Připojování peptidů je chemický proces vedoucí k vytvoření vazby mezi molekulou obsahující karboxylovou skupinu a molekulou obsahující aminovou skupinu. V důsledku této reakce vzniká amidová vazba. Když tato vazba při syntéze peptidu spojuje aminokyselinové zbytky, stává se součástí toho, co je označováno jako peptidový skelet.
Reagujícími složkami nemusí být jednotlivé aminokyseliny. Reakce vazby může spojit jeden aminokyselinu s druhým, připojit další aminokyselinu k rostoucímu peptidovému řetězci nebo spojit větší fragmenty peptidů, které byly dříve syntetizovány samostatně.
Na první pohled se zdá, že spojení peptidů může být jednoduchým úkolem: stačí spojit jeden aminokyselinu s dalším.
Z chemického hlediska je však vytvoření amidového vazebného mechanismu pouze součástí celého cíle.
Spojení musí vzniknout na správném místě a s dodržením odpovídající stereochemické konfigurace, zatímco ostatní reaktivní funkční skupiny musí zůstat odpovídajícím způsobem kontrolovány. Reakce může zjevně proběhnout úspěšně a využít většinu nebo dokonce celý vstupní materiál, přesto však vést k vzniku nežádoucí směsi cílového peptidu a dalších struktur.
Proto ukončení reakce a správné vytvoření produktu neznamenají totéž.
Studie porovnávající různé systémy vazby, strategie zabezpečení funkčních skupin a stereochemické výsledky ukazují, proč neexistuje jediný univerzálně nejlepší vazebný činidlo nezávisle na druhu syntetizovaného peptidu.
Z vědeckého hlediska není tedy užitečnějším otázkou:
„Který spojovací prostředek je nejlepší?”
Lepší otázka zní:
„Jaké postupy umožňují získat zamýšlený peptid s odpovídající konverzí, zachováním stereochemické integrity a správnou kontrolou znečištění za podmínkách odpovídajících konkrétní molekule?”
Toto rozlišení má zásadní význam pro pochopení chemie vazby peptidů.
Co znamená spájení peptidů?
Kombinace spojuje dva prvky tím, že vytvoří nový vazebný úsek.
V typické reakci vedoucí k vzniku peptidového skeletu se karboxylová skupina spojená s jednou aminokyselinou spojuje s aminovou skupinou druhé aminokyseliny.
Tvorící se sloučenina je chemicky amidovou vazbou.
Pokud takové vazby spojují ostatní aminokyseliny v peptidovém řetězci, jsou obecně označovány jako peptidové vazby.
Přesné fyzikální uspořádání reagujících látek závisí na použité syntetizační strategii.
Během syntézy peptidů na pevném stupni je odkrytá aminová skupina obvykle součástí rostoucího peptidového řetězce připojeného k živici, zatímco komponenta obsahující karboxylovou skupinu pochází z přidaného zabezpečeného aminokyslíku.
V syntéze prováděné v roztoku mohou však oba složky být v tekutém stavu.
V případě slučování fragmentů se používají větší, zabezpečené peptidové segmenty namísto přidávání jednotlivých aminokyselinových zbytků po sobě.
Různé strategie mění způsob řízení reakcí, rozdělování látek a jejich čištění, ale nevyřešují základní chemický problém: správné funkční skupiny musí reagovat navzájem, zatímco nežádoucí reakce v jiných částech molekuly by měly zůstat přiměřeně omezeny.
Vznik vazby, konverze a účinnost jsou různé pojmy
Několik termínů často používaných při popisu syntézy peptidů může znít podobně, i když se týkají různých témat.
Konverze určuje, jaká část daného vstupního materiálu byla reakcí ovlivněna.
Nicméně neříká automaticky, co se z tohoto materiálu stalo.
Pokud se 99% procent vstupních materiálů ztrácí, ale část z nich vytvoří nežádoucí vedlejší produkty, 99procentní konverze neznamená, že vzniklo 99% procent zamýšleného peptidu.
Vytvoření cílového produktu odpovídá na další otázku: jaká množství zamýšlené molekulární struktury ve skutečnosti vznikly? Odpověď vyžaduje analytickou metodu umožňující rozlišit správný produkt od významných alternativních struktur.
Výkon izolovaný popisuje množství konkrétního produktu, které bylo nakonec možné získat vzhledem k definované množství počátečního materiálu. Konečné výkon tedy mohou ovlivnit i etapy zpracování, separace a čištění, i když samotné spojení proběhlo efektivně.
Kromatografická čistota popisuje rozdělení látek detekovaných za podmínek určité chromatografické metody. Může poskytovat velmi cenné informace o složení vzorku, ale její interpretaci mohou omezit společný výtok, rozdíly v odezvě detektoru nebo přítomnost látek slabě detekovaných danou metodou.
Stereochemická čistota odpovídá otázce, zda byla zachována zamýšlená prostorová konfigurace molekuly. Jedná se o odlišnou analytickou otázku, protože některé stereochemické varianty mohou mít přesně stejnou molekulovou hmotnost jako cílový produkt.
Tyto rozdíly pomáhají pochopit výsledky, které mohou na první pohled působit protichůdně.
Reakce může vykazovat vysokou konverzi vstupního materiálu a zároveň vést k vzniku několika produktů. Surový přípravek může mít vysokou hmotnost získanou při recyklaci, ale může obsahovat značné množství znečišťujících látek. Intenzivní čištění však může vést k získání materiálu s vysokou čistotou na úkor nižší účinnosti izolace.
