunkach.
Nie oznacza to, że każda sekwencja zawierająca taki motyw musi powodować problemy.
Pokazuje natomiast, że kontekst sekwencji powinien być uwzględniany podczas opracowywania metody i oceny ryzyka.
Strategia zabezpieczania, która sprawdziła się w jednym modelowym peptydzie, nie gwarantuje identycznego zachowania każdego innego peptydu zawierającego tę samą resztę.
Racemizacja i inne reakcje uboczne
Racemizacja i epimeryzacja dotyczą przestrzennego układu cząsteczki
Wiele reszt aminokwasowych zawiera centrum stereogeniczne.
Zmiana konfiguracji takiego centrum może prowadzić do powstania strukturalnie innej cząsteczki, nawet jeżeli jej skład pierwiastkowy i masa cząsteczkowa pozostają niezmienione.
Ściśle rzecz biorąc, racemizacja oznacza utratę wzbogacenia enancjomerycznego w kierunku mieszaniny racemicznej.
W peptydzie zawierającym wiele centrów stereogenicznych odwrócenie konfiguracji jednego konkretnego centrum prowadzi zazwyczaj do powstania epimeru, czyli rodzaju diastereoizomeru.
W literaturze dotyczącej syntezy peptydów termin „racemizacja” bywa jednak stosowany szerzej w odniesieniu do niepożądanych zmian konfiguracji zachodzących podczas sprzęgania lub innych etapów syntezy.
Rozróżnienie to jest istotne, ponieważ tożsamość peptydu nie zależy wyłącznie od tego, jakie atomy znajdują się w cząsteczce.
Znaczenie ma również ich przestrzenne rozmieszczenie.
Nie każda reszta aminokwasowa wiąże się z takim samym ryzykiem stereochemicznym.
Glicyna nie posiada na przykład typowego chiralnego atomu węgla alfa obecnego w większości aminokwasów.
Pozostałe reszty różnią się podatnością na zmiany konfiguracji w zależności od swojej struktury i środowiska reakcji.
Prawidłowej masie może towarzyszyć nieprawidłowa stereochemia
Peptyd epimeryczny może mieć dokładnie taką samą masę cząsteczkową jak peptyd docelowy.
Dlatego zaobserwowanie oczekiwanej masy za pomocą spektrometrii mas nie dowodzi automatycznie, że każda reszta aminokwasowa zachowała zamierzoną konfigurację stereochemiczną.
Badania chromatograficzne umożliwiały rozdzielanie zabezpieczonych peptydów epimerycznych i wykorzystywanie tych rozdziałów do analizy zmian stereochemicznych związanych z chemią sprzęgania.
W zależności od cząsteczki odpowiednia ocena stereochemiczna może wymagać właściwych metod chromatograficznych, związków odniesienia, strategii derywatyzacji lub innych metod analitycznych zdolnych rozróżniać istotne struktury.
Osobne badania analityczne analizowały również zmiany stereochemiczne zachodzące podczas przyłączania aminokwasów do nośników stałych.
Prowadzi to do kolejnego ważnego wniosku: zanieczyszczenie wykryte w gotowym peptydzie nie musi pochodzić z ostatniej reakcji sprzęgania.
Mogło powstać na wcześniejszym etapie i pozostać obecne podczas kolejnych etapów syntezy.
Powstawanie aspartimidu jest odrębnym problemem
Powstawanie aspartimidu jest specyficznym szlakiem reakcji ubocznej związanym z podatnymi sekwencjami peptydowymi zawierającymi asparaginian.
Proces obejmuje utworzenie cyklicznego produktu pośredniego, z którego mogą następnie powstawać różne pokrewne struktury.
Mogą one obejmować zmienione połączenia w szkielecie peptydu oraz warianty stereochemiczne.
Powstawania aspartimidu nie należy więc opisywać po prostu jako innej nazwy niepełnego sprzęgania.
Łańcuch peptydowy może już zawierać właściwe reszty aminokwasowe, a późniejsza reakcja uboczna może zmodyfikować część jego struktury.
