Peptid syntese i fast fase, også kendt som SPPS (solid-phase peptide synthesis), er en kemisk metode til at fremstille aminosyrepeptider efter aminosyre efter aminosyre, mens den ene ende af den dannede kæde forbliver kemisk bundet til et uopløseligt bærermateriale.
I stedet for at isolere det opståede peptid efter hver reaktion, lader kemikere det forbundet med den faste fase, idet de tilfører og fjerner yderligere flydende reagenser og vaskevæsker. De gentagne cyklusser muliggør afmontering af den reaktive aminogruppe, tilslutning af et nyt aminosyre og fjernelse af opløselige bestanddele, som ikke længere er nødvendige. Når den planlagte aminosyresekvens er opbygget, kan peptidet adskilles fra bæreren og derefter underkastes yderligere behandling og analyse.
Denne procesorganisation er en af hovedårsagerne til, at SPPS er blevet en så vigtig metode inden for peptidkemi. Den faste fase forenkler udførelsen af mange gentagne kemiske processer og muliggjorde automatisering af syntesen.
Komforten ved syntesen på den faste fase betyder dog ikke en kemisk garanti for perfektion.
At indføje det opbyggende peptid i et medium garanterer ikke, at enhver kæde modtager alle de planlagte aminosyrer. Det betyder heller ikke, at det materiale, der frigives i slutningen af processen, er kemisk rent eller har den korrekte struktur.
At lave en kæde, fjerne og genvinde produktet, rense det, bekræfte identiteten og den endelige strukturelle karakteristika er separate dele af processen som helhed.
Nuværende metodologiske publikationer viser både fordelene ved SPPS og behovet for at tilpasse standardmetoder i tilfælde af svære sekvenser. I en af de offentliggjorte metoder, der anvender FMOC-strategien, beskrives f.eks. en rutinemæssig syntese, men også en modificeret tilgang til peptidsækvencer, der er modtagelige for aggregering. [1]
Forståelsen af SPPS kræver således mere end blot at huske de efterfølgende kemiske trin. Man skal også vide, hvad målet for hvert trin er, hvad der kan gå galt under processen og hvilke analytiske spørgsmål der stadig skal besvares efter afslutningen af processen.
Hvad er syntese af peptider i fast fase?
Den opbyggende peptid forbliver bundet, mens opløsningerne ændrer sig.
I konventionel SPPS er peptidet kemisk forbundet med små, uopløselige partikler, normalt kaldet harpikakornene, ved hjælp af en passende kemisk forbindelse.
Frøene forbliver i reaktionssystemet, mens yderligere flydende reagenser og opløsninger, der strømmer ud, indføres og fjernes.
Dette gør det betydeligt lettere at opbygge en gentagelig syntese.
I den klassiske, etapvise syntese kan isolering og rensning af det voksende peptid efter hver tilslutning af en aminosyre være besværlig. I SPPS forbliver den opståede kæde bundet til den uløselige fase. På denne måde kan opløselige overskud af reagenser og mange biprodukter fjernes ved rensning, mens peptidet bundet til den gødende forbindelse forbliver på stedet.
Udtrykket „fast fase” kan dog føre til misforståelser.
Det betyder ikke, at peptidsammenføjning sker uden deltagelse af væske eller opløsningsmiddel.
Gummi er normalt omgivet af et flydende reaktionsmiljø, og dets interaktion med opløsningsmidlet kan have en væsentlig indvirkning på synteseprocessen. Reagenserne skal fortsat bevæge sig i eller omkring det polymere miljø og nå de reaktive områder i det voksende peptidet.
Tilslutningen af peptidet til bæreren har normalt en kovalerisk karakter. Det betyder, at den opståede molekyle er forbundet med bæreren via en forbindelse ved kemisk binding.
Peptidet er altså ikke blot indespærret mellem partiklerne, holdt tilbage af et filter eller løst anbragt på overfladen.
Denne kemiske binding er bevidst designet på en sådan måde, at den opbyggede kæde forbliver bundet under de efterfølgende reaktioner og vaskningsfaser og derefter kan frigøres under de rette betingelser.
Konventionel syntese foregår fra C-enden mod N-enden.
Den klassiske lineære SPPS-strategi begynder normalt med en aminosyre, som i det færdige peptid vil udgøre dens C-ende.
Resten bliver tilsluttet bæreren.
Efter påvisningen af den relevante reaktive aminogruppe tilføres et andet beskyttet aminosyre og det kemisk bindes til den opståede kæde. Gentagelsen af denne proces forlænger gradvist peptidet mod N-enden.
Det er værd at fremhæve denne retning, da den adskiller sig fra den biologiske proteinsyntese gennem ribosomerne.
Ribosomal syntese forlænger polypeptidet fra N-enden mod C-enden. Den konventionelle fase-forstærkede SPPS opbygger normalt sekvensen i den modsatte retning.
Den endelige aminosyresekvens kan dog være identisk. Den adskiller sig blot i den måde, den er opbygget på.
Det er vigtigt at definere begrebet „konventionel”, da peptidkemi også omfatter specialiserede strategier, der anvender alternative bindingssteder, fragmentbindinger, ligeringer og andre ikke-standardløsninger.
Beskrivelsen af vejen fra C-punktet til N-punktet henviser derfor til den typiske trinvise proces i SPPS og ikke til alle mulige metoder til peptidkemi, der anvender en fast fase.
SPPS er kun et af elementerne i produktionen af peptider
Faseopløsningstermoplastisering er ikke den eneste måde at fremstille peptider på.
Peptider kan også fremstilles ved kemisk syntese i opløsning, ved biologiske ekspressionssystemer, ved enzymatiske omdannelser, ved ligering af fragmenter eller ved kombination af forskellige metoder.
SPPS er særligt nyttig, når der er behov for kontrolleret sekvensering og brug af beskyttede, modificerede eller på anden måde specialiserede aminosyre-konstruktionsblokke.