Žádná z těchto pozorování sama o sobě není v rozporu s ostatními.
Jednoduše popisují různé vlastnosti produktu nebo různé fáze procesu.
Proto tvrzení „zkušební postup byl kompletní” má mnohem větší váhu, pokud je známo také, jakou analytickou metodu bylo použito a co přesně bylo měřeno.
Zložité substráty odhalují různé omezení procesu
Ne každá reakce spojená s vazbou peptidů má stejnou míru chemické složitosti.
Silně přetížený stericky stabilní reaktant může zpomalit tvorbu vazby, protože reagující skupiny mají omezený přístup k sobě samým.
Nedostačující rozpustnost může omezit účinný kontakt mezi složkami reakce.
V syntéze v pevném stavu může rostoucí peptidový řetězec působit na sousední řetězce nebo přijímat struktury omezující přístup k reaktivním místům, i když vazebné činidla jsou přítomna v přímém nadbytku.
Tyto problémy mají různé chemické podstaty.
Nemůžeme tedy předpokládat, že jedno řešení bude automaticky účinné ve všech případech.
Studie porovnávající strategie opakovaného sloučení pro složité peptidové sekvence analyzovaly skutečný složení získaných surových produktů namísto toho, aby se hodnocení zakládalo pouze na teoretické reaktivitě nebo reputaci jednotlivých činidel. Jedna z testovaných strategií se v analyzovaných modelech osvědčila, ale to neznamená, že existuje univerzální řešení vhodný pro každou peptidovou sekvenci.
Nejdůležitějším zjištěním je, že účinnost metody je třeba posuzovat na základě produktu získaného z konkrétního substrátu, a nikoli pouze na základě reputace použitého činidla.
Aktivace karboksylové skupiny
Proč je aktivace obvykle potřeba?
Samotné smíchání nelikvidovaného karboksylového kyseliny s aminou za běžných podmínek obvykle nevede k účinnému vytvoření čistého peptidového vazebného molekulu.
Místo toho mohou docházet k působení kyselých a zásadových činidel, a účinné vytváření amidového vazebného molekuly vyžaduje vhodnou chemickou cestu.
Proto spojování peptidů obvykle zahrnuje aktivaci komponenty obsahující karboxylovou skupinu.
Aktywace zvyšuje jeho náchylnost k reakci s příslušnou aminovou skupinou. Správné prostředí reakce a vhodná odcházející skupina usnadňují vznik nového amidového vazebného molekuly.
Aktivační produkt prostředník může existovat pouze po krátkou dobu a nemusí být izolován.
Cílem však není dosáhnout maximální možné chemické reakce.
Cílem je regulovaná reakce.
Aktivační přechodný produkt, který velmi rychle reaguje s vodou, s jiným nežádoucím nukleofilem nebo se podílí na konkurenční reakci, může rychle zaniknout a zároveň vést k vzniku relativně malé množství zamýšleného peptidu.
Velká reaktivita je tedy prospěšná pouze tehdy, pokud lze ji vhodně zaměřit na vznik zamýšleného vazby.
Spojovací prostředky a přípravky plní různé funkce
V spojování peptidů mohou účinkovat různé druhy chemických látek plnících různé funkce.
Karbodiimidy jsou jednou z rodin činidel používaných k aktivaci karboksylových skupin.
Jiná spojovací systémy využívají odlišné mechanismy aktivace, včetně často používaných iontových činidel, jako jsou systémy založené na HATU.
Další sloučeniny mohou plnit funkci přísad.
Termín „additiv” však neznamená, že daný sloučenina je chemicky bezvýznamná. Additiv může ovlivňovat vedlejší produkty, účinnost slučování, konkurenční reakční dráhy a stereochemické výsledky.
Výzkum oxymy v syntéze peptidů s použitím karbodiimidů zkoumal jak účinnost vazby, tak omezení racemizace v vybraných modelových systémech.
Takové údaje jsou cenné pro zkoumané systémy a konkrétní modely.
Nicméně to neznamená, že použití stejného sloučeniny v každém možném spojení peptidů přinese stejný výsledek.
Pozdější studie společnosti Oxyma-B porovnávaly výsledky týkající se optické čistoty u několika modelových peptidů.
Studie mnoha substrátů je obzvláště důležitá, protože velmi dobré výsledky při snadno chemicky spojených sloučeninách nemusí předpovídat chování činidla v prostředí s vysokou hustotou, kde je vystaveno agregaci nebo je citlivé na stereochemii.
Co znamená HATU v syntéze peptidů?
HATU je vazební činidlo používané k usnadnění tvorby amidových vazeb, a to i při syntéze peptidů.
HATU není peptid.
Není to také skupina ochránců.
Samotná jeho přítomnost není důkazem toho, že spojení bylo dokonáno ani že získaný peptid je čistý.
Účinnost závisí na druhu substrátu, ostatních činidel, systému rozpouštědel a širším kontextu reakčních podmínek.
Studie sekvencí náchylných k agregaci porovnávala mimo jiné přístupy založené na HATU s systémy Oxyma/karbodiimid v podmínkách opakovaného spřahování.