Badania eksperymentalne pokazują, że na ten proces mogą wpływać strategia zabezpieczania, sąsiednie reszty oraz powtarzające się warunki związane z usuwaniem grup ochronnych.
Rozróżnienie to jest szczególnie ważne podczas interpretowania problemów występujących w syntezie.
Samo powtórzenie sprzęgania albo dodanie większej ilości odczynnika sprzęgającego nie naprawi automatycznie zanieczyszczenia, które powstało na skutek zupełnie innego szlaku chemicznego.
Niepełne reakcje prowadzą do innego rodzaju problemów
Niepełne sprzęganie tworzy odrębną kategorię zanieczyszczeń.
Jeżeli jeden łańcuch związany z żywicą nie otrzyma zaplanowanego aminokwasu, ale zareaguje prawidłowo podczas późniejszego cyklu, powstały peptyd może być pozbawiony tej reszty.
Taką cząsteczkę określa się zwykle jako sekwencję delecyjną.
Inne łańcuchy mogą przestać się wydłużać i pozostać skrócone.
Produkty te zasadniczo różnią się od epimerów.
Epimer może mieć prawidłową sekwencję aminokwasową i wzór sumaryczny, ale nieprawidłową stereochemię jednego centrum.
Peptyd delecyjny ma natomiast inną sekwencję lub długość.
Niektóre strategie syntezy wykorzystują tzw. capping, aby uniemożliwić dalsze wydłużanie określonych nieprzereagowanych łańcuchów.
Capping nie naprawia jednak nieprawidłowego łańcucha i nie przekształca go w docelowy peptyd.
Zmienia jedynie jego zachowanie podczas kolejnych etapów.
Surowa mieszanina uzyskana podczas syntezy może więc zawierać produkty powstające w wyniku kilku różnych mechanizmów.
Jedna zbiorcza wartość wydajności nie pozwala określić, które mechanizmy powstawania zanieczyszczeń odpowiadały za końcowy wynik.
Temperatura i warunki procesu wpływają na kompromis między szybkością a jakością
Podwyższenie temperatury lub inne sposoby przyspieszenia syntezy mogą zwiększyć szybkość pożądanych reakcji.
Jednocześnie mogą jednak przyspieszyć reakcje niepożądane.
Badania SPPS wspomaganej mikrofalami analizowały racemizację oraz powstawanie aspartimidu w układach modelowych i wykazały zależną od rodzaju reszty wrażliwość w zastosowanych warunkach.
Nie oznacza to, że ogrzewanie jest z natury niewłaściwe w syntezie peptydów.
Nie oznacza również, że niższa temperatura zawsze jest lepsza.
Najważniejsza zasada brzmi: szybkość procesu i jakość chemiczną należy oceniać jednocześnie.
Wyższa temperatura, dłuższa ekspozycja lub wielokrotne przetwarzanie mogą wpływać zarówno na pożądane tworzenie wiązań, jak i na reakcje konkurencyjne.
Odpowiedni kompromis powinien więc zostać oceniony eksperymentalnie dla konkretnej sekwencji.
Modyfikacje produktu końcowego mogą również zachodzić już po zakończeniu samego sprzęgania.
Badania porównujące różne scavengery podczas odszczepiania peptydu z żywicy wykazały odmienne profile zanieczyszczeń.
Przypomina to, że końcowego zanieczyszczenia nie należy automatycznie przypisywać reakcji sprzęgania.
Synteza peptydu jest procesem wieloetapowym, a późniejsze odbezpieczanie, odszczepianie i dalsza obróbka mogą zmienić materiał, który wcześniej został zbudowany prawidłowo.
Jak ocenia się efektywność sprzęgania?
Testy wykonywane podczas procesu odpowiadają tylko na określone pytania
Podczas syntezy na fazie stałej test wykrywający pozostałe dostępne grupy aminowe może pomóc ocenić, czy etap acylacji mógł przebiec niecałkowicie.
Takie testy mogą być bardzo użyteczne.
Ich interpretacja powinna jednak ograniczać się do pytania chemicznego, na które rzeczywiście odpowiada zastosowana metoda.
W zależności od metody analitycznej i rodzaju aminokwasu testy oparte na zmianie barwy mogą reagować w różny sposób na różne aminy.