Selv inden for et projekt vedrørende et bestemt peptid er det ikke altid nødvendigt at anvende den samme metode fra start til slut.
Faste peptider kan f.eks. syntetiseres på en harpiks, renses separat og derefter kombineres ved en anden kemisk metode. Andre molekyler kan kræve folding, oxidation, cyklisering eller yderligere strukturelle ændringer allerede efter at den oprindelige lineære sekvens er opnået.
Valget af den rette vej afhænger derfor af det ønskede molekyle, dets strukturelle kompleksitet samt projektets analytiske og kvalitetsmæssige krav.
Processen er værd at overveje som en række af flere spørgsmål.
Tilslutningen til bæreren angiver det startpunkt og påvirker den efterfølgende kemiske frigivelse af produktet. Det er dog stadig nødvendigt at fastslå, om tilslutningen fandt sted korrekt og om den stereokemiske integritet er bevaret.
At lave en kæde indebærer at forbinde aminosyrerne i den planlagte rækkefølge. Derefter er det dog nødvendigt at kontrollere, om alle kæderne reagerede korrekt og om der ikke opstod sekvenser med manglende aminosyrer, forkortede eller modificerede produkter.
Afskæring og fjernelse af beskyttende grupper skal frigøre peptidet og fjerne bestemte kemiske beskyttelseslag. Selve den effektive frigivelse af produktet fortæller dog ikke, hvilke andre stoffer der findes i det rå materiale.
Rensning har til formål at adskille det ønskede materiale fra uønskede bestanddele, men selv den rensede fraktion kræver stadig bekræftelse af identiteten og en kvalitetsvurdering.
Den endelige strukturelle og analytiske karakterisering skal imidlertid besvare spørgsmålet om, hvorvidt det isolerede materiale har de kemiske egenskaber, der forventes for det tilsigtede peptid, og om de anvendte analytiske metoder er egnede til det tilsigtede anvendelsesformål.
Dette er koncepter, ikke en laboratorievejledning. De konkrete reagenser, apparatur og reaktionsbetingelser afhænger af det ønskede peptid og kræver en passende udviklet og valideret metode.
Anslutning til harpiks og placering af kæden
Gummi, bindemiddel og påsætningsgrad udfører forskellige funktioner
I diskussioner om SPPS optræder ofte tre begreber: harpiks, bindemiddel og påfyldningsgrad, altså loading.
De beskriver forbundne, men forskellige egenskaber.
Gummimassen er et uopløseligt materiale, der fungerer som bærer.
En knudepunkt sikrer den kemiske forbindelse mellem dette molekyle og peptidet eller den første aminosyrerest. Dens kemi kan påvirke både måden hvorpå peptidet bindes og senere frigøres.
Loading beskriver imidlertid antallet aktive tilslutningssteder i forhold til mængden af bæremateriale.
Disse begreber er ikke synonymer.
Toerfarve kan fysisk se meget ens ud, men indeholde forskellige funktionelle grupper, bindinger eller grad af kondensering. Disse forskelle kan påvirke tilgængeligheden af reaktive områder under kaskadestrukturering, væksten af toren og den kemiske form af det endelige peptid efter afskilning.
Et andet vigtigt element er den planlagte gruppe på C-enden.
Forskellige bærer-bindingssystemer kan f.eks. vælges, så man får et peptid med en carboxyl- eller amidgruppe som slutning.
Det er en væsentlig kemisk forskel.
En ændring af den terminale gruppe betyder en ændring af selve molekylet, ikke kun måden det er pakket eller beskrevet på.
Stivning påvirker adgangen til tilsluttede kæder
Mange opløsningsmidler anvendt i SPPS optager opløsningsmidlet og svulmer op ved kontakt med det relevante flydende miljø.
Dette ændrer det polymere miljø og kan øge eller reducere den afstand, som opløste reagenser skal bevæge sig for at nå de proteinstrukturer, der er forbundet med det aktive stof.
Stivning er således ikke kun en fysisk interessepunkt.
Det kan påvirke tilgængeligheden af reaktive grupper under syntesen.
En systematisk undersøgelse af plastmaterialer baseret på polystyren og PEG viste, at egenskaber som forbindelsens type og graden af harpiksoverfladebinding havde en signifikant indvirkning på sprængstyrken i de mere miljøvenlige opløsningsmidler, der blev undersøgt. Det blev også konstateret, at sprængstyrken kan ændre sig under fjernelse af beskyttelsesgrupper og efterhånden som peptidsættet forlænges. [2]
Dette viser, at harpiksens adfærd ikke altid kan betragtes som dens konstante egenskab.
I praksis afhænger det af samspillet mellem harpiks, opløsningsmiddel, binder, tilknyttet peptid og det aktuelle syntese-stadie.
Et godt opløsningsforhold eller en gunstig reaktionshændelse for en kombination af harpiks, opløsningsmiddel og peptid betyder ikke således, at en anden kombination vil opføre sig identisk.
Selv selve tilslutningsfasen kræver kvalitetskontrol
Det første trin i tilslutningen kan synes enkelt, fordi peptidsættet først er ved at blive dannet.
Et fejlindgreb på dette trin kan dog fortsat være til stede under hele den efterfølgende syntese.
Hvis den første rest bliver tilsluttet forkert, eller hvis dens stereokemiske konfiguration ændres under denne proces, behøver det ikke at være nødvendigt at tilslutte alle de efterfølgende rester for at rette det oprindelige problem.
I en undersøgelse fra 1992 blev en analytisk metode udviklet specielt til måling af racemisationen, der finder sted ved tilslutningen af beskyttede aminosyrer til faste bærere. [3]
Betydningen af dette arbejde går ud over selve den anvendte analytiske metode.
Det viser, at stereokemisk kvalitet kan kræve kontrol, før de gentagne forlængelsescyklusser med kæden starter.
Også mængden af materiale, der oprindeligt blev tilføjet på en medier, kræver en korrekt fortolkning.
Den nominelle grad af affinitet for harpiks, den eksperimentelt målt ladning, mængden af rå materiale genvundet efter affinitetsbinding og den endelige udbytte af det isolerede og rensede peptid er forskellige størrelser.
De bør ikke betragtes som alternative målsætninger for syntesens succes.
Længere kæder kan blive sværere at få fat i
Når peptidsættet bliver længere, begynder selve den tilsluttede molekyle at påvirke sit kemiske miljø.
Nærliggende kæder kan påvirke hinanden gennem hydrogenbindinger, hydrofobe interaktioner og andre intermolekylære kræfter. Nogle sekvenser kan vise en særligt stærk tendens til sådanne interaktioner.
Dette kan begrænse adgangen til reaktive grupper.
I sådan en situation kan det blive sværere at tilføje et yderligere aminosyre, selvom der tilsyneladende er indført tilstrækkeligt med koblingsmiddel i systemet.
I en undersøgelse af svære, aggregerbare sekvenser blev forskellige sammenføjningsmetoder sammenlignet og de opnåede råprodukter analyseret. Resultaterne understøtter princippet om, at processen bør tilpasses den specifikke sekvens i stedet for at antage, at der findes en enkelt sammenføjningsstrategi, der altid er den bedste. [4]
Det forklarer også, hvorfor en enkelt forøgelse af graden af harpiksens affedtning eller mængden af reagens ikke automatisk løser alle problemerne.
Hvis det grundlæggende problem er begrænset adgang til reaktive steder, bliver spørgsmålet om mængden af tilsat reagens vigtigere end spørgsmålet om, hvorvidt det faktisk nåede de relevante steder og om reaktionen fandt sted effektivt uden opståen af uacceptabelt mange biprodukter.
Beskyttelse, fjernelse af beskyttelsesgrupper og sammenkobling
Beskyttelsesgrupper kontrollerer stedet, hvor reaktionen opstår
Aminosyrer indeholder kemiske grupper, der er i stand til at deltage i forskellige reaktioner.
Ved kontrolleret tilførsel af peptidet ønsker kemikere normalt, at en bestemt aminosyregruppe reagerer med en bestemt blokk, der indeholder en karboksylgruppe, mens andre potentielt reaktive områder forbliver midlertidigt inaktive.
Det er netop dette, beskyttelsesgrupperne tjener til.
De blokerer midlertidigt de udvalgte reaktionssteder og giver dermed et andet sted mulighed for at deltage i den planlagte reaktion.
I den almindeligt anvendte SPPS-strategi baseret på Fmoc forbliver den endelige aminoskolegruppe i den voksende kæde beskyttet mellem de efterfølgende tilslutningsfaser. Når den næste aminosyre skal tilsluttes, fjernes den midlertidige beskyttelse og aminoskolen bliver synlig.
Reaktive sidekæder kan have separate beskyttelsesgrupper, der er designet til at forblive intakte under gentagne cyklusser med opbygning af hovedkæden.
Formålet er kontrolleret selektivitet.
En passende blok med en karboksylgruppe bør forbinde sig med en passende aminogruppe i stedet for at føre til ukontrolleret forgrening eller andre konkurrerende reaktioner.
Ortogonalitet betyder mulighed for selektiv fjernelse af sikkerhedsfunktioner
En ortogonal strategi for beskyttelsesgrupper gør det muligt at fjerne en beskyttelsesgruppe under forhold, hvor de andre nødvendige sikkerhedsforanstaltninger forbliver tilstrækkelig ubeskadigede.
Dette giver kemikeren mulighed for at styre afsløringen af forskellige reaktive steder i de forskellige faser af syntesen.
Fmoc og Boc er velkendte betegnelser inden for peptidkemi, men de betegner ikke forskellige typer peptidsammenhænge eller forskellige endelige peptidsammensætninger.
Det drejer sig om beskyttelsesgrupper forbundet med forskellige syntesestrategier og forskellige metoder til deres fjernelse.
Den midlertidige kemiske vej, der anvendes under peptidsyntesen, bør derfor adskilles fra dens endelige struktur.
Sikkerhedsforanstaltninger giver ikke fuld beskyttelse mod alle mulige bivirkninger.
Forskning om aspartimideproduktion viser f.eks., at beskyttelsesstrategier, nærliggende aminosyreresters placering og betingelser for fjernelse af beskyttende grupper kan påvirke forureningen selv i velkendte SPPS-metoder.[5][6]
Gruppepolitiets strategi begrænser således bestemte uønskede reaktioner, men eliminerer ikke behovet for proceskontrol eller den endelige analytiske karakterisering.
Bindingsprocessen skaber yderligere en amidbinding i peptidskelettet.
Reaktionen med binding fører til dannelsen af et nyt amidbinding i peptidskelettet.
En aminosyreblok med en karboksylgruppe aktiveres normalt kemisk for at kunne reagere effektivt med den åbne aminogruppe i det voksende peptidbundne protein.
Efter færdiggørelsen af sammenbindingen kan overskydende materiale fjernes ved at skylle det væk.
Den ny tilsluttede aminosyre bliver derefter den sidste rest i den voksende kæde. Derefter kan dens aminosyregruppe blive afsløret og en ny bindingcyklus kan påbegyndes.
Teoretisk set gør gentagelse af denne sekvens det muligt at kontrollere aminosyresekvensen ved at styre ordningen for tilføjelsen af byggestenene.
I praksis er der imidlertid en meget vigtig betingelse:
Den planlagte kemiske reaktion skal rent faktisk udføres korrekt i hver cyklus.
Hvis et par er ufuldstændigt, kan en del af kæden ikke modtage den planlagte del.
Hvis de forbliver forbundet med proteinkæden og reagerer korrekt i det næste cyklus, kan sekvenser dannes, hvilket betyder at peptidsammensætningen er tom for et eller flere planlagte aminosyrer.
Andre kæder kan forbliver korte.
Vaskning fjerner opløselige reagenser og biprodukter, men eliminerer ikke selektivt alle uønskede kæder, som stadig er kovalent bundet til bæreren.
Små tab kan akkumuleres i mange cyklusser
Den repetitive karakter af SPPS fører til et væsentligt matematisk problem.
En lille ufuldkommenhed i et enkelt trin kan synes ubetydelig, men efter mange gentagelser kan dens konsekvenser akkumuleres.
Lad os overveje et simpelt matematisk eksempel.
Hvis syntesen af et peptid krævede 50 sammenbindingsstadier, og hvert af dem uafhængigt havde en sandsynlighed på 99% for at ende korrekt, ville den teoretiske andel af molekyler, der med held gennemførte alle 50 stadier, være omkring 60,5%.
Det er kun en illustration.
Den antager, at alle trin opfører sig ens og uafhængigt. Den tager ikke højde for problemer med fjernelse af beskyttelsesgrupper, bivirkninger, tab under afskæring og rensning, aggregering eller mange andre faktorer, der er reelle.
Det bør derfor ikke tolkes som en forudsigelse af den faktiske produktivitet.
Eksemplet viser blot, hvorfor selv meget høj effektivitet i de enkelte trin ikke garanterer et kemisk simpelt råprodukt efter flere årtier med gentagelser.
Derfor er overvågning af syntesen og kontrol af forurening vigtige under hele processen med at fremstille peptidet, og ikke først efter tilføjelsen af det sidste aminosyre.
Automatisering, opvarmning og andre teknologiske løsninger kan fremskynde syntesen, men hastigheden af processen bør altid vurderes sammen med produktets kvalitet.
Forskningen om SPPS med mikrobølgeteknologi analyserede den relaterede rest-racematisering og dannelsen af aspartimid, hvilket viste, hvorfor reaktionsbetingelserne fortsat skal tilpasses de specifikke egenskaber ved den konkrete sekvens. [7]
Afskæring og genvinding af råproduktet
Afskæring frigør produktet fra bæreren
Efter opbygningen af den planlagte peptidsekvens skal peptidet normalt kemisk adskilles fra bæreren.
Denne fase kaldes cleavage, hvilket betyder afskilning.
Separering afbryder den forsigtigt designede kemiske binding mellem peptidet og bæreren.
Afhængigt af den anvendte strategi kan affectering ske samtidigt med fjernelse af dele eller alle grupper af beskyttende kæder i sidelederne. I andre processer kan peptidet eller dets fragment frigives under opretholdelse af visse sikkerhedsforanstaltninger, hvis yderligere kemiske omdannelser planlægges.
Den rette frigivelseshæmmeren afhænger af bindemidlet og det målte molekyle.
Betingelser, der effektivt frigiver et peptid, kan skade den kemisk følsomme gruppe i et andet.
Derfor beskriver affinitetsbindingen et kemisk mål, og ikke et universelt sæt af reagenser eller betingelser, der er egnede for alle peptider.
På samme måde vidner en korrekt opbygning af peptidskelettet ikke om, at alle beskyttende grupper derefter blev effektivt fjernet.
At lave en kæde og afmontere sikkerhedsforanstaltningerne svarer til forskellige kemiske spørgsmål og kræver en separat vurdering.
Betalingsbetingelserne kan påvirke forureningens profil
Afskæring behøver ikke at være et kemisk neutralt trin.
Afmontering af beskyttelsesgrupper og afbrydelse af peptids binding til bærer kan føre til dannelse af reaktive kemiske former, der er i stand til at ændre peptidet eller andre bestanddele i blandingen.
Derfor kan såkaldte scavengers anvendes i de udviklede metoder, hvilket er forbindelser, der opsuger bestemte uønskede reaktive produkter og påvirker dannelsen af biprodukter.
En undersøgelse fra 2019 analyserede forskellige scavengers under afsætningen af exenatid fra peptidskærmen og viste, at deres valg påvirkede kvaliteten af det rå produkt samt det observerede forureningsprofil. [8]
Derfor bør man ikke udlede en universel recept for afskalning ud fra dette.
Studiet viser imidlertid, at betingelserne for dette trin kan påvirke produktets kvalitet, og derfor bør de vurderes for det specifikke peptid og det anvendte beskyttelsessystem.
Den rigtige proces for afskalning har således flere dimensioner.
Peptidet skal fjernes korrekt, de krævede beskyttende grupper skal fjernes, det målte materiale skal genvindes og uønskede kemiske forandringer skal kontrolleres.
Genopretning af råproduktet er ikke den endelige rensning
Efter affatning udføres en proces, der muliggør adskillelse af materialet, der indeholder peptidet, fra den faste harpiks samt de resterende bestanddele i reaktionsblandingen.
Man kan samtidig udnytte forskellene i opløselighed, flydendehed eller andre kemiske egenskaber.
Attergang af synligt sediment eller en fraktion indeholdende peptyd bekræfter dog ikke, at materialet udelukkende består af det tilsigtede produkt.
På dette stadium taler man normalt om et råt peptid.
Det kan indeholde det målte molekyle sammen med sekvenser af deleterende nukleotidkerner, forkortede kæder, kemisk modificerede peptider, ufuldstændig afdækkede strukturer, materialer fra reagenser og andre forureninger.
Betydningen af de enkelte forureninger afhænger af sekvensen, synteseforholdene og den tilsigtede anvendelse.
I et af undersøgelserne blev en kromatografidel kombineret med massespektrometri for at karakterisere de rå produkter fra SPPS og tilordne de enkelte kromatografipunkter til bestemte peptider. [9]
Det viser, hvorfor oplysninger opnået ved separations- og strukturelle metoder gensidigt supplerer hinanden.
Kromatografi kan påvise tilstedeværelsen af mange bestanddele, mens massespektrometri kan give yderligere oplysninger, der hjælper med at fastslå, hvad nogle af disse bestanddele kan være.
Rensning og bekræftelse af identitet besvarer forskellige spørgsmål
Rensning har til formål at udvinde eller isolere det ønskede stof fra andre bestanddele.
Identifikation imidlertid besvarer spørgsmålet om, hvorvidt det isolerede materiale faktisk har de forventede kemiske egenskaber.
Disse spørgsmål overlapper delvist, men de er ikke det samme.
Et velopdelt kromatografisk pik er ikke automatisk et fuldstændigt bevis på molekylets struktur.
På samme måde er det at opnå den forventede partikelmængde i sig selv ikke en fuldstændig vurdering af renheden eller den strukturelle rigtighed.
Nært beslægtede varianter af sekvenser, stereoisomerer eller kemisk modificerede former kan være vanskelige at adskille eller identificere.
Rensningsmetoden bør derfor vurderes i forhold til den faktiske blanding, der opstår under en given syntese, og bør ikke anses for at være tilstrækkelig blot fordi den har fungeret for en anden peptid.
Hvis den endelige molekyle også kræver dannelsen af disarske broer, cyklisering eller anden transformation efter at kæden er blevet dannet, opstår der yderligere analytiske spørgsmål om sammenhægens rigtighed, strukturel homogenitet og om det faktisk er blevet opnået den tilsigtede modne form af molekylet.
Fordele, begrænsninger og kilder til forurening
Hvorfor er SPPS så udbredt?
En af de vigtigste fordele ved SPPS er muligheden for at opbevare det dannede peptid på en bærer under gentagne udskiftninger af flydende reagenser.
Dette forenkler gentagne kemiske processer og muliggør automatisering.
Kemiere kan indføre en planlagt sekvens af aminosyreblokke, og hvis processkemi tillader det, også nogle ikke-standardiserede aminosyrer og andre modifikationer.
Nuværende automatiske systemer viser, hvor langt man kan udvikle denne koncepte.
I en undersøgelse fra 2020 om automatiseret flowsyntese blev det beskrevet, at man kunne fremstille proteinkæder med op til 164 aminosyrerestersammensætning. Efter senere rensning og folding blev funktionelle materialer opnået.[10]
Det er et imponerende eksempel på tekniske muligheder.
Det betyder dog ikke, at enhver sekvens med en længde på 164 rester – eller enhver lang peptid eller protein – kan fremstilles med samme lethed.
Det betyder heller ikke, at rensning og strukturel karakterisering bliver overflødige.
Studiet viser snarere, hvilke resultater der kan opnås med et omhyggeligt udviklet system for korrekt valgte molekyler.
Automatisering styrer procesens udførelse.
Det er dog ikke i stand til at omdanne uhensigtsmæssig kemi til hensigtsmæssig kemi.
Derfor skal apparatets ydeevne, peptidsættet og selve molekylets opførsel analyseres samlet set.
Hvordan opstår typiske forureninger?
Under SPPS kan der forekomme flere forskellige veje, der fører til forurening. En forståelse af dem hjælper med at forklare, hvorfor slutlige analytiske undersøgelser stadig er nødvendige.
En delecyndel eller en forkortet produktsekvens kan opstå, når det planlagte tilslutningsforløb for et aminosyre ikke lykkes, eller når kæden ikke kan fortsætte med at vokse. Da en forkert kæde fortsat kan være forbundet med harpiksen, behøver senere skylning ikke at fjerne den.
Epimerisering betyder en ændring i den stereokemiske konfiguration af det relevante centrum. Dette er særligt analytisk vigtigt, da en epimer kan have samme nominelle molekylmasse som det korrekte peptid, men samtidig have en forskellig rumlig konfiguration.
Produkter, der er forbundet med aspartimid, kan opstå som følge af sekvensafhængige bivirkninger, der omfatter resterne af aspartin. Afhængigt af den kemiske proces kan der opstå mere end én type af sådanne produkter.
Ufuldstændig fjernelse af beskyttelsesgrupper opstår, når den gruppe, der skal fjernes, forbliver forbundet med molekylet. Peptidet kan således have den nominelt forventede kædelængde, men stadig have en ukorrekt kemisk struktur.
Modifikationer i forbindelse med affectering kan opstå under den endelige frigivelse af peptidet eller fjernelsen af beskyttende grupper. En korrekt kædeopbygning garanterer derfor ikke, at peptidet vil gå igennem affecteringstrin uden ændringer.
Ufuldstændige aggregationsreaktioner kan imidlertid forekomme, når de opståede kæder interagerer med hinanden på en måde, der begrænser adgangen til reaktive områder. Indførelsen af tilstrækkelig mængde reagens i reaktionsbeholderen garanterer ikke, at ethvert reaktivt område er fysisk tilgængeligt og reagerer korrekt.
Disse er mulige veje til forurening.
Det betyder ikke, at enhver part, der modtages via SPPS, skal indeholde alle de nævnte former for fejl.
Deres betydning i en bestemt syntese fastslås på grundlag af viden om processen, analytiske undersøgelser og passende kvalitetskontrol.
Konstruerede naturlige peptider kræver mere end blot at gengive sekvensen.
Nogle peptider er strukturelt betydeligt mere komplekse, end det ville være tilfældet med en lineær aminosyresekvens alene.
Et godt eksempel er epiderminen.
Den strukturelle karakteristika af epidermis viste tilstedeværelsen af mange ringe med svovl og atypiske rester.[11]
Selv at gengive den lineære ordning af aminosyrer ville så ikke være tilstrækkelig dokumentation for, at man havde opnået en ægte moden epidermin.
Denne sondring er vigtig ved fortolkningen af publikationer eller søgninger om syntese af epidermis på den faste fase.
Publikationen kan beskrive en lineær prekursor, en fragment, en analog eller en anden beslægtet struktur, i stedet for at verificere den fuldstændige syntese af en komplet moden molekyle.
Den strukturelle publikation, der her omtales som [11], beskriver karakteristika ved selve epidermis; den er ikke en rapport om dens fuldstændige syntese ved SPPS-metoden.
Påstande om fuldstændig syntese bør derfor vurderes i forhold til den faktiske målstrukturen for molekylet, og ikke kun i forhold til dets lineære aminosyresekvens.
Effektivitet, renhed og identitet skal fremstilles separat
Tre af begreberne, der ofte forveksles i diskussioner om syntese af peptider, er effektivitet, renhed og identitet.
En stor mængde genvundet produkt betyder ikke nødvendigvis, at det meste af dette materiale er det tilsigtede peptid. Det rå materiale kan indeholde betydelige mængder af forureninger.
En lige så høj kromatografisk renhed bekræfter ikke automatisk alle aspekter af den strukturelle identitet.
Selv et peptid, hvis kemiske struktur er nøje karakteriseret, opnår ikke automatisk en bekræftet biologisk, terapeutisk eller klinisk anvendelse.
Det er separate spørgsmål.
En nøjagtig beskrivelse af syntesen bør således angive, hvilken molekyle der var tilsigtet, hvilket stadium produktiviteten blev målt på, om det analyserede materiale var rå eller renset, samt hvilke analytiske data der blev anvendt til at bekræfte påstandene om strukturen.
På denne måde kan synteseresultaterne fortolkes og sammenlignes på en mere pålidelig måde.
En enkelt procentdel eller masseværdi bør ikke bruges som en generel påstand om, at peptidet er af „høj kvalitet”, uden at man kender til, hvad der faktisk er målt.
Ofte stillede spørgsmål
1. Hvorfor anvendes en fast fasemængde i SPPS?
Den statiske fase fastholder det opbyggede peptid på bæreren, mens opløselige reagenser, biprodukter fra reaktionen og permeater kan indføres og fjernes mange gange. Dette gør det betydeligt lettere at gentage syntesen af peptider, og det muliggør automatiseret syntese af peptider, hvilket eksempler på moderne metoder til automatiseret flow-syntese er. [10] Bæreren garanterer dog ikke, at enhver reaktion vil gå perfekt, eller at et ufuldstændigt opbygget peptid bundet til en polymer ikke vil blive adskilt fra det korrekte. Dens primære fordel er at forbedre processtyringen. Kemisk selektivitet, reaktionskompleksitet, renhed og strukturel identitet kræver fortsat en separat vurdering.
2. Eliminerer syntese på fast fase behovet for rensning?
Nej. Uregelmæssige peptidkæder kan forbli forbundet med harpiksen under syntesen og derefter blive frigivet sammen med det formålskonstruerede produkt. Undersøgelser, der analyserer rå SPPS-produkter ved hjælp af kromatografi og massespektrometri, viser, at vasken under syntesen og den endelige rensning udfører forskellige funktioner. [9] Vasken fjerner primært opløselige bestanddele, der omgiver harpiksen, mens rensningen efter affedtning har til formål at adskille den ønskede peptid fra uønskede peptid- og ikke-peptidbestanddele. SPPS forenkler indirekte processer, men garanterer ikke den endelige renhed.
3. Betegner „fast fase” at opløsningsmidlet ikke anvendes?
Nej. I konventionel SPPS er et uopløseligt medium normalt omgivet af flydende reagenser og opløsningsmidler. Løsningsmidler påvirker den fysiske struktur af harpiksen, herunder graden af sprængning og hvor let reagenserne kan trænge ind i de tilsluttede kæder. Eksperimentelle undersøgelser har vist, at opløselighed afhænger af reagenset og at der er ændringer forbundet med kemien mellem bindingerne, graden af sammenføjning og forlængelsen af kæden. [2] Harpiks og opløsningsmiddel danner således et reaktionsmiljø sammen.
4. I hvilken retning vokser peptidet under SPPS?
Den konventionelle fase-modulerede SPPS opbygger normalt peptidet fra dets C-terminale rest i retning af N-enden. Den første aminosyre, der skal danne C-enden af det færdige molekyle, bindes til bærerstoffet, og de efterfølgende restserier forlænger den eksponerede ende af kedlen. Publicerede metoder baseret på Fmoc viser denne typiske skema. [1] Der findes dog specialiserede metoder, der anvender en fast fase, som kan udføres på andre måder.
5. Betegner harpiks og forbindelsesmiddel det samme?
Nej. Harvemiddelstoffet er et uopløseligt bærermateriale, mens bindemidlet er en kemisk forbindelse mellem bærermaterialet og det voksende peptid. Bindemidlets funktionalitet kan uafhængigt af selve polymeren påvirke sammenføjningen, holdbarheden af harvemidlet og senere frigivelsen af peptidet. Forskning om bærermaterialer anvendt i peptidsyntese viser, hvorfor selv betegnelsen af harpiksmaterialet ikke er nok til at beskrive hele systemets opførsel.[2]
6. Øger en højere grad af harpiksinddampning altid produktionen?
Nej. Højere loading betyder flere potentielle tilslutningssteder pr. given mængde af bærer, men det skal ikke nødvendigvis føre til en større mængde korrekt opbygget og genanvendeligt peptid. Graden af tilslutning kan ændre det lokale molekylære miljø og er eksperimentelt blevet identificeret som en af de faktorer, der påvirker harpiksens sprængning. [2] Hvis de tilsluttede kæder er overbelastede eller stærkt interagerer med hinanden, kan tilgængeligheden af reaktive bindinger forringes. Loading bør derfor analyseres sammen med harpiksens egenskaber, sekvensudviklingen, reaktionshastigheden og kvaliteten af det endelige produkt.
7. Hvorfor sikres aminosyrerne under peptidsammensætningen?
Beskyttelsesgrupper forhindrer midlertidigt de udvalgte reaktive grupper i at deltage i reaktionerne, mens en specifik binding dannes. Dette muliggør en kontrolleret, trinvis kædeopbygning. Beskyttelse eliminerer dog ikke alle de sekundære reaktioner. Forskning på modelsystemer har f.eks. vist, at beskyttelsesgruppernes strategi og den omgivende sekvens kan påvirke aspartimideproduktionen.[5] Beskyttelsesgrupper sikrer således kemisk selektivitet, men hele beskyttelses- og frigørelsesstrategien kræver fortsat omhyggelig planlægning og vurdering.
8. Hvad betyder ortogonal beskyttelse af funktionelle grupper?
Ortogonalitet betyder muligheden for at fjerne en beskyttelsesgruppe under betingelser, der efterlader andre nødvendige beskyttelser i tilstrækkelig grad uændret. Dette giver mulighed for at afsløre bestemte reaktive områder på planlagte trin i syntesen. Gældende SPPS-metoder bygger på kontrolleret beskyttelse og afmontering i stedet for samtidig afsløring af alle reaktive grupper. [1] Den faktiske overensstemmelse mellem de anvendte beskyttelser afhænger dog fortsat af det tilsigtede molekyle og reaktionsbetingelserne.
9. Betegner Fmoc og Boc forskellige typer af peptider?
Nej. Fmoc og Boc er beskyttende grupper og de syntetiske strategier forbundet med dem, og ikke forskellige typer af peptidskelet. Forskellene i deres fjerning afhængigt af syntesemetoden, men den midlertidige beskyttende kemi må ikke forveksles med den endelige struktur af det målte peptid. De offentliggjorte metoder baseret på Fmoc viser et af de almindeligt anvendte SPPS-varianter, men det betyder ikke, at ethvert peptid skal fremstilles ved denne metode. [1]
10. Kan den første fasen af tilslutningen allerede forårsage forurening?
Ja. Tilslutningsfasen kan påvirke stereokemien allerede før flere retningsforandringer af kæden påbegyndes. Analytiske metoder er udviklet specielt til bestemmelse af racemisation under tilslutning af beskyttede aminosyrer til harpikser. [3] Det betyder ikke, at enhver tilslutning medfører en betydelig racemisation. Det viser blot, at selve tilslutningen er et kemisk vigtigt trin, hvor der kan opstå målbare ændringer, der skal tages i betragtning i den generelle kvalitetsvurdering.
11. Hvorfor kaldes nogle peptidsætninger for svære?
Nogle stigende peptidkæder interagerer med hinanden eller med nærliggende kæder på en måde, der begrænser adgangen til reaktive områder. Vandbindinger, hydrofobe interaktioner og aggregationslignende fænomener kan vanskeliggøre senere binding. Undersøgelser af sekvenser, der er modtagelige for aggregering, viser, at ændring af bindingen kan påvirke sammensætningen af det færdige produkt. [4] Problemerne ved syntesen afhænger derfor af molekylets egenskaber og reaktionsbetingelserne, og ikke kun af peptidets længde.
12. Betegner hurtigere syntese altid et bedre produkt?
Nej. Syntesehastigheden og produktets kvalitet er separate parametre. Opvarmning, mikrobølgebelysning og automatisering kan reducere procestiden, men at fremskynde reaktionerne kan også ændre forholdet mellem ønskede og sideeffektive reaktioner. Undersøgelser af mikrobølgebelystede synteser har vist en relasjon mellem restmængden og aspartimidets dannelse, hvilket tyder på, at der er behov for passende kontrol af betingelserne. [7] Kortere syntesetid er kun fordelagtigt, hvis det opnåede materiale også opfylder de krævede kemiske og analytiske kriterier.
13. Betegner afskæring simpelthen fjernelsen af harpikskornene?
Nej. Afskæring er en kemisk proces, der fører til opsplitning af den designerede binding mellem peptidet og bæreren. Fjernelse af harpikskorn ved filtrering er imidlertid en fysisk proces, der ikke i sig selv bekræfter den korrekte udførelse af afskæringskemien. Afskæring kan også forekomme samtidig med fjernelse af beskyttende grupper og andre reaktioner. Undersøgelser af scavengers anvendt under afskæring viser, at dette trin kan påvirke forureningens profil. [8]
14. Betegner høj produktivitet af råproduktet høj peptidsrenhed?
Nej. Effektivitet beskriver mængden af genvundet materiale før fjernelse af alle uønskede bestanddele. Dette materiale kan indeholde det ønskede peptid sammen med deleterende sekvenser, modificerede strukturer, resterende beskyttende grupper og andre forureninger. Undersøgelser af rå blandinger af SPPS ved hjælp af kromatografi og massespektrometri viser, hvorfor den genvundne masse, renheden og molekylær identitet kræver en separat fortolkning. [9] En pålideligt angivet effektivitet bør derfor angive det trin, hvor den blev målt, samt om materialet allerede var blevet renset.
15. Kan SPPS bruges til at modtage lange peptidsætninger?
Ja. Gennemprøvede metoder til SPPS kan muliggøre opnåelse af meget lange kæder. I undersøgelser af automatiseret flowsyntese blev kæder med op til 164 restkonstanten opnået, som derefter blev rensede og foldet før funktionel vurdering. [10] Dette viser mulighederne for moderne peptidsyntese, men betyder ikke, at enhver sekvens med en lignende længde kan opnås med samme effektivitet. Længden er kun én faktor; aggregering afhængig af sekvensen er også vigtig; der er også tale om sidereaktioner, krav til folding og vanskeligheder ved rensning.