To poukazuje na to, proč hledání slov jako „HATU peptide” by mělo být chápáno jako otázky týkající se chemie vazby a výběru metody, a nikoli jako důkaz toho, že jeden konkrétní činidlo představuje univerzální metodu syntézy peptidů.
Samotná název činidla nestačí k reprodukci ani správné interpretaci zveřejněného výsledku.
Význam mají také podmínky reakce, sekvence peptidu a způsob analytického definování úspěchu procesu.
Aktivace a stereochemická kontrola vyžadují zachování rovnováhy.
Dlouhodobé udržování aktivované derivátové formy aminokyselin v reakčním systému není vždy výhodné.
Požadovaná reakce vazby nastává vedle dalších možných chemických procesů.
Některé konkurenční trasy mohou změnit stereotypy.
Experimentální studie zabezpečených epimeryčných produktů zkoumaly vliv kombinace aminokyselin, rozpouštědla a dalších látek reakce na stereochemické změny probíhající během spárování s karbodiimidy.
To ukazuje důležitou zásadu: celý prostředí reakce může být stejně důležité jako celá rodina použitých sloučenin.
Strategie spájení tedy musí zajišťovat dostatečnou reaktivitu pro vytvoření požadovaného vazebného spojení a zároveň omezit možnost vzniku nežádoucích reakcí.
Tyto zásady lze pro vzdělávací účely diskutovat bez jejich přeměny na hotový laboratorní protokol. Přesné množství reaktivních látek, jejich pořadí přidávání a podmínky reakce závisí na konkrétním syntetizovaném procesu.
Role ochranných skupin
Omezování konkurenčních reakcí snižuje bezpečnost
Aminokyselina může obsahovat více reaktivních skupin než jen aminovou a karboxylovou skupinu potřebnou k vytvoření peptidového skeletu.
Jeho boční řetězec může obsahovat další reaktivní chemické skupiny.
Kdyby všechny potenciálně reaktivní skupiny zůstaly odkryté během každého stupně fázování, záměrné vytváření peptidového vazebného molekuly by mohlo konkurovat rozdělení nebo jiným nežádoucím reakcím.
Strategie využívající ochranné skupiny umožňuje dočasně zamaskovat vybraná místa reakce.
Tímto způsobem mohou odpovídající aminová a karboxylová skupina reagovat navzájem, zatímco ostatní místa zůstanou nedostupná nebo dostatečně málo reaktivní za daných podmínek.
Ochrana tedy zajišťuje chemickou selektivitu.
Účinná strategie však nespočívá pouze v připojení stabilně chemicky stabilní skupiny.
Ochrannou skupinu je také třeba později odstranit.
Ochranná funkce, která účinně zabraňuje nežádoucím reakcím během slučování, ale která nelze později odstranit bez poškození cílové molekuly, vytváří další syntetický problém.
Plná strategie tedy musí zohledňovat jak stabilitu v období, kdy je ochrana potřebná, tak možnost selektivního odstranění ochrany, pokud již není potřebná.
Dočasná a dlouhodobá opatření plní různé funkce
Jednotlivé ochranné skupiny mohou zůstat na částech po různou dobu.
V typické syntéze v pevném stavu využívající Fmoc jako ochrannou skupinu koncového aminoatolu rostoucí řetězce je mnohokrát odstraněna v průběhu prodlužování sekvence.
Velké skupiny ochranných vazeb na koncích řetězce však zůstávají přítomné po mnoho cyklů spájení a jsou odstraněny až v pozdějším stádiu.
Standardní metody založené na Fmoc ukazují, jak jsou koordinovány opakující se cykly selektivního odstraňování a spájení vazeb.
Typ ochrany potřebné pro konkrétní boční řetězec závisí na zbytku aminokyselin, celém peptidu a zvolené syntetizační strategii.
Nebylo by tedy správné tvrdit, že každý aminokyselina vyžaduje stejnou formu ochrany, ani že všechny syntézy využívají stejné ochranné skupiny.
Dočasné ochranné skupiny je také třeba odlišit od chemických skupin, které záměrně zůstávají v připraveném peptidu.
Plánovaná modifikace N-konce nebo amidu na C-konci může například představovat součást cílové struktury.
Mezitím však do konečné molekuly náhodně přibudla dočasná ochranná skupina, což by znamenalo nežádoucí strukturální rozdíl.
Ortogonalita je podmínkou chemické slučitelnosti
Ortogonalní ochrana je strategie, v níž lze vybrané ochranné skupiny odstranit, přičemž ostatní zabezpečení zůstane dostatečně nedotčeno.
To umožňuje odhalit různé místa reaktivace v cílených fázích syntézy.
Ortogonalitu nelze chápat pouze jako vlastnost jednotlivého činidla uvedenou na jeho štítku.
Popisuje to shodu celé naplánované sekvence chemických operací.
Zamýšlené odstranění vazby by mělo probíhat tak, aby nedocházelo k nepřijatelným změnám v jiných částech rostoucího peptidu.
V syntéze v pevném stavu může tato shoda zahrnovat také nosič-spojovací systém a atypické nebo chemicky zvláště citlivé stavební bloky.
Studie vzniku aspartimidu, ve kterých byly modifikovány zabezpečovací mechanismy vedlejších a skeletových řetězců v modelovém peptidu, prokázaly rozdíly v vzniku vedlejších produktů.
To ukazuje, že výběr zabezpečení může mít vliv nejen na výskyt samozřejmé reakce vedlejšího řetězce.