Znaczenie ma również dostępność badanego miejsca.
Reaktywna grupa aminowa, do której odczynnik testowy ma fizycznie utrudniony dostęp, nie jest tym samym co grupa aminowa, która prawidłowo przeszła reakcję sprzęgania — nawet jeżeli dany test nie potrafi jednoznacznie rozróżnić tych sytuacji.
Ograniczenia mogą więc obejmować dostępność miejsca reaktywnego, czułość testu, interferencje chemiczne oraz rodzaj wykrywanej grupy funkcyjnej.
Negatywnego wyniku testu prowadzonego podczas procesu nie należy automatycznie interpretować jako dowodu, że cały peptyd posiada prawidłową sekwencję, stereochemię i czystość.
Monitorowanie procesu jest najbardziej wartościowe wtedy, gdy jego wyniki można później zestawić z analizą rzeczywistego produktu peptydowego.
Chromatografia rozdziela, a spektrometria mas pomaga charakteryzować składniki
Chromatografia i spektrometria mas dostarczają uzupełniających się informacji.
Chromatografia może rozdzielać składniki próbki i wykazywać obecność więcej niż jednego wykrywalnego składnika.
Spektrometria mas może dostarczać informacji o masie cząsteczkowej, pomagając w charakterystyce lub przypisaniu poszczególnych składników.
Badania łączące obie techniki pozwalały analizować surowe produkty syntezy peptydów na fazie stałej i uzyskiwać informacje dotyczące ich tożsamości oraz stopnia usunięcia grup ochronnych.
Połączenie obu metod dostarcza zazwyczaj więcej informacji niż założenie, że każdy pik chromatograficzny został już zidentyfikowany albo że każda wykryta masa odpowiada czystej i strukturalnie kompletnej frakcji.
Nadal istnieją jednak ograniczenia.
Różne składniki mogą współeluować, czyli nie zostać całkowicie rozdzielone chromatograficznie.
Poszczególne substancje mogą również powodować różną odpowiedź detektora.
Izomery strukturalne i stereoizomery mogą wymagać zastosowania dodatkowych metod analitycznych.
Z tego samego powodu samo stwierdzenie, że peptyd został przebadany metodą HPLC, nie oznacza automatycznie, że rozdzielono wszystkie istotne zanieczyszczenia.
Przydatność konkretnej metody HPLC zależy od rzeczywiście uzyskanego rozdziału oraz od pytania analitycznego, na które ma odpowiedzieć.
Należy wyjaśniać, w jaki sposób obliczono wynik
Wartość procentowa podawana w odniesieniu do sprzęgania peptydów może oznaczać kilka zupełnie różnych rzeczy.
Może odnosić się do konwersji materiału wyjściowego, względnej powierzchni piku chromatograficznego, zmierzonej zawartości produktu docelowego, wydajności surowej albo wydajności izolowanej.
Podanie samej liczby bez wyjaśnienia, czego dotyczy, może więc tworzyć mylące wrażenie dużej precyzji.
Rzetelne porównania powinny określać substrat, analizowany etap sprzęgania, zastosowaną metodę analityczną, moment pobrania próbki oraz rodzaje badanych zanieczyszczeń.
Jeżeli zastosowano sprzęganie powtarzane, również należy to uwzględnić.
Końcowy rezultat po dwóch operacjach sprzęgania nie musi odzwierciedlać tego, co wydarzyło się podczas pierwszej reakcji.
Podobnej ostrożności wymagają granice wykrywalności metod analitycznych.
Stwierdzenie „nie wykryto” oznacza, że danej substancji nie wykryto w określonych warunkach i przy ograniczeniach zastosowanej metody.
Nie powinno być automatycznie zamieniane na absolutne twierdzenie, że dane zanieczyszczenie w ogóle nie występuje.
Dane dotyczące odczynnika powinny obejmować więcej niż łatwy model
Odczynnik sprzęgający, który działa wyjątkowo dobrze w prostej reakcji modelowej, może zachowywać się inaczej w przypadku aminokwasu o dużym zatłoczeniu sterycznym, wrażliwego centrum stereochemicznego, słabo rozpuszczalnego substratu lub łańcucha peptydowego podatnego na agregację.