16. Betegner opbygningen af en epidermissekvens at udføre dens fuldstændige syntese?
Nej. Modnet epidermis indeholder atypiske strukturelle elementer, herunder ringe med svovl, der går ud over selve den lineære ordning af aminosyrer. Dette er blevet påvist i strukturelle undersøgelser. [11] Få en lineær sekvens, en forløber eller et fragment betyder således ikke automatisk syntese af en komplet modnet molekyle. En påstand om komplet syntese kræver analytiske data, der bekræfter gengivelsen af de tilsigtede bindinger og andre væsentlige strukturelle elementer.
17. Bekræfter den forventede molekylmasse den fuldstændige korrekte struktur?
Nej. At opnå den forventede molekylmasse giver værdifuld information, men selve masse taler ikke bekræftende om alle aspekter af peptids struktur og udelukker ikke alle relevante forureninger. To molekyler kan have samme nominelle masse og samtidig have forskellige stereokemiske eller strukturelle arrangementer. Undersøgelser omfattende opsplitning af epimere peptider viser, hvorfor stereokemiske forskelle kan kræve analytiske metoder, der er i stand til at identificere strukturer, der ikke kan adskilles udelukkende på grundlag af massebestemmelse. [12] Den endelige karakterisering bør derfor designes under hensyntagen til realistiske forureninger og alternative strukturer, der kan opstå under en specifik syntese.
Sammenfatning
Syntese af peptider i fast fase ændrede peptidsammensætningen, hvilket muliggjorde opretholdelse af den voksende kæde på et uopløseligt medium under gentagne indsprøjtninger, gennemførelse af reaktioner og fjernelse af opløselige reagenser. Dette letter trinvis opbygning af sekvenserne og udgør det praktiske grundlag for automatisk syntese.
Den tilsyneladende enkelhed ved denne metode bør dog ikke overstige betydningen af den kemi, der finder sted på hvert trin.
Harpiks, binder og graden af binding har betydning for de vigtige egenskaber ved syntesen. Den opløselighedsafhængige kondensering påvirker adgangen til forbindelserne i harpikset. Beskyttelsesgrupper kontrollerer, hvilke funktionelle grupper der kan reagere, mens bindingerne bygger peptidskelettet fra rest til rest. [1] [2]
Hver af disse faser har også sine begrænsninger.
Den initiale tilslutning kan påvirke den stereokemiske kvalitet. [3] Vanskelige sekvenser kan aggregere og begrænse adgangen til reagenser. [4] Kemien til at beskytte og fjerne beskyttende grupper kan fremme sidereaktioner, såsom dannelsen af aspartimid. [5] [6] Fremskyndet syntesebetingelser kan ændre graden af racemisation eller forurelsesprofilen. [7] Afkæmpeforholdene kan yderligere påvirke råproduktets sammensætning. [8]
Derfor er en korrekt opbygning af kæden ikke ensbetydende med at opnå et rent og korrekt identificeret peptid.
Genopbygningen af det rå produkt, rensningen og den strukturelle karakterisering forbliver separate trin. Kromatografi kan give oplysninger om blandingenens sammensætning og renhed, mens massespektrometri og andre analytiske metoder giver oplysninger om identiteten. Ingen enkelt analytisk resultat behøver at bekræfte alle aspekter af peptidsammensætningen. [9] [12]
Den moderne automatiserede flowsyntese viser, at SPPS kan anvendes selv ved passende udviklede betingelser på meget lange kedler. [10] Samtidig viser strukturelt komplekse peptider som epidermin, hvorfor selv rekonstruktion af en lineær aminosyresekvens kan være utilstrækkelig, hvis den modne molekyle indeholder yderligere ringe, atypiske reststoffer eller en bestemt forbindelsessammensætning. [11]
Det er bedst at forstå SPPS ikke som én enkelt reaktion, men som en række separate kemiske og analytiske stadier.
Tilslutningen angiver startpunktet. Gentagne cyklusser med sikring, frigivelse og sammenkobling opbygger den planlagte kæde. Afkobling frigør produktet. Rensing adskiller det endelige produkt fra uønskede bestanddele. Den endelige karakterisering gør det muligt at fastslå, om det isolerede materiale faktisk har den struktur og kvalitet, der er tilskrevet det.
At opdele disse faser gør det muligt at undgå flere almindelige misforståelser: en vellykket syntese bekræfter ikke automatisk renheden, høj effektivitet bekræfter ikke automatisk identiteten, og den forventede molekylmasse i sig selv bekræfter ikke fuldstændig strukturel rigtighed.
Referencer
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Peptidsyntese i fast fase: Fra standardprocedurer til syntese af svære sekvenser. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K. & Willway, H. (2020). Undersøgelse af parametre, der påvirker harpiksens svækkelse i grønne opløsningsmidler. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Anvendelse af Marfey-reagens til at kvantificere racemisering ved fastgøring af aminosyrer til faste bærere til peptidsyntese. Analytisk biokemi, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Evaluering af kombineret brug af Oxyma og HATU til at aggregere peptidsekvenser. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Aspartimideproblemet i Fmoc-baserede SPPS. Del I. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Asparimideproblemet i Fmoc-baserede SPPS. Del II. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Begrænsning af racemisering og aspartimidedannelse ved mikrobølgeteknologi til syntese af fmk-holdige peptider i fast fase. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-Benzenedimethanethiol (1,4-BDMT) som et rensende middel mod kløvning af grønnere peptidharpikser. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D., & Pallai, P. (1991). Karakterisering af råprodukter fra fastfase-peptidsyntese ved mu-HPLC/hurtig atombombardement-massespektrometri. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E. og Pentelute, B. L. (2020). Syntese af proteiner ved automatisk strømkemi. Videnskab, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: Sequencerings af et heterodetisk tetracyklisk 21-peptidamidantibiotikum. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Racemization-studier i peptidsyntese gennem separation af beskyttede epimeriske peptider ved højtydende flydende kromatografi med omvendt fase. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x