Může také měnit jiné cesty vzniku znečištění během syntézy.
Ochranné skupiny nezaručují, že všechny sekvence se chová stejným způsobem
I když dvě sekvence obsahují stejný potenciálně problematický aminokyselina, nemusí se chovat stejně.
Příslušné zbytky mohou ovlivňovat pravděpodobnost vzniku konkurenčních reakcí.
Systematické studie modelových sekvencí obsahujících asparaginianu prokázaly, že aminokyselina následující po této zbytku ovlivňovala tvorbu produktů spojených s aspartimidem za zkoumaných podmínek.
To neznamená, že každá sekvence obsahující takový motiv musí způsobit problémy.
Naopak ukazuje, že kontext sekvence by měl být zohledňován při navrhování metody a posuzování rizika.
Strategie zabezpečení, která se osvědčila u jednoho modelového peptidu, nezaručuje stejné chování každého jiného peptidu obsahujícího stejnou rest.
Rasizace a další vedlejší účinky
Racemizace a epimeryzace se týkají prostorového uspořádání částice
Mnoho aminokyselinových zbytků obsahuje stereogenní centrum.
Změna konfigurace takového centra může vést k vzniku strukturovaně odlišné molekuly, i když její prvkový složení a molekulová hmotnost zůstanou nezměněny.
Přesněji řečeno, racemizace znamená ztrátu enantiomerického obohacení směsi racemické.
V peptidu obsahujícím mnoho stereogenních center odvrácení konfigurace jednoho konkrétního centra obvykle vede k vzniku epimera, tedy druhu diastereomery.
V literatuře týkající se syntézy peptidů se však termín „racemizace” běžně používá v širším smyslu pro nechtěné změny konfigurace, které nastávají během spárování nebo v jiných fázích syntézy.
Tento rozdíl je důležitý, protože identita peptidu nezávisí pouze na tom, jaké atomy se nacházejí v molekule.
Je také důležité jejich prostorové uspořádání.
Ne každá aminokyselina má stejné riziko stereochemii.
Glycin například nemá typický chiralní atom uhlíku alfa, který se vyskytuje v většině aminokyselin.
Ostatní zbytky se liší svou citlivostí na změny konfigurace v závislosti na své struktuře a prostředí reakce.
Správné hmotnosti mohou být doprovázeny nesprávnou stereochemíí
Epimeryczny peptyd může mít přesně stejnou molekulovou hmotnost jako cílový peptyd.
Proto pozorování očekávané hmotnosti pomocí hmotnostní spektrometrie automaticky neznamená, že každá aminokyselinová frakce zachovala zamýšlenou stereochemickou konfiguraci.
Kromatografické testy umožnily oddělit zabezpečené epimery typické peptidy a využít tyto rozdělení k analýze stereochemických změn spojených s chemikáliemi spojenými s vazbou.
V závislosti na látce může odpovídající stereochemická analýza vyžadovat správné chromatografické metody, referenční sloučeniny, strategie derivace nebo jiné analytické metody schopné rozlišit významné struktury.
Osobitné analytické studie také analyzovaly stereochemické změny, které nastávají při připojování aminokyselin ke statickým nosičům.
To vede k dalšímu důležitému závěru: znečištění zjištěné v připraveném peptidu nemusí pocházet z poslední reakce spájení.
Mohlo by se to stát již v předchozím kroku a zůstat přítomno i během dalších kroků syntézy.
Vytváření aspartimidu je samostatným problémem
Vytváření aspartimidu je specifickým metabolickým sprievodným procesem spojeným s citlivými peptidovými sekvencemi obsahujícími aspartin.
Proces zahrnuje vytvoření cyklického intermediálního produktu, z něhož mohou následně vznikat různé příbuzné struktury.
Mohou zahrnovat změněné vazby v struktuře peptidu a stereochemické varianty.
Vytváření aspartimidu tedy nelze popisovat pouze jako jiná název pro neúplné slučování.
Peptidový řetězec již může obsahovat správné aminokyselinové zbytky a následná vedlejší reakce mohou upravit část jeho struktury.
Experimentální studie ukazují, že tento proces mohou ovlivňovat strategie zabezpečení, sousední zbytky a opakující se podmínky spojené s odstraňováním ochranných skupin.
Toto rozlišování je obzvláště důležité při interpretaci problémů objevujících se při syntéze.
Pouhé opakování procesu fázového spojení nebo přidání většího množství spojujícího činidla automaticky nezlepší znečištění vzniklé v důsledku zcela odlišného chemického postupu.
Neúplné reakce vedou k jiným problémům
Neúplné sběrné zařízení vytváří samostatnou kategorii znečištění.
Pokud jeden řetězec s živicí neobdrží plánovaný aminokyselina, ale bude správně reagovat během následného cyklu, vzniklý peptid může být bez této zbytky.
Taková molekula se obvykle označuje jako sekvence deleční.
Ostatní řetězce mohou přestat se prodlužovat a zůstat zkrácené.
Tyto produkty se v zásadě liší od epimerů.
Epimer může mít správnou aminokyselinovou sekvenci a syntetický vzorec, ale nesprávnou stereochemii jednoho centra.
Peptid deleycyjny má však jinou sekvenci nebo délku.
Některé strategie syntézy využívají tzv. capping, aby zabránily dalšímu prodlužování určitých nereagujících řetězců.
Capping však nedokáže opravit poškozený řetězec a nedokáže ho přeměnit na cílový peptid.
Jen změní jeho chování během dalších kroků.
Hrubá směs získaná při syntéze tedy může obsahovat produkty vznikající několika různými mechanismy.
Jedna celková hodnota výkonnosti nedovoluje určit, které mechanismy vzniku znečištění byly zodpovědné za konečný výsledek.
Teplota a podmínky procesu ovlivňují kompromis mezi rychlostí a kvalitou
Zvýšení teploty nebo jiné způsoby urychlení syntézy mohou zvýšit rychlost požadovaných reakcí.
Současně však mohou zpřesnit nežádoucí reakce.
Studie SPPS pomocí mikrovlnného zesilování analyzovaly racemizaci a vznik aspartimidu v modelových systémech a prokázaly v aplikovaných podmínkách závislost zbytkové citlivosti na typ.
To neznamená, že se topení samy o sobě nelíbí při syntéze peptidů.
To také neznamená, že nižší teplota je vždy lepší volba.
Nejdůležitější zásada zní: rychlost procesu a chemickou kvalitu je třeba posuzovat současně.
Vyšší teplota, delší doba expozice nebo opakované zpracování mohou mít vliv jak na požadované vytváření vazeb, tak na konkurenční reakce.
Přiměřený kompromis by proto měl být experimentálně vyhodnocen pro konkrétní sekvenci.
Modifikace konečného produktu mohou také nastat již po ukončení samotného spárování.
Studie porovnávající různé prostředky k odstraňování peptidu z pryskyřice prokázaly rozdílné profily znečištění.
To naznačuje, že konečné znečištění nelze automaticky připsat reakci spáření.
Syntéza peptidu je procesem s mnoha fázemi a následné odstraňování vazeb, odstraňování vazeb a další zpracování mohou změnit materiál, který byl dříve správně vytvořen.
Jak se hodnotí účinnost spojování?
Testy prováděné během procesu odpovídají pouze na konkrétní otázky
Během syntézy v pevném stavu může test identifikující další dostupné aminové skupiny pomoci posoudit, zda acylace mohla proběhnout neúplně.
Takové testy mohou být velmi užitečné.
Jejich interpretace by však měla být omezena na chemický problém, na který skutečně odpovídá použité metody.
V závislosti na analytické metodě a druhu aminokyselin mohou testy založené na změně barvy reagovat různým způsobem na různé aminokyseliny.
Význam má také dostupnost zkoumaného místa.
Reaktivní aminová skupina, ke které má testovací činidlo fyzicky nedostupné místo, není totéž co aminová skupina, která úspěšně prošla reakcí spřádaní – i když daný test nedokáže jednoznačně rozlišit tyto situace.
Omezení mohou tedy zahrnovat dostupnost reaktivního místa, citlivost testu, chemické interference a typ zjištěné funkční skupiny.
Negativní výsledek testu provedeného během procesu nesmí být automaticky interpretován jako důkaz toho, že celý peptid má správnou sekvenci, stereochemii a čistotu.
Monitorování procesu je nejcennější tehdy, když lze jeho výsledky později zkombinovat s analýzou skutečného peptidového produktu.
Kromatografie rozděluje látky a hmotnostní spektrometrie pomáhá charakterizovat jejich složení.
Kromatografie a hmotnostní spektrometrie poskytují informace navzájem se doplňujícími.
Kromatografie může rozdělit složky vzorku a prokázat přítomnost více než jednoho detekovatelného složky.
Masová spektrometrie může poskytovat informace o hmotnosti molekuly a pomáhá při charakterizaci nebo při přiřazování jednotlivých látek.
Studie kombinující obě techniky umožnily analyzovat surové produkty syntézy peptidů ve stabilní fázi a získat informace o jejich identitě a stupni odstranění ochranných skupin.
Spojení obou metod obvykle poskytuje více informací než předpoklad, že každý chromatografický pixel již byl identifikován nebo že každá zjištěná hmotnost odpovídá čisté a strukturovaně kompletní frakci.
Existují však omezení.
Různé složky mohou spolu existovat, tj. nemohou být chromatograficky zcela odděleny.
Jednotlivé látky mohou také vyvolat různé odezvy detektoru.
Strukturalní izomery a stereoizomery mohou vyžadovat použití dalších analytických metod.
Ze stejného důvodu samotné tvrzení, že peptid byl testován metodou HPLC, neznamená automaticky, že byly rozděleny všechny významné znečištění.
Použitelnost konkrétní metody HPLC závisí na skutečně dosaženém rozdělení a na analytickém problému, na který má odpovědět.
Je třeba vysvětlit, jak byl výsledek vypočítán
Procentní hodnota uvedená v souvislosti s ligací peptidů může znamenat několik zcela odlišných věcí.
Může se týkat konverze vstupního materiálu, relativní plochy chromatografického vršku, měřené obsahu cílového produktu, výkonnosti surové látky nebo výkonnosti izolované látky.
Používání samotné čísla bez vysvětlení, o čemž jde, může tedy vytvářet mylný dojem velké přesnosti.
Spolehlivé srovnání by měly určovat substrát, analyzovaný stupeň vazby, použité analytické metody, okamžik odběru vzorku a druhy zkoumaných znečišťujících látek.
Pokud byla použita opakovaná konverze, je třeba to také zohlednit.
Koncový výsledek po dvou operacích spojení nemusí odrážet to, co se stalo během první reakce.
Stejné opatrnosti vyžadují limity detekovatelnosti analytických metod.
Výsledek „nebylo zjištěno” znamená, že daná látka nebyla zjištěna za daných podmínek a při omezeních použité metody.
To by nemělo automaticky vést k absolutnímu tvrzení, že dané znečištění vůbec neexistuje.
Údaje o činidle by měly zahrnovat více než jednoduchý model.
Spojovací činidlo, které se mimořádně dobře uplatňuje v jednoduché modelové reakci, se může chovat jinak v případě aminokyselin s vysokým sterylním zatížení, citlivým stereochemickým centrem, slabě rozpustným substrátem nebo peptidovým řetězcem náchylným k agregaci.
Studie porovnávající Oxyma-B v několika modelových peptidy ukazují, proč je hodnocení chemického spájení na více než jednom substrátu cenné.
Nakonec by užitečná metoda spřádaní měla vést k dosažení zamýšlené struktury s přijatelným profilem znečištění a opakovatelným výsledkem pro cílenou syntézu.
Proto je účinnost fázování lépe chápat jako souhrn různých měření než jako vlastnost popsaná názvem jednotlivého činidla nebo výsledkem jednoho testu ztráty substrátu.
Často kladené otázky
1. Proč jsou během syntézy peptidů potřebné ochranné skupiny?
Ochranné skupiny dočasně omezují nežádoucí reakce, takže správné funkční skupiny mohou vytvořit zamýšlené peptidové vazby. Aminokyseliny mohou obsahovat několik reaktivních míst a ponechání všech těchto míst současně přístupných může vést k konkurenčním reakcím. Efektivní strategie zabezpečení musí také zohledňovat možnost pozdějšího odstranění zabezpečení a jejich souhru s ostatními částmi molekuly. Modely ukázaly, že výběr ochranných skupin může ovlivňovat nejen základní selektivitu reakcí, ale také vznik vedlejších produktů. Ochranná skupina je tedy jedním z prvků celé syntetické strategie a nikoli univerzálním řešením všech chemických problémů.
2. Mohou správné spojení stále vést k vzniku znečištění?
Ano. Účinné peptidové vazby mohou vzniknout, zatímco jiné molekuly v téže směsi podléhají neúplné konverzi nebo nežádoucím vedlejším reakcím. To dokládají zejména studie epimeryčných produktů, protože vytvoření správného vazby a zachování správné stereochemie jsou odlišné pojmy. Zjištění cílového peptidu tedy neznamená, že je to jediný přítomný produkt. Vědecky odůvodněná hodnocení úspěchu vazby vyžadují definovaný konečný bod analýzy a informace o významných znečišťujících látkách.
3. Je spojování peptidů totéž jako celý syntéza peptidů?
Ne. Připojování je samostatnou operací vytváření vazby v rámci mnohem širšího procesu syntézy. Syntéza na pevném stupni může zahrnovat také připojení k nosiči, zajištění, odstranění ochranných skupin, opakované přeplňování, odstraňování, úpravu, čištění a konečnou charakterizaci. Protože nežádoucí produkty mohou vznikat i mimo fázi připojování, konečné znečištění nelze automaticky připsat nesprávnému připojování bez údajů potvrzujících jeho skutečný původ.
4. Proč je karboxylová skupina aktivována?
Aktivace karboksylové skupiny vytváří příznivější cestu jejího reakce s příslušnou aminovou skupinou, což usnadňuje vznik amidového vazebného molekuly. Zvýšená reaktivita však může také umožňovat konkurenční reakce. Proto při hodnocení slučovacích systémů se zkoumá nejen účinnost tvorby vazebného molekuly, ale také stereochemické účinky a vznik vedlejších produktů. Cílem aktivace není maximální zvýšení reaktivity molekuly, ale dosažení odpovídající selektivnosti reakce.
5. K čemu slouží HATU?
HATU je vazebné činidlo používané k usnadnění tvorby amidových vazeb, včetně vazeb peptidů. Nejsou to peptidy ani ochranné skupiny. Porovnávací studie složitých peptidových sekvencí ukazuje, že metody využívající HATU musí být hodnoceny v plném kontextu reakčních podmínek. Samotné informace o použití HATU nepotvrzují úplnou konverzi, zachování stereochemie ani lepší profil znečištění.
6. Existuje jeden nejlepší činidlo pro spojování peptidů?
Ne. Neexistuje univerzální hodnocení činidel vhodných pro každý peptid a každou reakci. Přepětí sterických skupin, rozpustnost substrátu, agregace, stereochemická citlivost a kontext sekvence mohou mít vliv na výsledek. Výběr činidla by proto měl vycházet z naměřených výsledků pro konkrétní reakci, nikoli pouze z jeho reputace nebo popularity.
7. Znamenají „spojovací činidlo” a „doplňková látka” to samé?
Ne. Tyto termíny mohou popisovat různé funkce v systému spárování. Aktivátor spárování může přímo účinkovat na aktivaci, zatímco přídavný produkt může ovlivňovat vznik vedlejších produktů, účinnost reakce, stereochemickou integritu nebo konkurenční chemické dráhy. Proto je třeba analyzovat celý reakční systém a nepovažovat všechny jeho složky za výměnné substituty.
8. Je možné spárovat celé fragmenty peptidů namísto jednotlivých aminokyselin?
Ano. Reakce spojená s vazbou může spojovat větší stabilní peptidové fragmenty a ne pouze jednotlivé aminokyseliny. Zvýšení velikosti reagujících komponent však nezbavuje potřebu kontrolovat selektivitu místa reakce, stereochemii ani konečnou charakteristiku produktu. V případě spojených fragmentů jsou stále potřebné údaje potvrzující, že správné spojení skutečně vzniklo správným způsobem.
9. Jaký je rozdíl mezi rasemizací a epimeryzací?
Racemizace ve smyslu skutečného pojmu znamená ztrátu enantiomerické bohatosti směsi racemické, zatímco epimeryzace znamená změnu konfigurace jednoho stereogenního centra v molekule obsahující mnoho takových center. V literatuře týkající se syntézy peptidů se termín racemizace běžně používá pro popis nežádoucích změn konfigurace aminokyselinových zbytkových skupin. Přesné označení by tedy mělo odpovídat skutečné struktuře změny.
10. Mohla by hmotnostní spektrometrie odhalit jakýkoli stereochemický chybový bod?
Ne. Stereoisomery mohou mít přesně stejnou molekulovou hmotnost. Získání očekávané hmotnosti tedy nepotvrzuje správnou konfiguraci každého stereogenního centra. Pro vyhodnocení těchto rozdílů mohou být potřebné další metody, například odpovídající chromatografické techniky nebo strategie derivace. Masová spektrometrografie zůstává mimořádně užitečným nástrojem charakterizace molekul, ale její výsledky je třeba interpretovat v souladu s omezeními konkrétního strukturního problému.
11. Znamená vznik aspartimidu prostě neúspěšné spájení?
Ne. Vytváření aspartimidu je samostatnou vedlejší reakcí spojenou s citlivými sekvencemi obsahujícími asparaginin. Na jeho vznik mohou mít vliv sousední zbytky a podmínky spojené s odstraňováním ochranných skupin. Nežádoucí strukturační změna tedy může nastat i v případě, že příslušný aminokyselina byla dříve správně přichycena. Určení původu znečištění je důležité, protože opakování spájení nemusí vyřešit problém vyplývající z úplně jiného vedlejšího postupu reakce.
12. Zaručuje opakování spárování úspěšnost reakce?
Ne. Opakování reakce může v některých případech zlepšit konverzi, ale nezaručuje, že všechny reaktivní místa budou zpřístupněna ani že ostatní vedlejší reakce budou eliminovány. Výsledek stále závisí na substrátu a použité metodě. Analýza produktu je tedy nutná k určení toho, co skutečně vedlo k dalšímu spárování.
13. Zlepšuje vyšší teplota vždy kvalitu spojení?
Ne. Zvýšení teploty může urychlit požadovanou reakci, ale může také urychlit nežádoucí chemické procesy. Zpřesňování rychlosti konverze by se proto nemělo automaticky interpretovat jako zlepšení chemické kvality. Teplota musí být hodnocena jak z hlediska vytvoření cílového produktu, tak z hlediska profilu vznikajících znečišťujících látek.
14. Potvrzuje ztráta volné aminové skupiny vznik správného peptidu?
Ne. Nedostatek zjištěné volné aminové skupiny odpovídá mnohem užším požadavkům týkajícím se konkrétní funkční skupiny za podmínek použitého testu. Samostatně nepotvrzuje kompletní sekvenci peptidu, jeho stereochémii ani čistotu. Monitorování volných aminových skupin může být užitečným prvkem kontroly procesu, ale nepodává náhradu za konečnou charakterizaci produktu.
15. Je čistota HPLC totéž jako účinnost spárování?
Ne. Čistota HPLC a účinnost popisují různé vlastnosti. Čistota HPLC je závislá na metodě popisu složení detekovaných látek z vzorku, zatímco účinnost se vztahuje na množství daného produktu získaného v poměru k definované množství vstupního materiálu. Oczkování může zvýšit chromatografickou čistotu a zároveň snížit množství získaného cílového produktu. Proto má procentní hodnota jen omezený význam, pokud není přesně uvedeno, co představuje.
16. Mohou se znečištění vyskytnout i po ukončení spáření?
Ano. Po ukončení syntézy vazby peptid obsahuje další chemické fáze. Odstraňování ochranných skupin, odstraňování a další úpravy mohou molekulu modifikovat nebo vést k vzniku dalších znečištění. To neznamená, že každé konečné znečištění vzniká v pozdějších fázích, ale ukazuje, proč správné vazby nejsou zárukou kvality konečného produktu.
17. Co činí srovnání metod spojování věrohodným?
Spolehlivé srovnání by mělo hodnotit alternativní metody pro stejný jasně definovaný cíl a za dostatečně srovnatelných podmínek. Mělo by uvádět použité substráty, fázi odběru vzorku, analytické metody a hodnocené typy znečištění, místo toho aby uvádělo nevyjasněnou procentní hodnotu nebo stavila na pověst činidla. Srovnání zahrnující několik různých modelových peptidů může poskytnout více informací než jediná vysoká účinnost získaná pro jednoduchý substrát, protože ukazují, jak se účinnost mění v závislosti na molekulárním kontextu. Ačkoli by závěry měly zůstat omezeny na skutečně zkoumané chemické systémy.