Badania porównujące Oxyma-B w kilku modelowych peptydach pokazują, dlaczego ocena chemii sprzęgania na więcej niż jednym substracie jest wartościowa.
Ostatecznie użyteczna metoda sprzęgania powinna prowadzić do uzyskania zamierzonej struktury z akceptowalnym profilem zanieczyszczeń oraz powtarzalnym wynikiem dla docelowej syntezy.
Dlatego efektywność sprzęgania lepiej rozumieć jako zbiór różnych pomiarów niż jako właściwość opisywaną nazwą pojedynczego odczynnika lub wynikiem jednego testu zaniku substratu.
Najczęściej zadawane pytania
1. Dlaczego podczas syntezy peptydów potrzebne są grupy ochronne?
Grupy ochronne tymczasowo ograniczają niepożądane reakcje, dzięki czemu właściwe grupy funkcyjne mogą utworzyć zamierzone wiązanie peptydowe. Aminokwasy mogą zawierać kilka miejsc reaktywnych, a pozostawienie ich wszystkich jednocześnie dostępnych może prowadzić do konkurencyjnych reakcji. Skuteczna strategia zabezpieczania musi również uwzględniać możliwość późniejszego usunięcia zabezpieczeń oraz ich zgodność z pozostałą częścią cząsteczki. Badania modelowe pokazują, że wybór grup ochronnych może wpływać nie tylko na podstawową selektywność reakcji, ale również na powstawanie produktów ubocznych. Grupa ochronna jest więc jednym z elementów całej strategii syntezy, a nie uniwersalnym rozwiązaniem wszystkich problemów chemicznych.
2. Czy prawidłowe sprzęganie może nadal prowadzić do powstania zanieczyszczeń?
Tak. Zamierzone wiązanie peptydowe może powstać, podczas gdy inne cząsteczki w tej samej mieszaninie ulegają niepełnej konwersji albo niepożądanym reakcjom ubocznym. Szczególnie dobrze pokazują to badania produktów epimerycznych, ponieważ utworzenie właściwego wiązania i zachowanie właściwej stereochemii są odrębnymi zagadnieniami. Wykrycie docelowego peptydu nie oznacza więc, że jest on jedynym obecnym produktem. Naukowo uzasadniona ocena powodzenia sprzęgania wymaga zdefiniowanego punktu końcowego analizy i informacji dotyczących istotnych zanieczyszczeń.
3. Czy sprzęganie peptydów jest tym samym co cała synteza peptydu?
Nie. Sprzęganie jest pojedynczą operacją tworzenia wiązania w ramach znacznie szerszego procesu syntezy. Synteza na fazie stałej może obejmować również przyłączenie do nośnika, zabezpieczanie, usuwanie grup ochronnych, wielokrotne przemywanie, odszczepianie, obróbkę, oczyszczanie i końcową charakterystykę. Ponieważ niepożądane produkty mogą powstawać również poza etapem sprzęgania, końcowego zanieczyszczenia nie należy automatycznie przypisywać nieprawidłowemu sprzęganiu bez danych wskazujących na jego rzeczywiste pochodzenie.
4. Dlaczego grupa karboksylowa jest aktywowana?
Aktywacja grupy karboksylowej tworzy bardziej korzystną drogę jej reakcji z odpowiednią grupą aminową, ułatwiając w ten sposób powstawanie wiązania amidowego. Zwiększona reaktywność może jednak umożliwiać również reakcje konkurencyjne. Dlatego przy ocenie systemów sprzęgających analizuje się nie tylko efektywność tworzenia wiązania, ale również skutki stereochemiczne i powstawanie produktów ubocznych. Celem aktywacji nie jest maksymalne zwiększenie reaktywności cząsteczki, lecz osiągnięcie odpowiedniej selektywności reakcji.
