Die Festphasenpeptidsynthese, am häufigsten als SPPS (Solid-Phase Peptide Synthesis) bezeichnet, ist eine chemische Methode zur Synthese von Aminosäurepeptiden, wobei der eine Endpunkt des entstehenden Rückstrahls chemisch mit einem unlöslichen Träger verbunden bleibt.
Anstatt den entstehenden Peptid nach jeder Reaktion zu isolieren, lassen Chemiker ihn an die Festphase anbinden und führen dabei weitere flüssige Reagenzien und Waschlösungen ein und entfernen sie. Durch wiederholte Zyklen kann die aktive Aminogruppe freigelegt, ein weiterer Aminosäureteil hinzugefügt und die nicht mehr benötigten löslicheren Bestandteile entfernt werden. Nachdem die geplante Aminosäuresequenz aufgebaut ist, kann der Peptid mit dem Träger getrennt und anschließend einer weiteren Behandlung und Analyse unterzogen werden.
Diese Prozessorganisation ist einer der Hauptgründe dafür, dass SPPS in der Peptidechologie zu einer so wichtigen Methode geworden ist. Die Festphasenreduktion vereinfacht die Durchführung vieler wiederholbarer chemischer Reaktionen und ermöglicht die Automatisierung der Synthese.
Die Bequemlichkeit der Synthese in der Festphase bedeutet jedoch keine Garantie für die chemische Vollkommenheit.
Die Anbindung des entstehenden Peptids an das Trägermaterial garantiert nicht, dass jeder einzelne Kettenstrang alle geplanten Aminosäuren erhält. Es bedeutet auch nicht, dass das Material am Ende des Prozesses chemisch rein ist oder eine korrekte Struktur aufweist.
Die Anordnung des Kohlenstoffkettenverbundes, die Entfaltung und Wiederherstellung des Produkts, die Reinigung, die Identitätsbestätigung und die endgültige strukturelle Charakterisierung sind separate Teile des gesamten Prozesses.
Moderne methodologische Publikationen zeigen sowohl die Nützlichkeit von SPPS als auch die Notwendigkeit, Standardmethoden bei schwierigen Sequenzen zu modifizieren. In einer der veröffentlichten Methoden, die eine Fmoc-Strategie verwenden, wird beispielsweise eine routinemäßige Synthese beschrieben, aber auch ein modifiziertes Vorgehen für peptidgehaltige Sequenzen beschrieben, die aggregieren können. [1]
Das Verständnis von SPPS erfordert also mehr als die Erinnerung an die einzelnen chemischen Schritte. Man muss auch wissen, was das Ziel jedes Schrittes ist, was während des Schrittes falsch gehen kann und welche analytischen Fragen nach dessen Abschluss noch beantwortet werden müssen.
Was ist die Synthese von Peptiden in der festen Phase?
Der entstehende Peptidrest bleibt verbunden, die Lösung verändert sich
In der konventionellen SPPS wird der Peptid chemisch an kleine, nicht-löslich in Wasser lösliche Partikel, die normalerweise als Harzpartikel bezeichnet werden, mit einem entsprechenden chemischen Bindemittel verbunden.
Die Körner bleiben im Reaktionssystem, während weitere flüssige Reaktionsprodukte und Lösungsmittel durchströmt werden und entfernt werden.
Dies vereinfacht die wiederholte Synthese erheblich.
In der klassischen, etapweisen Synthese kann die Isolierung und Reinigung des wachsenden Peptids nach jedem Aminosäurezugang in einem Lösungsmittel eine Herausforderung darstellen. In SPPS bleibt der entstehende Kettenstrang mit der unlöslichen Phase verbunden. Dadurch können lösliche Überschüsse an Reagenzien und viele Nebenprodukte durch Waschen entfernt werden, während der mit dem Bindemittel verbundene Peptid an Ort bleibt.
Der Begriff „Stabile Phase” kann jedoch zu Missverständnissen führen.
Das bedeutet nicht, dass die Bildung von Peptidbindungen ohne die Beteiligung von Flüssigkeit oder Lösungsmittel stattfindet.
Die Harzmasse ist in der Regel von einer flüssigen Reaktionsflüssigkeit umgeben und ihre Reaktion mit dem Lösungsmittel kann die Synthese erheblich beeinflussen. Die Reaktionsprodukte müssen weiterhin in oder um das polymere Medium wandern und in die reaktiven Stellen des wachsenden Proteins gelangen.
Die Bindung eines Peptids an ein Trägermaterial erfolgt in der Regel kovalent. Dies bedeutet, dass die entstehende Verbindung durch eine chemische Bindung mit dem Träger verbunden wird.
Der Peptidmolekül ist also nicht einfach zwischen den Partikeln eingeschlossen, sondern wird durch einen Filter festgehalten oder lose auf der Oberfläche anhaftet.
Diese chemische Verbindung wird gezielt so gestaltet, dass der entstehende Kettenreaktor während der weiteren Reaktionen und beim Abwaschvorgang verbunden bleibt und später unter den entsprechenden Bedingungen freigesetzt werden kann.
Die konventionelle Synthese verläuft von dem C-Ende in Richtung des N-Endes.
Die klassische lineare SPPS-Strategie beginnt normalerweise mit einem Aminosäuretyp, der im fertigen Peptid den C-Ende bildet.
Der Rest wird an das Trägermaterial angeschlossen.
Nachdem die entsprechende reaktive Aminogruppe freigegeben wurde, wird ein weiterer abgesicherter Aminosäuremolekül hinzugefügt und chemisch an den entstehenden Kettenstrang angefügt. Die Wiederholung dieses Prozesses verlängert den Peptidstrang allmählich in Richtung des N-Endes.
Es ist wichtig, diesen Weg hervorzuheben, da er sich von der biologischen Protein-Synthese durch die Ribosomen unterscheidet.
Die ribosomale Synthese verlängert das Polypeptid von der N-Ende in Richtung der C-Ende. Eine konventionelle sequentielle SPPS baut normalerweise die Sequenz in die entgegengesetzte Richtung auf.
Die endgültige Aminosäuresequenz kann jedoch identisch sein. Der Aufbau ist jedoch unterschiedlich.
Es ist wichtig, die Bezeichnung „konventionell” zu verwenden, da die Chemie von Peptiden auch spezialisierte Strategien umfasst, die alternative Bindungsstellen nutzen, Fragmentierungsprozesse, Ligationsreaktionen und andere nicht standardisierte Lösungen.
Die Beschreibung des Weges von C- bis N-Ende bezieht sich daher auf den typischen, schrittweisen Prozess der SPPS und nicht auf alle möglichen Methoden der Peptidechmie, die die Festphasen verwenden.
SPPS ist nur ein Element der Peptidherstellung.
Die Synthese in der Festphase ist nicht die einzige Möglichkeit, Peptide zu erhalten.