Souhrn
Spájení peptidů je základním prvkem chemické syntézy peptidů, protože vede k vzniku amidových vazeb spojujících aminokyselinové zbytky v peptidovém skeletu. Popisování spájení pouze jako „sjednocení dvou aminokyselin” však přehlíží významnou část chemie rozhodující o tom, zda získaný produkt skutečně je zamýšleným peptidem.
Lidský proteinový komplex obsahující karboxylovou skupinu obvykle potřebuje aktivaci, aby mohlo docházet k účinnému vytvoření amidového vazby. Ligninové vazebné činidla a přídavné látky mohou tento proces usnadnit, ale jejich účinnost závisí na substrátu, prostředí reakce a způsobu analytické interpretace výsledku. Proto je činidlo třeba analyzovat v plném experimentálním kontextu a ne klasifikovat je nezávisle na syntetizovaném peptidu.
Ochranné skupiny zajišťují další úroveň kontroly tím, že dočasně znemožňují nežádoucím funkčním skupinám účastnit se reakce. Jejich užitečnost závisí nejen na efektivním zabezpečení, ale také na možnosti selektivního odstranění a shodě s dalšími fázemi syntézy. Strategie zabezpečení a sousední aminokyselinové zbytky mohou také ovlivňovat vznik určitých vedlejších produktů.
Stereochemická integrita je další důležitým prvkem. Reakce sloučení může vést k vzniku amidového vazebného molekuly a zároveň generovat epimery. Protože epimér může mít stejnou molekulovou hmotnost jako vlastný peptid, samotná shoda hmotnosti nemusí potvrzovat plnou strukturální správnost. Změny konfigurace mohou také vznikat v dalších fázích, jako je například počáteční přichycení aminokyseliny ke fixní fázi.
Jiná znečištění vznikají pomocí odlišných mechanismů. Neúplné sjednocení může vést k vzniku delečních nebo zkrácených sekvencí, zatímco reakce spojené s aspartimidem mohou modifikovat peptid obsahující již správné aminokyselinové zbytky. Zrychlení procesu může mít vliv jak na požadované reakce, tak na vedlejší dráhy, a další znečištění mohou vznikat také během pozdějších etap, jako je odštěpování.
Z těchto důvodů hodnocení vazby peptidů vyžaduje něco víc než pouze zjištění, zda vstupní materiál zmizel.
Konverze, tvorba cílového produktu, izolace výkonnosti, chromatografická čistota a stereochemická čistota odpovídají různým otázkám.
Testy prováděné během syntézy mohou pomoci při detekci neúplných reakcí, ale samy o sobě neposkytují potvrzení úplné struktury peptidu. Chromatografie a hmotnostní spektrometrie poskytují vzájemně se doplňující informace, zatímco otázky týkající se stereochemie nebo velmi podobných struktur mohou vyžadovat další analytické metody.
Nejúčinnější přístup k spojování peptidů je tedy cílený na konkrétní částici a založený na datech.
Použitelná metoda sběrného procesu není pouze metodou využívající nejznámější nebo nejaktivnější činidlo. Jedná se o metodu, která opakovaně vede k vytvoření zamýšleného molekulárního spojení při současném zachování odpovídající stereochemické integrity a kontrole významných znečištění pro konkrétní syntetizovaný peptid.
Odkazy
- Subirós-Funosas, R., Prohens, R., Barbas, R., El-Faham, A., & Albericio, F. (2009). Oxyma: účinný aditiv pro syntézu peptidů k nahrazení HOBt a HOAt na bázi benzotriazolu s nižším rizikem výbuchu. Chemie—A European Journal, 15(37), 9394–9403. https://doi.org/10.1002/chem.200900614
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Studie racemizace při syntéze peptidů prostřednictvím separace chráněných epimerních peptidů pomocí reverzní fáze s vysokou výkonností kapalinové chromatografie. Mezinárodní časopis pro peptidové a proteinové výzkum, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Hodnocení kombinovaného použití Oxymy a HATU při agregaci peptidových sekvencí. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Jad, Y. E., Khattab, S. N., de la Torre, B. G., Govender, T., Kruger, H. G., El-Faham, A., & Albericio, F. (2014). Oxyma-B, vynikající inhibitor racemizace při syntéze peptidů. Organická a biomolekulární chemie, 12(42), 8379–8385. https://doi.org/10.1039/c4ob01612b
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Syntéza peptidů ve pevných fázích: Od standardních postupů k syntéze složitých sekvencí. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Problém aspartimidu v SPPS založeném na Fmoc. Část I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Problém aspartimidu v SPPS založeném na Fmoc. Část II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Použití Marfeyova činidla k kvantifikaci racemizace při navázání aminokyselin na pevnou bázi pro syntézu peptidů. Analytická biochemie, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Omezování racemizace a tvorby aspartimidu při mikrovlnné syntéze pektidů na pevných bázi s Fmoc. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzendimetanethiol (1,4-BDMT) jako prostředek k neutralizaci fragmentací zelenější peptidové pryskynečné hmoty. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). Charakterizace surových produktů z pektidu získaného syntézou pektidu v pektidu pomocí hmotnostní spektrometrie s mu-HPLC/rychlým atomovým bombardováním. Peptidová výzkumná skupina, 4(1), 40–46. PubMed