5. Do czego służy HATU?
HATU jest odczynnikiem sprzęgającym stosowanym do ułatwiania tworzenia wiązań amidowych, w tym podczas sprzęgania peptydów. Nie jest peptydem ani grupą ochronną. Badania porównawcze trudnych sekwencji peptydowych pokazują, że metody wykorzystujące HATU należy oceniać w pełnym kontekście warunków reakcji. Sama informacja, że użyto HATU, nie potwierdza całkowitej konwersji, zachowania stereochemii ani lepszego profilu zanieczyszczeń.
6. Czy istnieje jeden najlepszy odczynnik do sprzęgania peptydów?
Nie. Nie istnieje uniwersalny ranking odczynników odpowiedni dla każdego peptydu i każdej reakcji. Zatłoczenie steryczne, rozpuszczalność substratu, agregacja, wrażliwość stereochemiczna oraz kontekst sekwencji mogą wpływać na wynik. Wybór odczynnika powinien więc opierać się na zmierzonych wynikach dla konkretnej reakcji, a nie wyłącznie na jego reputacji czy popularności.
7. Czy „odczynnik sprzęgający” i „dodatek” oznaczają to samo?
Nie. Określenia te mogą opisywać różne funkcje w systemie sprzęgania. Odczynnik sprzęgający może bezpośrednio uczestniczyć w aktywacji, podczas gdy dodatek może wpływać na powstawanie produktów pośrednich, wydajność reakcji, integralność stereochemiczną lub konkurencyjne szlaki chemiczne. Dlatego należy analizować cały system reakcyjny, a nie traktować wszystkich jego składników jako wymiennych odpowiedników.
8. Czy można sprzęgać całe fragmenty peptydów zamiast pojedynczych aminokwasów?
Tak. Reakcja sprzęgania może łączyć większe zabezpieczone fragmenty peptydowe, a nie tylko pojedyncze aminokwasy. Zwiększenie rozmiaru reagujących składników nie eliminuje jednak potrzeby kontrolowania selektywności miejsca reakcji, stereochemii ani końcowej charakterystyki produktu. W przypadku sprzęgania fragmentów nadal potrzebne są dane potwierdzające, że właściwe połączenie rzeczywiście powstało prawidłowo.
9. Jaka jest różnica między racemizacją a epimeryzacją?
Racemizacja w ścisłym znaczeniu oznacza utratę wzbogacenia enancjomerycznego w kierunku mieszaniny racemicznej, natomiast epimeryzacja oznacza zmianę konfiguracji jednego centrum stereogenicznego w cząsteczce zawierającej wiele takich centrów. W literaturze dotyczącej syntezy peptydów termin racemizacja bywa stosowany szerzej do opisywania niepożądanych zmian konfiguracji reszt aminokwasowych. Precyzyjne określenie powinno więc odpowiadać rzeczywistej zmianie strukturalnej.
10. Czy spektrometria mas może wykryć każdy błąd stereochemiczny?
Nie. Stereoizomery mogą mieć dokładnie taką samą masę cząsteczkową. Uzyskanie oczekiwanej masy nie potwierdza więc właściwej konfiguracji każdego centrum stereogenicznego. Do oceny takich różnic mogą być potrzebne dodatkowe metody, na przykład odpowiednie techniki chromatograficzne lub strategie derywatyzacji. Spektrometria mas pozostaje niezwykle użytecznym narzędziem charakterystyki cząsteczkowej, ale jej wyniki należy interpretować zgodnie z ograniczeniami konkretnego pytania strukturalnego.
11. Czy powstawanie aspartimidu oznacza po prostu nieudane sprzęganie?
Nie. Powstawanie aspartimidu jest odrębnym szlakiem reakcji ubocznej związanym z podatnymi sekwencjami zawierającymi asparaginian. Na jego występowanie mogą wpływać sąsiednie reszty oraz warunki związane z usuwaniem grup ochronnych. Niepożądana zmiana strukturalna może więc wystąpić nawet wtedy, gdy odpowiedni aminokwas został wcześniej prawidłowo przyłączony. Ustalenie pochodzenia zanieczyszczenia jest ważne, ponieważ powtórzenie sprzęgania nie musi rozwiązać problemu wynikającego z zupełnie innego szlaku reakcji.