Peptide können auch durch chemische Synthese in einer Lösung hergestellt werden, biologische Expressionssysteme, enzymatische Umwandlungen, Ligierung von Fragmenten oder Kombinationen verschiedener Methoden.
SPPS ist besonders nützlich, wenn eine kontrollierte Sequenzierung erforderlich ist und die Verwendung sicherer, modifizierter oder anderer spezieller Aminosäurebausteine erforderlich ist.
Selbst bei einem einzigen Projekt, das sich auf einen bestimmten Peptid unterscheidet, muss man nicht immer die gleiche Methode von Anfang bis Ende anwenden.
Einzelne Fragmente eines Peptids können beispielsweise auf einer Harzmatrix synthetisiert, separat gereinigt und anschließend mithilfe einer anderen chemischen Methode verbunden werden. Andere Moleküle können bereits nach Erhalt der ursprünglichen linearen Sequenz eine Faltung, Oxidation, Cyclisierung oder weitere strukturelle Umwandlungen erfordern.
Die Wahl des richtigen Weges hängt daher von der Zielmolekülart, ihrer strukturellen Komplexität sowie den analytischen und qualitativen Anforderungen des Projekts ab.
Der Prozess lohnt es, als eine Reihe weiterer Fragen zu betrachten.
Die Anbindung an das Medium legt den Anfangspunkt fest und beeinflusst die spätere Chemikalieabgabe des Produktes. Es muss jedoch weiterhin festgestellt werden, ob die Anbindung ordnungsgemäß erfolgte und die stereochemische Integrität erhalten geblieben ist.
Das Anlegen des Rückens soll dazu führen, dass die Aminosäuren in der geplanten Reihenfolge verbunden werden. Anschließend muss jedoch überprüft werden, ob alle Rückensketten richtig reagiert haben und ob keine Sequenzen mit fehlenden Aminosäuren, verkürzten oder modifizierten Produkten entstanden sind.
Die Abtrennung und Entfernung der Schutzgruppen sollen den Peptid freisetzen und bestimmte chemische Absperrungen beseitigen. Die tatsächliche Freisetzung des Produkts selbst sagt jedoch nicht, welche anderen Substanzen im Rohmaterial enthalten sind.
Die Reinigung dient dazu, das gewünschte Material von unerwünschten Bestandteilen zu trennen, aber selbst die gereinigte Fraktion erfordert weiterhin eine Bestätigung der Identität und eine Qualitätsbewertung.
Die endgültige strukturelle und analytische Charakterisierung soll jedoch die Frage beantworten, ob das isolierte Material die für den Zielpeptid erwarteten chemischen Eigenschaften aufweist und ob die angewandten analytischen Methoden für die angestrebte Anwendung geeignet sind.
Dies sind konzeptionelle Phasen und keine Laboranweisungen. Die spezifischen Reagenzien, Geräte und Reaktionsbedingungen hängen vom Zielpeptid ab und erfordern eine entsprechend entwickelte und validierte Methode.
Anschließen an die Harzmasse und Anlegen des Kettenrades
Harz, Kleber und Haftvermögen erfüllen unterschiedliche Funktionen
In Diskussionen über SPPS kommen oft drei Begriffe vor: Harz, Verbindungsmittel und Lasteinsatz, also Loading.
Sie beschreiben verknüpfte, aber unterschiedliche Eigenschaften.
Harz ist ein unlösliches Material, das als Träger dient.
Der Ligand stellt eine chemische Verbindung zwischen diesem Träger und dem Peptid oder der ersten Aminosäureresten her. Seine chemische Struktur kann sowohl auf die Art der Bindung des Peptids als auch auf seine spätere Freisetzung einwirken.
Loading beschreibt hingegen die Anzahl der aktiven Anschlussstellen bezogen auf die Menge des Trägers.
Diese Begriffe sind keine Synonyme.
Zwei Harze können physisch sehr ähnlich aussehen und gleichzeitig unterschiedliche funktionelle Gruppen, Bindungen oder Verknüpfungsebenen aufweisen. Diese Unterschiede können die Verfügbarkeit reaktiver Stellen beim Verknüpfungsprozess, die Verformbarkeit der Harze sowie die chemische Struktur des endgültigen Peptids nach dem Abspaltungsprozess beeinflussen.
Ein weiterer wichtiger Punkt ist die geplante Gruppe am C-Ende.
Verschiedene Träger-Bindungs-Systeme können beispielsweise so ausgewählt werden, dass ein Peptid mit einer Carboxyl- oder Amidgruppe enden soll.
Dies ist eine wichtige chemische Differenz.
Eine Änderung der Terminalgruppe bedeutet eine Änderung der eigentlichen Teilchenstruktur, und zwar nicht nur der Art ihrer Verpackung oder Beschreibungen.
Das Verkleben beeinträchtigt den Zugang zu den angeschlossenen Ketten.
Viele in SPPS verwendete Harze absorbieren den Lösungsmittel und weichen bei Kontakt mit dem entsprechenden flüssigen Medium auf.
Dies verändert das polymere Umfeld und kann die Fläche vergrößern oder verkleinern, über die die gelösten Reagenzien sich bewegen müssen, um zu den mit der Verbindung verbundenen Peptidketten zu gelangen.
Das Verformungsproblem ist also nicht nur eine physikalische Besonderheit.
Es kann die Verfügbarkeit reaktiver Gruppen während der Synthese beeinflussen.
Eine systematische Untersuchung von Polystiren- und PEG-basierten Trägermaterialien ergab, dass Eigenschaften wie die Art des Bindemittels und der Grad der Verklebung der Harzmasse eine signifikante Beeinflussung des Schrumpfs bei den untersuchten umweltfreundlicheren Lösungsmitteln aufwiesen. Es wurde außerdem festgestellt, dass der Schrumpf sich während der Entfernung der Schutzgruppen und im Zuge einer Verlängerung des Peptidkettenlängens ändern kann. [2]
Dies zeigt, dass die Verhaltensweisen der Harzverbindung nicht immer als seine konstante Eigenschaft betrachtet werden können.
In der Praxis hängt es von der Zusammenarbeit zwischen Harz, Lösungsmittel, Bindemittel, dem angegliederten Peptid und dem aktuellen Syntheseverlauf ab.
Ein gutes Verfestigungspotenzial oder ein günstiger Verlauf der Reaktion für eine bestimmte Kombination von Harz, Lösungsmittel und Peptid bedeutet also nicht, dass eine andere Kombination identisch verhalten wird.
Auch der Anschluss selbst erfordert Qualitätskontrolle.
Der erste Stufen der Anbindung mag zunächst einfach erscheinen, da der Peptidkettenstrang erst erst entsteht.
Ein Fehler, der in diesem Stadium eingetragen wurde, kann jedoch auch bei der späteren Synthese weiterhin vorhanden sein.
Wenn die erste Restgruppe falsch angeschlossen wird oder während dieses Prozesses ihre stereochemische Struktur verändert wird, muss die korrekte Anbringung aller weiteren Restgruppen das ursprüngliche Problem nicht beheben.
In einer Studie aus dem Jahr 1992 wurde eine analytische Methode entwickelt, die speziell zur Messung der Racemisierung bestimmt ist, die während der Anbindung von gesicherten Aminosäuren an feste Träger auftritt. [3]
Die Bedeutung dieser Arbeit geht über die angewendete analytische Methode hinaus.
Dies zeigt, dass die stereochemische Qualität eine Kontrolle noch vor Beginn der wiederholten Verlängerungszyklen des Kettenlängens kann erfordern.
Auch die Menge an Material, das ursprünglich auf die Trägerplatte angebracht wurde, erfordert eine richtige Interpretation.
Der nominelle Harz-Anreicherungswert, der experimentell gemessene Ladevorgang, die Menge an Rohmaterial, die nach dem Abspaltungsprozess wiederhergestellt wird, sowie die endgültige Ausbeute des isolierten und gereinigten Peptids sind unterschiedliche Größen.
Sie sollten nicht als alternative Indikatoren für den Erfolg der Synthese betrachtet werden.
Längere Ketten können immer schwerer zu bekommen sein
Je länger der Peptidkettenstrang ist, desto stärker beginnt die einzelne Verbindung, ihre chemische Umgebung zu beeinflussen.
Die benachbarten Ketten können sich gegenseitig durch Wasserstoffbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und andere intermolekulare Kräfte beeinflussen. Einige Sequenzen können eine besonders starke Tendenz zu solchen Wechselwirkungen aufweisen.
Dies kann den Zugang zu reaktiven Gruppen einschränken.
In einem solchen Fall kann die Anbindung des nächsten Aminosäures schwieriger werden, selbst wenn dem System anscheinend eine ausreichende Menge des Liganden zugesetzt wurde.
In einer Studie zu schwierigen, aggregierbaren Sequenzen wurden verschiedene Kombinationstechniken verglichen und die erhaltenen Rohprodukte analysiert. Die Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass der Prozess an die spezifische Sequenz angepasst werden sollte, anstatt die Annahme zu machen, dass es eine einzige Kombinationstrategie gibt, die immer die beste ist. [4]
Dies erklärt auch, warum eine alleinige Erhöhung der Viskositätszahl der Harzmasse oder der Menge des Reagens nicht automatisch alle Probleme löst.
Wenn das grundlegende Problem die eingeschränkte Verfügbarkeit von Reaktionszonen ist, wird die Frage, ob das zugesetzte Reagenz tatsächlich an die richtigen Stellen gelangt ist und ob die Reaktion effizient ablief, ohne unerwünschte Nebenprodukte zu bilden, wichtiger als die Frage nach der Menge des zugesetzten Reagens.
Sicherung, Entfernen von Schutzgruppen und Zusammenfügen
Schutzgruppen überwachen den Ort der Reaktion
Aminosäuren enthalten chemische Gruppen, die in verschiedenen Reaktionen beteiligt sein können.
Bei der kontrollierten Bindung eines Peptids wollen Chemiker in der Regel sicherstellen, dass eine bestimmte Aminogruppe mit einem bestimmten Block reagiert, der eine Carboxylgruppe enthält, während andere potenziell reaktive Stellen zeitweise inaktiv bleiben.
Genau diese Gruppen dienen dazu.
Sie blockieren vorübergehend ausgewählte Reaktivierungsstellen und lassen so ein anderes Ort teilnehmen an der geplanten Reaktion.
In der allgemein verwendeten SPPS-Strategie, die auf Fmoc basiert, bleibt die endgültige Aminogruppe des wachsenden Rückgratstrangs zwischen den weiteren Bindungsschritten gesichert. Wenn der nächste Aminosäureteil hinzugefügt werden soll, wird die vorübergehende Schutzgruppe entfernt, wodurch die Aminogruppe sichtbar wird.
Reaktive Seitenketten können separate Schutzgruppen enthalten, die so gestaltet sind, dass sie während der wiederholten Zyklen der Hauptkettenaufbauung unverändert bleiben.
Ziel ist eine kontrollierte Selektivität.
Der entsprechende Block mit der Carboxylgruppe sollte sich mit der entsprechenden Amingruppe verbinden, anstatt zu unkontrollierten Verzweigungen oder anderen konkurrierenden Reaktionen zu führen.
Orthogonalität bedeutet die Möglichkeit, Sicherungen selektiv zu entfernen.
Eine orthogonale Strategie von Schutzgruppen ermöglicht die Entfernung einer Schutzgruppe unter den Bedingungen, dass andere notwendige Sicherheitsmaßnahmen in ausreichendem Maße unversehrt bleiben.
Dies ermöglicht dem Chemiker, verschiedene reaktive Stellen in den einzelnen Phasen der Synthese kontrolliert freizulegen.
Fmoc und Boc sind in der Peptidchemie wohlbekannte Begriffe, aber sie beschreiben weder verschiedene Arten von Peptidbindungen noch verschiedene endgültige Peptidstrukturen.
Es handelt sich um Schutzgruppen, die mit verschiedenen Synthesestrategien und verschiedenen Methoden ihrer Entfernung verbunden sind.
Die temporäre chemische Struktur, die bei der Herstellung eines Peptids verwendet wird, muss daher von seiner endgültigen Struktur unterschieden werden.
Die Vorsichtsmaßnahmen bieten auch keine vollständige Schutz vor allen möglichen Nebenwirkungen.
Forschungsergebnisse zur Bildung von Aspartimid zeigen beispielsweise, dass die Sicherungstrategie, die benachbarten Aminosäuresequenzen sowie die Bedingungen für die Entfernung der Schutzgruppen Einfluss auf die Bildung von Verunreinigungen haben können, selbst bei gut bekannten SPPS-Methoden [5] [6].
Die Strategie der Schutzgruppen beschränkt daher bestimmte unerwünschte Reaktionen, eliminiert jedoch nicht die Notwendigkeit einer Prozesskontrolle oder der endgültigen analytischen Charakterisierung.
Die Verbindung bildet ein weiteres Amidbindungspunkte im Peptid-Schädel.
Die Bindungsreaktion führt zur Bildung eines weiteren Amidbindungsmoleküls im Peptid-Schädel.
Der Aminosäureraster, der eine Carboxylgruppe enthält, wird normalerweise chemisch aktiviert, um in der Lage zu sein, effektiv mit der freiliegenden Aminogruppe des wachsenden, mit der Matrix verbundenen Proteins zu reagieren.
Nach Abschluss der Verbindung kann der lösliche überschüssige Stoff durch Waschen entfernt werden.
Der neu hinzugekommene Aminosäure wird dann die letzte Restgruppe des wachsenden Rückens. Anschließend kann seine Aminogruppe freigelegt und der nächste Bindungsszyklus begonnen werden.
Theoretisch ermöglicht die Wiederholung dieser Sequenz die Kontrolle der Aminosäurefolge durch die Steuerung der Reihenfolge der Einbringung der Bausteine.
In der Praxis gibt es jedoch eine sehr wichtige Einschränkung:
Die geplante chemische Reaktion muss in jedem Zyklus tatsächlich korrekt ablaufen.
Wenn eine Verbindung unvollständig ist, kann ein Teil der Ketten die geplanten Restteile nicht erhalten.
Wenn sie an der Harzbindung bleiben und im nächsten Zyklus richtig reagieren, können sekvenielle Deletionen entstehen, d. h. Peptidmoleküle, die einen oder mehrere geplanten Aminosäuren fehlen.
Andere Ketten können verkürzt bleiben.
Die Waschung entfernt löslich lösliche Reagenzien und Nebenprodukte, eliminiert jedoch nicht selektiv alle unordentlich gebildeten Ketten, die weiterhin kovalent mit dem Träger verbunden sind.
Kleinere Verluste können sich in mehreren Zyklen addieren.
Die wiederkehrende Art der SPPS führt zu einem wesentlichen mathematischen Problem.
Eine kleine Unzulänglichkeit in einem einzelnen Schritt mag unwichtig erscheinen, aber nach vielen Wiederholungen kann ihre Wirkung sich summieren.
Nehmen wir ein einfaches mathematisches Beispiel.
Wenn die Synthese eines Peptids 50 Bindungsschritte erfordern würde und jedes dieser Schritte unabhängig 99 -Prozentsätze der richtigen Bindung hätte, wäre der theoretische Anteil der Moleküle, die alle 50 Schritte erfolgreich durchlaufen hätten, etwa 60,5%.
Dies ist lediglich eine Illustration.
Sie geht davon aus, dass alle Phasen identisch und unabhängig voneinander verhalten sich. Sie berücksichtigt keine Probleme mit der Entfernung von Schutzgruppen, Nebenwirkungen, Verluste beim Abspaltungsprozess und der Reinigung, Aggregationen oder viele andere reale Faktoren.
Man sollte daher dieses Ergebnis nicht als Vorhersage der tatsächlichen Produktionsleistung interpretieren.
Der Fallbeispiel zeigt nur, warum selbst eine sehr hohe Effizienz einzelner Schritte nicht zu einem chemisch einfachen Rohprodukt nach mehreren Dutzend Wiederholungen führt.
Deshalb sind die Überwachung der Synthese und die Kontrolle der Verunreinigung während des gesamten Prozesses der Peptid-Anfertigung wichtig, und nicht erst nach dem Hinzufügen des letzten Aminosäures.
Automatisierung, Heizung und andere technologische Lösungen können die Synthese beschleunigen, aber die Geschwindigkeit des Prozesses sollte immer zusammen mit der Produktqualität bewertet werden.
Eine Studie über SPPS mit Mikrowellenunterstützung untersuchte die relativen Rest-Reaktionsraten sowie die Bildung von Aspartimid und zeigte, warum die Reaktionsbedingungen weiterhin an die Eigenschaften der jeweiligen Sequenz angepasst werden müssen. [7]
Abspaltung und Wiederaufarbeitung des Rohprodukts
Die Abtrennung befreit das Produkt vom Träger.
Nach dem Aufbau der geplanten Peptidsequenz wird die Verbindung normalerweise chemisch von dem Träger getrennt.
Dieser Schritt wird als Cleavage bezeichnet, also die Trennung.
Die Abtrennung unterbricht die gezielt entworfene chemische Verbindung zwischen dem Peptid und dem Träger.
Je nach angewendeter Strategie kann die Abspaltung gleichzeitig mit dem Entfernen von Teilen oder allen Gruppen der Schutzgruppen der Seitenketten erfolgen. In anderen Prozessen kann das Peptid oder sein Fragment bei Beibehaltung einiger Sicherungselemente freigesetzt werden, wenn weitere chemische Umwandlungen geplant sind.
Die geeignete Freisetzungskemie hängt von dem Bindemittel und der Zielmolekülart ab.
Die Bedingungen, die einen einzelnen Peptid effektiv freisetzen, können eine chemisch empfindliche Gruppe in einem anderen zu beschädigen vermögen.
Deshalb beschreibt die Deschlebung einen chemischen Zweck und nicht eine universelle Reihe von Reagenzien oder Bedingungen, die für alle Peptide geeignet sind.
Ebenso bewirkt die korrekte Struktur des Peptid-Schalensystems nicht, dass alle Schutzgruppen anschließend wirksam entfernt wurden.
Das Anlegen des Kettenrings und die abschließende Entfernung der Sicherungen beantworten verschiedene chemische Fragen und erfordern eine separate Bewertung.
Die Bedingungen der Entsorgung können die Schadstoffprofile beeinflussen
Die Enttrennung muss nicht ein chemisch neutraler Schritt sein.
Das Entfernen von Schutzgruppen und das Lösen des Peptids von dem Träger kann zu reaktiven chemischen Formen führen, die in der Lage sind, das Peptid oder andere Bestandteile der Mischung zu modifizieren.
Deshalb können in den entwickelten Methoden sogenannte Scavengers eingesetzt werden, d. h. Verbindungen, die bestimmte unerwünschte Reaktionsprodukte aufnehmen und die Bildung von Nebenprodukten beeinflussen.
In einer Studie aus dem Jahr 2019 wurden verschiedene Scavengers bei der Abtrennung von Exenatid aus einer peptidischen Harzmatrix analysiert und festgestellt, dass ihre Wahl die Qualität des Rohprodukts sowie das beobachtete Verunreinigungsprotokoll beeinflusste. [8]
Auf dieser Grundlage sollte keine universelle Rezeptur für die Entschädigung erstellt werden.
Die Studie zeigt jedoch, dass die Bedingungen dieses Schrittes die Produktqualität beeinflussen können und daher für den jeweiligen Peptid und das verwendete Schutzgruppen-System separat bewertet werden sollten.
Ein korrekter Entschäumerprozess hat daher mehrere Dimensionen.
Der Peptidmolekül muss entsprechend abgetrennt werden, die erforderlichen Schutzgruppen müssen entfernt werden, das Zielmaterial muss wiederhergestellt werden und unerwünschte chemische Umwandlungen müssen kontrolliert werden.
Die Wiederherstellung des Rohprodukts ist keine endgültige Reinigung.
Nach der Abtrennung wird ein Verfahren durchgeführt, das die Trennung des Peptids enthaltenden Materials von der festen Harzmasse sowie von den übrigen Bestandteilen der Reaktionsmischung ermöglicht.
Hierbei können Unterschiede in der Löslichkeit, Verflüssigungstemperatur oder anderen chemischen Eigenschaften genutzt werden.
Die Wiederentdeckung sichtbarer Ablagerungen oder Fraktionen, die Peptid enthalten, beweist jedoch nicht, dass das Material ausschließlich aus dem gewünschten Produkt besteht.
Zu diesem Zeitpunkt wird normalerweise von einem sauren Peptid gesprochen.
Es kann die Zielmolekül zusammen mit selektiven Sequenzen, verkürzten Ketten, chemisch modifizierten Peptiden, unvollständig abgespaltenen Strukturen, Reagenzien und anderen Verunreinigungen enthalten.
Die Bedeutung der einzelnen Verunreinigungen hängt von der Sequenz, den Syntheegebieten und der vorgesehenen Anwendung ab.
In einer Studie wurde der chromatographische Abschnitt mit Massenspektrometrie kombiniert, um die Rohprodukte SPPS zu charakterisieren und die einzelnen chromatographischen Peaks an bestimmte Peptide zu koppeln. [9]
Dies zeigt, warum Informationen, die durch separative und strukturelle Methoden gewonnen werden, sich gegenseitig ergänzen.
Chromatographie kann die Anwesenheit vieler Bestandteile nachweisen, während Massenspektrometrie zusätzliche Informationen liefern kann, die helfen, festzustellen, was einige dieser Bestandteile sein können.
Reinigungs- und Identitätsbestätigung beantworten verschiedene Fragen
Die Reinigung zielt darauf ab, die Zielmolekül zu veredeln oder sie von anderen Bestandteilen zu isolieren.
Die Identifizierung beantwortet hingegen die Frage, ob das isolierte Material tatsächlich die erwarteten chemischen Eigenschaften aufweist.
Diese Fragen decken sich teilweise, aber sie sind nicht identisch.
Ein gut verteiltes Chromatogramm ist nicht automatisch ein vollständiges Beweis für die Struktur der Teilchen.
Ebenso ist die Erzielung der erwarteten Teilchenmasse selbst nicht die vollständige Beurteilung der Reinheit oder der strukturellen Genauigkeit.
Verwandte Varianten der Sequenz, Stereoisomere oder chemisch modifizierte Formen können schwer zu unterscheiden oder zu isolieren sein.
Die Reinigungsmethode sollte daher im Hinblick auf die tatsächliche Mischung bewertet werden, die bei der jeweiligen Synthese entsteht, und nicht nur deshalb als ausreichend anerkannt werden, weil sie bei einem anderen Peptid funktioniert hat.
Wenn die endgültige Substanz auch die Bildung von Disaccharidbrücken, Cyklisierung oder eine andere Transformation nach dem Abschluss der Kettenbildung erfordert, ergeben sich weitere analytische Fragen zur Korrektheit der Verbindungen, zur Strukturanpassung und zur Frage, ob tatsächlich die gewünschte reife Form der Substanz erhalten wurde.
Vorteile, Einschränkungen und Ursachen von Verschmutzung
Warum ist SPPS so weit verbreitet?
Eine der wichtigsten Vorteile von SPPS ist die Möglichkeit, den entstehenden Peptidmolekül auf einem Träger zu halten, während die flüssigen Reagenzien mehrmals ausgetauscht werden.
Dies vereinfacht wiederholbare chemische Prozesse und ermöglicht die Automatisierung.
Chemiker können eine geplante Sequenz von Aminosäurebausteinen einsetzen, und sofern die Prozesschemie dies zulässt, auch einige nicht standardmäßige Aminosäuren und andere Modifikationen.
Moderne automatisierte Systeme zeigen, wie weit man diese Idee weiterentwickeln kann.
In einer Studie zur automatisierten Flusssynthese aus dem Jahr 2020 wurde beschrieben, wie man Proteinketten mit bis zu 164 Aminosäuresequenzen erhält. Nach einer späteren Reinigung und Faltung wurden funktionelle Materialien erhalten. [10]
Dies ist ein beeindruckender Beispiel für die Möglichkeiten der Technik.
Das bedeutet jedoch nicht, dass jede Sequenz mit einer Länge von 164 Resten – oder jeder langkettigen Peptid oder Protein – mit der gleichen Leichtigkeit erhalten werden kann.
Das bedeutet nicht auch, dass Reinigung und Strukturbiologie überflüssig werden.
Die Studie zeigt vielmehr, welche Ergebnisse mit einem sorgfältig entwickelten System für die passgenauen Moleküle erreicht werden können.
Die Automatisierung überwacht die Durchführung des Prozesses.
Es ist jedoch nicht in der Lage, eine ungeeignete Chemie in eine geeignete zu verwandeln.
Deshalb müssen die Leistung der Anlage, die Sequenz des Peptids und das Verhalten der einzelnen Moleküle insgesamt analysiert werden.
Wie entstehen typische Verschmutzungen?
Bei SPPS können mehrere verschiedene Wege zur Bildung von Verschmutzungen auftreten. Ihr Verständnis hilft dabei, zu erklären, warum endgültige analytische Untersuchungen weiterhin erforderlich sind.
Eine Deletion-Sequenz oder ein verkürzter Produktcode kann entstehen, wenn die geplante Aminosäureanbindung nicht erfolgreich erfolgt oder wenn das Wachstum des Rückgratproteins unterbrochen wird. Da der unvollständige Rückgratproteinstrang weiterhin an der Zellmembran angebunden bleiben kann, muss ein späterer Abfluss ihn nicht entfernen.
Epimerisierung bedeutet eine Änderung der stereochemischen Konfiguration des entsprechenden Zentrums. Dies hat analytische Bedeutung, da ein Epimer dieselbe nominelle Molekularmasse wie der eigentliche Peptid besitzen kann, gleichzeitig aber eine unterschiedliche räumliche Konfiguration aufweisen kann.
Produkte, die mit Aspartimid verbunden sind, können durch Folgereaktionen entstehen, die auf die Sequenz des Asparaginrestes zurückzuführen sind. Abhängig vom chemischen Verlauf kann mehr als eine Art dieser Produkte entstehen.
Das vollständige Entfernen von Schutzgruppen erfolgt dann, wenn die zu entfernende Gruppe mit der Moleküle verbunden bleibt. Der Peptid kann daher nominal eine erwartete Kettenlänge haben, aber weiterhin eine unkorrekte chemische Struktur aufweisen.
Modifikationen im Zusammenhang mit der Abspaltung können bei der endgültigen Freisetzung des Peptids oder bei der Entfernung der Schutzgruppen auftreten. Eine korrekte Kettenbildung garantiert daher nicht, dass der Peptid eine Abspaltung ohne Veränderungen durchläuft.
Unvollständige Aggregationsreaktionen können jedoch auftreten, wenn sich entstehende Ketten gegenseitig beeinträchtigen, wodurch der Zugang zu den Reaktionsstellen eingeschränkt wird. Die Zugabe ausreichender Menge des Reaktionsmittels in das Reaktionsgefäß garantiert nicht, dass jeder Reaktionspunkt physisch verfügbar und entsprechend reagiert.
Dies sind mögliche Wege der Entstehung von Verschmutzung.
Das bedeutet nicht, dass jede Partei, die mittels SPPS erhalten wird, alle genannten Arten von Fehlern enthalten muss.
Ihre Bedeutung in einer bestimmten Synthese wird anhand der Kenntnisse über den Prozess, analytischer Untersuchungen und der entsprechenden Qualitätskontrolle bestimmt.
Komplexe natürliche Peptide erfordern etwas mehr als die Wiederherstellung einer Sequenz.
Einige Peptide sind strukturell wesentlich komplexer als die lineare Aminosäuresequenz selbst.
Ein gutes Beispiel ist die Epidermis.
Die strukturelle Charakteristik der Epidermis zeigte die Anwesenheit vieler Schwefelringe sowie atypischer Reststoffe an. [11]
Eine Wiederherstellung der linearen Aminosäuresequenz wäre daher nicht ausreichend, um zu beweisen, dass eine echte, reife Epidermin erhalten wurde.
Diese Unterscheidung ist wichtig bei der Interpretation von Publikationen oder Suchanfragen bezüglich der Synthese der Epidermis in der Fixierungsphase.
Die Publikation kann einen linearen Vorläufer, einen Fragment, eine Analogie oder eine andere verwandte Struktur beschreiben, und nicht die vollständig synthetisierte Gesamtsynthese einer kompletten reifen Moleküle.
Die hier als [11] zitierten strukturellen Publikationen beschreiben die Charakteristik der Epidermis selbst; sie handelt nicht von ihrer vollständigen Synthese mittels SPPS.
Die Behauptungen über die vollständige Synthese müssen daher bezogen auf die tatsächliche Zielstruktur der Moleküle interpretiert werden, und nicht ausschließlich auf ihre lineare Aminosäuresequenz.
Die Leistung, Reinheit und Identität müssen getrennt dargestellt werden.
Die drei Begriffe, die in Diskussionen über die Synthese von Peptiden oft verwechselt werden, sind Leistung, Reinheit und Identität.
Eine große Menge wiederverwertetes Produkt muss nicht bedeuten, dass die Mehrheit dieser Materialien tatsächlich ein Peptid darstellt. Das Rohmaterial kann erhebliche Mengen an Verunreinigungen enthalten.
Eine ebenso hohe chromatografische Reinheit bestätigt nicht automatisch alle Aspekte der strukturellen Identität.
Selbst ein Peptid, dessen chemische Struktur genau charakterisiert wurde, erhält dadurch nicht automatisch eine bestätigte biologische, therapeutische oder klinische Anwendung.
Dies sind getrennte Fragen.
Eine verlässliche Beschreibung der Synthese sollte daher aufzeigen, welche Zielmolekül verwendet wurde, in welchem Stadium die Produktivität gemessen wurde, ob das analysierte Material roh oder gereinigt war und welche analytischen Daten zur Bestätigung der Strukturdaten verwendet wurden.
Dadurch können die Ergebnisse der Synthese auf eine zuverlässigere Weise interpretiert und verglichen werden.
Eine einzelne Prozentzahl oder Massenwert darf nicht in eine allgemeine Aussage über die „hohe Qualität” eines Peptids umgewandelt werden, ohne die Kenntnis darüber zu haben, was tatsächlich gemessen wurde.
Häufig gestellte Fragen
1. Warum wird in SPPS die konstante Phase verwendet?
Die Festphasenphase hält den entstehenden Peptidmolekül auf dem Träger, während lösliche Reagenzien, Nebenprodukte der Reaktion und fließfähige Lösungen wiederholt eingeführt und entfernt werden können. Dies vereinfacht erheblich die wiederholte Anfertigung des Peptidketts und ermöglicht die Automatisierung der Peptidsynthese, wie dies in den modernen Methoden der automatisierten Flusssynthese zum Beispiel deutlich erkennbar ist. [10] Der Träger garantiert jedoch weder, dass jede Reaktion ideal ablaufen wird, noch trennt er fehlerhaft aufgebauten, mit der Harzverbindung verbundenen Ketten von den richtigen. Seine wesentliche Vorteil ist die Verbesserung des Prozessablaufs. Chemische Selektivität, Reaktionskomplettheit, Reinheit und Strukturellität erfordern weiterhin eine separate Bewertung.
2. Beseitigt die Festphasen-Synthese die Notwendigkeit einer Reinigung?
Nein. Fehlende Peptidketten können während der Synthese an die Harzmatrix gebunden bleiben und anschließend zusammen mit dem gewünschten Produkt freigesetzt werden. Untersuchungen, die Rohprodukte aus SPPS mittels Chromatographie und Massenspektrometrie analysieren, zeigen, dass das Waschen während der Synthese und die abschließende Reinigung unterschiedliche Funktionen erfüllen. [9] Das Waschen entfernt vor allem die löslichen Bestandteile, die die Harzmatrix umgeben, während die Reinigung nach dem Abspaltungsprozess dazu dient, den gewünschten Peptid und nicht-peptidische Bestandteile zu trennen. SPPS vereinfacht die Zwischenprozesse, garantiert jedoch keine endgültige Reinheit.
3. Bedeutet „Stationäre Phase”, dass kein Lösungsmittel verwendet wird?
Nein. In einer konventionellen SPPS ist ein unlösliches Trägermaterial normalerweise umflossen mit flüssigen Reagenzien und Lösungsmitteln. Die Lösungsmittel beeinflussen die physikalische Umgebung der Harzmasse, unter anderem den Schrumpfgrad und die Eigenschaft, wie leicht Reagenzien in die verbundenen Ketten gelangen können. Experimentelle Studien haben gezeigt, dass das von dem Lösungsmittel abhängige Schrumpfen der Harze sowie chemische Veränderungen im Bindemittel, in der Verknüpfungstemperatur und in der Verlängerung des Kettenstrangs auftreten. [2] Daher bilden Harz und Lösungsmittel gemeinsam ein Reaktionsmedium.
4. In welche Richtung wächst das Peptid während der SPPS?
Die konventionelle sequentielle SPPS baut normalerweise den Peptidabschnitt von seiner C-Ende hin zum N-Ende auf. Der erste Aminosäure, der den C-Ende der fertigen Moleküle bilden soll, wird an das Trägermaterial angefügt, und die weiteren Resten verlängern den freigelegten Aminosäureende des Rückens. Veröffentlichte Methoden basierend auf Fmoc zeigen diesen typischen Ablauf. [1] Es gibt jedoch spezialisierte Methoden, die eine Festphasen-Phase verwenden und die anders ablaufen können.
5. Bedeuten Harz und Verbindungsmittel dasselbe?
Nein. Die Harzmasse ist ein unlösliches Trägermaterial, während der Bindemittel eine chemische Verbindung zwischen dem Träger und dem wachsenden Peptid darstellt. Die Funktionalität des Bindemittels kann unabhängig vom Polymer selbst die Verbindung, die Festigkeit und die spätere Freisetzung des Peptids beeinflussen. Studien zu Trägern, die bei der Synthese von Peptiden eingesetzt werden, zeigen, warum die Bezeichnung der Harzmasse allein möglicherweise nicht ausreicht, um das Verhalten des gesamten Systems zu beschreiben. [2]
6. Vergrößert der höhere Grad der Verklebung der Harz immer die Produktion?
Nein. Ein höheres Loading bedeutet eine größere Anzahl möglicher Anbindungsstellen pro gewichteteinheit, aber es muss nicht zu einer größeren Anzahl richtig gebildeter und wiederherstellbarer Peptide führen. Der Loadinggrad kann die lokale molekulare Umgebung verändern und wurde experimentell als einer der Faktoren identifiziert, der das Verziehen der Harzmatrix auslöst. [2] Wenn die verbundenen Ketten übermäßig stark zusammengepresst oder stark miteinander interagieren, kann die Verfügbarkeit reaktiver Bindungsstellen beeinträchtigt sein. Der Loading muss daher zusammen mit den Eigenschaften der Harzmatrix, der Sequenzverlauf, der Reaktionsgeschwindigkeit und der Qualität des Endprodukts analysiert werden.
7. Warum werden Aminosäuren beim Anlegen eines Peptids abgesichert?
Schutzgruppen verhindern vorübergehend die Teilnahme ausgewählter Reaktionsgruppen an den Reaktionen, während eine spezifische Bindung entsteht. Dies ermöglicht eine kontrollierte, schrittweise Verknüpfung. Allerdings beseitigt die Schutzgruppe nicht alle Nebenreaktionen. Untersuchungen an Modellsystemen zeigten beispielsweise, dass die Schutzgruppenstrategie sowie die umgebende Sequenz Einfluss auf die Bildung von Aspartimid haben können.[5] Schutzgruppen bieten daher eine chemische Selektivität, aber die gesamte Strategie der Sicherung und Freisetzung erfordert weiterhin eine sorgfältige Planung und Bewertung.
8. Was bedeutet die orthogonale Absicherung funktionaler Gruppen?
Orthogonalität bedeutet die Möglichkeit, eine Schutzgruppe zu entfernen unter Bedingungen, die andere notwendige Sicherungen in ausreichendem Maße unversehrt lassen. Dies ermöglicht es, bestimmte Reaktionsorte in den geplanten Syntheseverfahren zu enthüllen. Festgestellte SPPS-Methoden basieren auf kontrollierter Sicherung und Entsicherung anstatt gleichzeitig allen aktiven Gruppen zu enthüllen. [1] Die tatsächliche Übereinstimmung der eingesetzten Sicherungen hängt jedoch weiterhin von der Zielmoleküle und den Reaktionsbedingungen ab.
9. Bedeuten Fmoc und Boc verschiedene Arten von Peptiden?
Nein. Fmoc und Boc sind Schutzgruppen sowie damit verbundene synthetische Strategien, und nicht verschiedene Arten von Peptidstrukturen. Unterschiede in der Chemikalie ihrer Entfernung beeinflussen die Art der Synthese, aber die temporäre Schutzchemie sollte nicht mit der endgültigen Struktur des Zielpeptids verwechselt werden. Die veröffentlichten Methoden auf der Grundlage von Fmoc zeigen einen der häufigsten Varianten der SPPS, aber das bedeutet nicht, dass jeder Peptid mit dieser Methode hergestellt werden muss. [1]
10. Kann bereits der erste Anschlussstadium eine Verunreinigung verursachen?
Ja. Die Anlagerungsprobe kann die stereochemische Qualität bereits vor Beginn des mehrfachen Verlängerns des Kettenrings beeinträchtigen. Analytische Methoden, speziell für die Bestimmung der Racemisierung bei der Anlagerung gesicherter Aminosäuren zu Harzen, wurden entwickelt. [3] Dies bedeutet nicht, dass jede Anlagerung eine signifikante Racemisierung verursacht. Es zeigt jedoch, dass die Anlagerung selbst ein chemisch wesentlicher Schritt ist, bei dem messbare Veränderungen auftreten können, die in der Gesamtauswertung der Qualität berücksichtigt werden müssen.
11. Warum werden bestimmte Peptidsequenzen als schwierig bezeichnet?
Einige wachstumsfördernde Peptidketten interagieren miteinander oder mit benachbarten Ketten auf eine Weise, die den Zugang zu reaktiven Stellen einschränkt. Wasserstoffbindungen, hydrophobe Interaktionen und Aggregationsverhalten können die spätere Bindung erschweren. Studien zu Sequenzen, die anfällig für Aggregation sind, zeigen, dass eine Änderung der Bindungsart die Zusammensetzung des Rohproduktes beeinflussen kann. [4] Die Synthesekomplexität hängt daher von der Eigenschaften der Moleküle und den Reaktionsbedingungen ab, und nicht nur von der Länge des Peptids.
12. Bedeutet eine schnellere Synthese immer ein besseres Produkt?
Nein. Die Synthesegeschwindigkeit und die Produktqualität sind separate Parameter. Beheizung, Mikrowellenunterstützung und Automatisierung können die Prozesszeit verkürzen, aber die Beschleunigung der Reaktion kann auch die Balance zwischen gewünschten und unerwünschten Reaktionen verändern. Studien zur mikrowellengestützten Synthese haben gezeigt, dass die Restreaktion und die Aspartimidbildung von der Art der Restsubstanz abhängen, was auf die Notwendigkeit einer entsprechenden Kontrolle der Bedingungen hindeutet. [7] Ein kürzere Synthesegang ist nur dann vorteilhaft, wenn das erhaltene Material auch die erforderlichen chemischen und analytischen Kriterien erfüllt.
13. Bedeutet die Entschärfung einfach die Entfernung der Harzpartikel?
Nein. Die Deschleierung ist ein chemischer Prozess, der zur Aufhebung des konzipierten Bindungsverbindungsstoffs zwischen dem Peptid und dem Träger führt. Die Entfernung von Harzpartikeln durch Filtration ist hingegen eine physikalische Operation, die nicht in sich selbst die korrekte Abfolge der Deschleierungskinetik bestätigt. Die Freisetzung des Peptids kann gleichzeitig mit der Entfernung von Schutzgruppen und anderen Reaktionen erfolgen. Studien zu Deschleichenspezifikern, die bei der Deschleierung eingesetzt werden, zeigen, dass dieser Schritt Einfluss auf die Schadstoffprofile haben kann. [8]
14. Bedeutet die hohe Produktivität des Rohstoffs eine hohe Reinheit des Peptids?
Nein. Die Reinheit beschreibt die Menge des wiederhergestellten Materials vor dem Entfernen aller unerwünschten Bestandteile. Dieses Material kann den Zielpeptid zusammen mit den delezyonalen Sequenzen, modifizierten Strukturen, weiteren Schutzgruppen und anderen Verunreinigungen enthalten. Untersuchungen von reinen SPPS-Gemischen unter Verwendung von Chromatographie und Massenspektrometrie zeigen, warum die wiederhergestellte Masse, die Reinheit und die molekulare Identität eine separate Interpretation erfordern. [9] Eine verlässliche Darstellung der Reinheit sollte daher den Schritt angeben, an dem das Material gemessen wurde und ob das Material bereits gereinigt wurde.
15. Kann SPPS die Aufnahme langer Peptidketten ermöglichen?
Ja. Sorgfältig entwickelte SPPS-Methoden können es ermöglichen, sehr lange Ketten zu erhalten. In Studien zur automatisierten Synthese fließender Ketten wurden Ketten mit bis zu 164 Resten erhalten, die anschließend auf ihre funktionelle Bewertung gereinigt und gefalzt wurden. [10] Dies zeigt die Möglichkeiten moderner Peptidsynthese, bedeutet jedoch nicht, dass jede Sequenz mit einer ähnlichen Länge mit gleicher Effizienz erhalten werden kann. Die Länge ist nur einer der Faktoren; auch aggregierte Sequenzabhängigkeiten, Nebenreaktionen, Faltungserfordernisse und die Schwierigkeit der Reinigung spielen eine Rolle.
16. Bedeutet die Konstruktion einer Epiderminssequenz die vollständige Synthese dieser Struktur?
Nein. Reifere Epidermis enthält atypische strukturelle Elemente, darunter Ringe aus Schwefel, die über die lineare Aminosäuresequenz hinausgehen. Dies wurde in strukturellen Studien nachgewiesen. [11] Die Erstellung einer linearen Sequenz, eines Präkursors oder eines Fragments bedeutet daher nicht automatisch die Synthese einer vollständigen reifen Moleküle. Die Behauptung einer vollständigen Synthese erfordert analytische Daten, die die Wiederherstellung der geplanten Bindungen und anderer wichtiger struktureller Elemente bestätigen.
17. Bestätigt die erwartete Teilchenmasse die vollständige Korrektheit der Struktur?
Nein. Die Erzielung der erwarteten Molekularmasse stellt eine wertvolle Information dar, aber die Masse allein bestätigt nicht alle Aspekte der Struktur eines Peptids und schließt nicht alle relevanten Verunreinigungen aus. Zwei Peptide können dieselbe nominelle Masse haben und gleichzeitig unterschiedliche Stereochemie oder einen bestimmten strukturellen Aufbau aufweisen. Studien, die epimere Peptide aufspalten, zeigen, warum stereochemische Unterschiede analytische Methoden erfordern, die in der Lage sind, Strukturen zu unterscheiden, die sich allein anhand der Massenbestimmung nicht unterscheiden lassen. [12] Die endgültige Charakterisierung muss daher realistische Verunreinigungen und alternative Strukturen berücksichtigen, die während einer bestimmten Synthese entstehen können.
Zusammenfassung
Die Festphasen-Synthese von Peptiden hat die Chemie von Peptiden verändert und ermöglicht es, den wachsenden Kettenstrang während der Wiederholung der Einführung, der Reaktion und des Entferns löslicher Reagenzien auf einem nicht löslichen Träger zu halten. Dies erleichtert die sequentielle Konstruktion von Sequenzen und bildet die praktische Grundlage für die automatisierte Synthese.
Die scheinbare Einfachheit dieser Methode sollte jedoch nicht die Komplexität der chemischen Prozesse verbergen, die in jedem Schritt stattfinden.
Harz, Bindemittel und die Stärke der Vernetzung beeinflussen die wesentlichen Eigenschaften der Synthese. Der Lösungsmittelabhängige Verkleben wirkt sich auf den Zugang zu den mit dem Harz verbundenen Ketten aus. Schutzgruppen kontrollieren, welche funktionellen Gruppen reagieren können, während die Bindungsreaktionen den Peptid-Rest zu Rest-Rest-Schlüssen bauen. [1] [2]
Jeder dieser Phasen hat auch seine Einschränkungen.
Ein frühes Anfügen kann die stereochemische Qualität beeinträchtigen. [3] Schwierige Sequenzen können den Zugang zu Reagenzien einschränken und aggregieren. [4] Die Chemikalien zur Sicherung und Entfernung von Schutzgruppen können zu Nebenreaktionen beitragen, wie zum Beispiel die Bildung von Aspartimid. [5] [6] Beschleunigte Syntheseraten können den Anteil an racemischen Produkten oder die Verunreinigungsprofile verändern. [7] Die Abspaltungskonditionen können zudem die Zusammensetzung des Rohproduktes beeinflussen. [8]
Deshalb ist eine korrekte Konstruktion des Rückgratproteins nicht gleichbedeutend mit dem Erhalt eines reinen und ordnungsgemäß identifizierten Peptids.
Die Rückgewinnung des Rohprodukts, die Reinigung und die strukturelle Charakterisierung bleiben separate Schritte. Die Chromatographie kann Informationen über die Zusammensetzung der Mischung und die Reinheit liefern, während die Massenspektrometrie und andere analytische Methoden Informationen über die Identität liefern. Kein einzelner analytischer Wert muss alle Aspekte der Struktur eines Peptids bestätigen. [9] [12]
Die moderne automatisierte Fluoreszenz-Synthese zeigt, dass unter entsprechend entwickelten Bedingungen SPPS auch bei sehr langen Ketten eingesetzt werden kann. [10] Gleichzeitig zeigen strukturschwer strukturierte Peptide wie Epidermis, warum die alleinige Rekonstruktion einer linearen Aminosäuresequenz möglicherweise unzureichend sein kann, wenn die reife Moleküle zusätzliche Ringe, atypische Restbestandteile oder einen bestimmten Verbindungsmechanismus enthalten. [11]
SPPS sollte am besten nicht als eine einzige Reaktion, sondern als eine Reihe von separaten chemischen und analytischen Phasen verstanden werden.
Die Verbindung markiert den Anfangspunkt. Wiederholte Sicherung-, Entsicherung- und Verbindungszyklen bilden den geplanten Gliederketten. Die Entsperrung befreit das Produkt. Die Reinigung trennt die Zielmolekül von unerwünschten Bestandteilen. Die endgültige Charakterisierung ermöglicht es anschließend festzustellen, ob das isolierte Material tatsächlich die ihm zugeschriebene Struktur und Qualität aufweist.
Die Trennung dieser Phasen ermöglicht es, einige häufige Missverständnisse zu vermeiden: Eine erfolgreiche Synthese bestätigt nicht automatisch die Reinheit, eine hohe Ausbeute bestätigt nicht automatisch die Identität, und die erwartete Teilchenmasse selbst beweist nicht automatisch die vollständige strukturelle Genauigkeit.
Referenzen
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