12. Czy powtórzenie sprzęgania gwarantuje powodzenie reakcji?
Nie. Powtórzenie sprzęgania może w niektórych przypadkach poprawić konwersję, ale nie gwarantuje, że wszystkie miejsca reaktywne staną się dostępne ani że inne reakcje uboczne zostaną wyeliminowane. Wynik nadal zależy od substratu i zastosowanej metody. Analiza produktu jest więc konieczna, aby ustalić, co rzeczywiście dało dodatkowe sprzęganie.
13. Czy wyższa temperatura zawsze poprawia jakość sprzęgania?
Nie. Podwyższenie temperatury może przyspieszać pożądaną reakcję, ale może również przyspieszać niepożądane procesy chemiczne. Szybszej konwersji nie należy więc automatycznie interpretować jako poprawy jakości chemicznej. Temperaturę trzeba oceniać zarówno pod kątem tworzenia produktu docelowego, jak i profilu powstających zanieczyszczeń.
14. Czy zanik wolnej grupy aminowej potwierdza powstanie prawidłowego peptydu?
Nie. Brak wykrywalnej wolnej grupy aminowej odpowiada na znacznie węższe pytanie dotyczące określonej grupy funkcyjnej w warunkach zastosowanego testu. Nie potwierdza samodzielnie kompletnej sekwencji peptydu, jego stereochemii ani czystości. Monitorowanie wolnych grup aminowych może być przydatnym elementem kontroli procesu, ale nie zastępuje końcowej charakterystyki produktu.
15. Czy czystość HPLC jest tym samym co wydajność sprzęgania?
Nie. Czystość HPLC i wydajność opisują różne właściwości. Czystość HPLC jest zależnym od metody opisem składu wykrywanych składników próbki, natomiast wydajność odnosi się do ilości określonego produktu otrzymanego w stosunku do zdefiniowanej ilości materiału początkowego. Oczyszczanie może zwiększyć czystość chromatograficzną, a jednocześnie zmniejszyć ilość odzyskanego produktu docelowego. Dlatego wartość procentowa ma ograniczone znaczenie, jeżeli nie określono dokładnie, co przedstawia.
16. Czy zanieczyszczenia mogą powstawać już po zakończeniu sprzęgania?
Tak. Po zakończeniu reakcji sprzęgania synteza peptydu obejmuje kolejne etapy chemiczne. Usuwanie grup ochronnych, odszczepianie i dalsza obróbka mogą modyfikować cząsteczkę lub prowadzić do powstania dodatkowych zanieczyszczeń. Nie oznacza to, że każde końcowe zanieczyszczenie powstaje na późniejszych etapach, ale pokazuje, dlaczego prawidłowe sprzęganie nie stanowi gwarancji jakości końcowego produktu.
17. Co sprawia, że porównanie metod sprzęgania jest wiarygodne?
Wiarygodne porównanie powinno oceniać alternatywne metody dla tego samego, jasno określonego celu oraz w wystarczająco porównywalnych warunkach. Powinno wskazywać zastosowane substraty, etap pobrania próbki, metody analityczne oraz oceniane rodzaje zanieczyszczeń, zamiast przedstawiać niewyjaśnioną wartość procentową lub opierać się na reputacji odczynnika. Porównania obejmujące kilka różnych peptydów modelowych mogą dostarczać więcej informacji niż pojedyncza wysoka wydajność uzyskana dla łatwego substratu, ponieważ pokazują, jak skuteczność zmienia się wraz z kontekstem molekularnym. Nawet wtedy wnioski powinny pozostawać ograniczone do rzeczywiście przebadanych układów chemicznych.
Podsumowanie
Sprzęganie peptydów jest podstawowym elementem chemicznej syntezy peptydów, ponieważ prowadzi do powstawania wiązań amidowych łączących reszty aminokwasowe w szkielet peptydowy. Opisywanie sprzęgania wyłącznie jako „łączenia dwóch aminokwasów” pomija jednak znaczną część chemii decydującej o tym, czy uzyskany produkt rzeczywiście jest zamierzonym peptydem.
Składnik zawierający grupę karboksylową zazwyczaj wymaga aktywacji, aby efektywne tworzenie wiązania amidowego mogło zachodzić w odpowiedni sposób. Odczynniki sprzęgające i dodatki mogą ułatwiać ten proces, ale ich skuteczność zależy od substratu, środowiska reakcji oraz sposobu analitycznej oceny wyniku. Dlatego odczynnik należy analizować w pełnym kontekście eksperymentalnym, a nie klasyfikować niezależnie od syntetyzowanego peptydu.
Grupy ochronne zapewniają kolejny poziom kontroli poprzez tymczasowe uniemożliwianie niepożądanym grupom funkcyjnym uczestniczenia w reakcji. Ich przydatność zależy nie tylko od skutecznego zabezpieczenia, ale również od możliwości selektywnego usunięcia i zgodności z kolejnymi etapami syntezy. Strategia zabezpieczania oraz sąsiednie reszty aminokwasowe mogą również wpływać na powstawanie określonych produktów ubocznych.
Integralność stereochemiczna stanowi kolejny istotny element. Reakcja sprzęgania może prowadzić do powstania wiązania amidowego, a jednocześnie generować materiał epimeryczny. Ponieważ epimer może mieć taką samą masę cząsteczkową jak właściwy peptyd, sama zgodność masy nie potwierdza pełnej poprawności strukturalnej. Zmiany konfiguracji mogą również powstawać na innych etapach, takich jak początkowe przyłączenie aminokwasu do fazy stałej.
Inne zanieczyszczenia powstają poprzez odmienne mechanizmy. Niepełne sprzęganie może prowadzić do powstawania sekwencji delecyjnych lub skróconych, podczas gdy reakcje związane z aspartimidem mogą modyfikować peptyd zawierający już właściwe reszty aminokwasowe. Przyspieszenie procesu może wpływać zarówno na reakcje pożądane, jak i na szlaki uboczne, a dodatkowe zanieczyszczenia mogą powstawać również podczas późniejszych etapów, takich jak odszczepianie.
Z tych powodów ocena sprzęgania peptydów wymaga czegoś więcej niż ustalenia, czy materiał wyjściowy zniknął.
Konwersja, powstawanie produktu docelowego, wydajność izolowana, czystość chromatograficzna i czystość stereochemiczna odpowiadają na różne pytania.
Testy wykonywane w trakcie syntezy mogą pomagać w wykrywaniu niepełnych reakcji, ale nie potwierdzają samodzielnie kompletnej struktury peptydu. Chromatografia i spektrometria mas dostarczają uzupełniających się informacji, natomiast pytania dotyczące stereochemii lub bardzo podobnych struktur mogą wymagać dodatkowych metod analitycznych.
Najbardziej uzasadnione podejście do sprzęgania peptydów jest więc ukierunkowane na konkretną cząsteczkę i oparte na danych.
Użyteczna metoda sprzęgania nie jest po prostu metodą wykorzystującą najbardziej znany lub najbardziej reaktywny odczynnik. Jest to metoda, która w sposób powtarzalny prowadzi do utworzenia zamierzonego połączenia molekularnego, przy jednoczesnym zachowaniu odpowiedniej integralności stereochemicznej i kontroli istotnych zanieczyszczeń dla konkretnego syntetyzowanego peptydu.
References
- Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: An efficient additive for peptide synthesis to replace the benzotriazole-based HOBt and HOAt with a lower risk of explosion. Chemistry—A European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Racemization studies in peptide synthesis through the separation of protected epimeric peptides by reversed-phase high performance liquid chromatography. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluation of combined use of Oxyma and HATU in aggregating peptide sequences. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, an excellent racemization suppressor for peptide synthesis. Organic & Biomolecular Chemistry, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Solid-phase peptide synthesis: From standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). The aspartimide problem in Fmoc-based SPPS. Part I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). The aspartimide problem in Fmoc-based SPPS. Part II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Use of Marfey’s reagent to quantitate racemization upon anchoring of amino acids to solid supports for peptide synthesis. Analytical Biochemistry, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzenedimethanethiol (1,4-BDMT) as a scavenger for greener peptide resin cleavages. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). The characterization of crude products from solid-phase peptide synthesis by mu-HPLC/fast atom bombardment mass spectrometry. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed