Kiinteän faskian peptiinejä koskeva synteesi, joka useimmiten kutsutaan lyhyesti SPPS:ksi (solid-phase peptide synthesis), on kemiallinen menetelmä aminohappojen rakentamisesta aminohappoa kohden, kun taas syntyvän ketjun yksi pää on kemiallisesti sidottu liukenemattomaan kantajaan.
Sen sijaan että eristelisimme syntyvän peptidin jokaisen reaktion jälkeen, kemistit jättävät sen kiinteän tilan kanssa yhdistyneenä, lisäämällä ja poistamalla lisää nestemäisiä reagensseja sekä huuhteluvesiä. Toistuvat kierrokset mahdollistavat reaktiivisen aminiryhmän paljastamisen, uuden aminohapon liittämisen ja liuottimien poiston, jotka eivät ole enää tarpeen. Kun suunnitellun aminohapporakenteen on syntynyt, peptidi voidaan irrottaa jalustasta ja sen jälkeen käsitellä ja analysoida.
Tämä prosessin organisointi on yksi tärkeimmistä syistä siihen, miksi SPPS on tullut niin tärkeäksi menetelmäksi peptidikemian alalla. Staattifaasit yksinkertaistavat monia toistuvia kemiallisia prosesseja ja mahdollistavat synteesin automatisoinnin.
Stabiilisen vaiheen yhdistämisen mukavuus ei kuitenkaan tarkoita kemiallista huipputeknologiaa.
Peptidin syntymisen liittäminen kantoliuokseen ei takaa, että jokaiselle ketjulle annetaan kaikki suunnitellut aminohapot. Se ei myöskään tarkoita, että prosessin lopussa vapautuva materiaali olisi kemiallisesti puhdas tai että sillä olisi oikea rakenne.
Kettikoneen kokoaminen, irtoaineen poistaminen ja tuotteen palauttaminen, puhdistus, henkilöllisyyden vahvistaminen ja lopullinen rakenteellinen analyysi ovat koko prosessin erillisiä osia.
Nykyiset metodologiset julkaisut osoittavat sekä SPPS:n hyödyllisyyden että tarpeen muuttaa standardeja menetelmiä, kun on kyse vaikeista sekvensseistä. Yhdessä julkaistussa menetelmässä, joka käyttää Fmoc-strategiaa, kuvataan esimerkiksi tavanomainen synteesi, mutta myös muokattu lähestymistapa aggregaatiokykyisille peptidisekvensseille. [1]
SPPS-tietämyksen ymmärtämiseksi tarvitaan siis enemmän kuin vain muistia seuraavista kemiallisista vaiheista. On myös tiedettävä, mikä on jokaisen vaiheen tarkoitus, mitä voi tapahtua väärin sen aikana ja mitä analyyttisiä kysymyksiä on vielä vastattava sen päätyttyä.
Mitä on staattisessa faskiossa tapahtuva peptidiyhdisteiden synteesi?
Syntyvä peptideeri pysyy kiinnittyneenä ja liuokset muuttuvat
Perinteisessä SPPS-menetelmässä peptidi liitetään kemiallisesti pieniin, ei-liuottaviin hiukkasiin, joita yleensä kutsutaan hartsijyväksi, sopivan kemiallisen liittimen avulla.
Siemenet pysyvät reaktiokammion sisällä, kun taas jatkossa käytettävät nestemäiset reagenssit ja liuokset siirretään ja poistetaan.
Tämä huomattavasti yksinkertaistaa toistuvaa synteesiä.
Perinteisessä vaiheittaisessa synteesissä kasvavan peptidin eristäminen ja puhdistaminen jokaisen aminohappojen lisäämisen jälkeen voi olla raskasta. SPPS:ssä syntynyt ketju pysyy sitoutuneena ei-liuottavaan vaiheeseen. Näin liuennut ylimääräinen reagenssi ja monet sivutuotteet voidaan poistaa huuhtomalla, kun taas peptidi, joka on sidoksissa elintarvike-vesiliuokseen, pysyy paikallaan.
Termi „kiinteä vaihe” voi kuitenkin johtaa väärinkäsityksiin.
Tämä ei tarkoita sitä, että peptidiyhteyksien muodostuminen tapahtuisi ilman nesteen tai liuottimen osallistumista.
Hartsia ympäröi yleensä nesteinen reaktiomateriaalilaji, ja sen vuorovaikutus liuottimella voi merkittävästi vaikuttaa synteesin etenemiseen. Reaktiomateriaalit on edelleen siirrettävä polymeerimateriaalissa tai sen ympärillä ja päästäväksesi niiden vaikuttamaan kasvavan peptidin reaktioalueille.
Peptidin liittyminen kantaja-aineeseen on yleensä kovalenttinen. Tämä tarkoittaa, että syntyvä molekyyli liittyy kantaja-aineeseen yhdisteiden sitomisen kautta.
Peptidi ei siis ole pelkästään sidottu hiukkasten väliin, kiinni suodattimessa tai löyhästi kiinni pinnan alla.
Tällainen kemiallinen yhdistyminen suunnitellaan tarkoituksella siten, että syntyvä ketju pysyy sidoksissa seuraavien reaktioiden ja huuhteluvaiheiden aikana ja että se voidaan myöhemmin vapauttaa sopivissa olosuhteissa.
Perinteinen synteesi tapahtuu C-päätä kohti N-päätä
Perinteinen lineaarinen SPPS-strategia alkaa yleensä aminohaposta, joka muodostaa valmiin peptidin C-päätteen.
Loppu liitetään kannettavaan.
Kun sopiva reaktiivinen aminiryhmä on löydetty, lisätään toinen suojaava aminohappo ja se liitetään kemiallisesti syntyvään ketjuun. Tätä prosessia toistetaan asteittain pidempään peptidiä kohti N-päätä.
On syytä korostaa tätä suuntaa, koska se eroaa proteiinien biologisesta synteesistä ribosomien kautta.
Ribosomaalinen synteesi pidentää polypeptidiä N-päätä kohti C-päätä. Perinteinen vaiheittainen SPPS rakentaa yleensä sekvenssin vastakkaiseen suuntaan.
Loppusyöteaineketju voi kuitenkin olla identtinen. Sen rakentamismenetelmä on erilainen.
Tärkeää tässä on termi „konventionaalinen”, koska peptidien kemian piiriin kuuluvat myös erikoistuneet strategiat, joissa käytetään vaihtoehtoisia yhdistämispaikkoja, fragmenttien kokoamista, ligatioreaktioita ja muita erikoistuneita ratkaisuja.
Näin ollen C-päästä N-päästä tapahtuvan reaktion kuvaus viittaa tyypilliseen vaiheittaiselle SPPS-prosessille eikä kaikkiin mahdollisiin staattisen tilan käyttäviä peptidekemiatapoja.
SPPS on vain yksi peptideiden tuotannon osatekijöistä
Staattisella vaiheella tapahtuva synteesi ei ole ainoa tapa saada peptiinejä.
Peptydit voidaan myös saada kemiallisella synteesillä liuoksessa, biologisilla ekspressiojärjestelmillä, entsymaattisilla muutoksilla, fragmenttien yhdistämisellä tai eri menetelmien yhdistelmällä.
SPPS on erityisen hyödyllinen silloin, kun tarvitaan sekvenssin valvomaa kokoamista sekä suojaamattomien, muokattujen tai muulla tavoin erikoistuneiden aminohappoblockkien käyttöä.
Vaikka yksi tietty peptideistä koskeva projekti koskisikin vain yhtä peptidityyppiä, ei aina tarvitse käyttää samaa menetelmää alusta loppuun asti.
Erilaisia peptidi-fragmentteja voidaan esimerkiksi synteettisesti muodostaa polymeerissä, puhdistaa erikseen ja yhdistää sitten muulla kemiallisella menetelmällä. Muut molekyylit saattavat edellyttää taivutusta, hapettumista, cyklisointia tai muita rakenteellisia muutoksia jo alkuperäisen lineaarisen sekvenssin saavuttua.
Valinta sopivalle reitille riippuu siis kohdemolekyylistä, sen rakenteellisesta monimutkaisuudesta sekä projektin analyyttisistä ja laadullisista vaatimuksista.
Prosessia kannattaa tarkastella sarjana jatkuvia kysymyksiä.
Liitännän liittäminen materiaalipohjaan määrittää alkupisteen ja vaikuttaa myöhempään tuotteen vapautumiskehitykseen. On kuitenkin vielä määriteltävä, onko liittäminen tapahtunut oikein ja onko stereokemiallinen yhtenäisyys säilynyt.
Ketenrakenteen kokoaminen tarkoittaa aminohappojen yhdistämistä suunnitellussa järjestyksessä. Sen jälkeen on kuitenkin tarkistettava, reagoivatko kaikki ketjut oikein ja onko syntynyt ketjuihin puuttuvia aminohappoja, lyhennettyjä tai muokattuja tuotteita.
Poistaminen ja poistaminen suojaavista ryhmistä on tarkoitettu vapauttamaan peptidi ja poistamaan tietyt kemialliset suojaimet. Itsenäinen tehokas tuotteen vapauttaminen ei kuitenkaan kerro, mitä muita aineita raaka-aineessa on.
Puhdistus tarkoittaa haluttujen aineiden erottamista ei-toivottavista aineista, mutta jopa puhdistettu fraktio edellyttää edelleen henkilöllisyyden vahvistamista ja laadun arviointia.
Lopputekninen rakenteellinen ja analyyttinen tutkimus vastaa kuitenkin kysymykseen siitä, onko eristetty aine kemiallisesti samanlaista kuin tavoitellun peptidin odotetaan olevan, ja ovatko käytetyt analyysimenetelmät sopivia aiotun käyttötarkoituksen kannalta.
Nämä ovat konseptitason vaiheet eikä laboratoriotutkimusohje. Tarkat reagenssit, laitteisto ja reaktiotilanteet riippuvat tavoitteen saavuttamasta peptidistä ja edellyttävät asianmukaisesti kehitettyä ja validoitua menetelmää.
Liimaaminen kartongiin ja ketjun kokoaminen
Hartsiliuos, liitos ja kiinnitysasteilla on erilaiset tehtävät
SPPS-asioita koskevissa keskusteluissa esiintyy usein kolme termiä: hartsiliuos, liitosaine ja lastausaste eli loading.
Ne kuvaavat samoja, mutta erilaisia ominaisuuksia.
Harts on hajoamaton materiaali, joka toimii kantavana aineena.
Liitosaine muodostaa kemiallisen yhteyden tämän kannavan ja peptidin tai ensimmäisen aminohapporadan välille. Sen kemiallinen koostumus voi vaikuttaa sekä peptidin liittymistapaan että sen myöhempään vapautumiseen.
Loading kuvailee puolestaan reaktioalueiden lukumäärää liitäntäkohtia kohti siirtolajin määrän perusteella.
Nämä käsitteet eivät ole synonyymejä.
Kaksi polymeeria voivat näyttää fyysisesti hyvin samalta, mutta niiden funktionaalit, sidokset tai sidontaprosentit voivat olla erilaisia. Nämä erot voivat vaikuttaa reaktiivisten kohtien saatavuuteen ketjun muodostamisessa, polymeerin kiinteytykseen sekä lopullisen peptidin kemialliseen muotoon irtoamisen jälkeen.
Toinen tärkeä elementti on suunnitteilla oleva ryhmä C-päätä.
Erilaisia siirtymäaine-liittymäjärjestelmiä voidaan valita esimerkiksi siten, että saa peptidiä, joka on päällystetty karboksyyliryhmällä tai amidiryhmällä.
Tämä on tärkeä kemiallinen ero.
Muutoksen terminaaliryhmässä tarkoittaa aineen itseä, ei pelkästään sen pakkaustapaa tai kuvausta.
Pienennys vaikuttaa liitettyjen ketjujen käytettävyyteen
SPPS-laitoksissa käytetyt eloaineet imevät liuotinta ja paisuvat kosketuksessa sopivan nesteen kanssa.
Tämä muuttaa polymeerin ympäristöä ja voi lisätä tai vähentää sitä tilaa, jonka läpi liuennut reagenssi on liikuttava päästäkseen kosketukseen elintarvikkeeseen liittyvien peptidiketjujen kanssa.
Pęcherzyki eivät siis ole pelkästään fyysinen mielenkiinnonkohteena.
Se voi vaikuttaa reaktiivisten ryhmien saatavuuteen synteesin aikana.
Polystyreeniä ja PEG:tä käyttävien kantojen systemaattinen tutkimus osoitti, että sellaiset ominaisuudet kuin liitoksen tyyppi ja vetyhapon määrä olivat merkittävästi yhteydessä paksunemiseen tutkituissa ympäristöystävällisemmissä liuottimissa. Lisäksi todettiin, että paksuneminen voi muuttua suoja-aineiden poistamisen aikana sekä peptidi-ketjun pidentyessä. [2]
Tämä osoittaa, että kartongin ominaisuuksia ei aina voida pitää sen pysyvinä ominaisuuksina.
Käytännössä se riippuu vinyylihartsin, liuottimen, liittimen, liitetyn peptidin ja synteesin nykyisestä vaiheesta.
Hyvä kiinteytymisprosessin sujuvuus tai reaktion suotuisa kulku yhdessä hartsin, liuottimen ja peptidin yhdistelmän osalta eivät siis tarkoita, että toinen yhdistelmä toimisi samalla tavoin.
Liittämisvaihe itsekin edellyttää laadunvalvontaa
Ensimmäinen liittymisvaihe saattaa vaikuttaa yksinkertaiseksi, koska peptidiketju alkaa vasta muodostua.
Tässä vaiheessa syntynyt virhe voi kuitenkin säilyä myös koko myöhemmässä synteesissä.
Jos ensimmäinen osa yhdistetään väärin tai prosessin aikana sen stereokemiallinen rakenne muuttuu, kaikki seuraavat osat ei tarvitse yhdistää oikein korjata alkuperäistä ongelmaa.
Vuoden 1992 tutkimuksessa kehitetty analyysimenetelmä oli tarkoitettu erityisesti mittaamaan racemisaatiota, joka tapahtuu suojausten sitomisen yhteydessä vakiomolekyyleihin. [3]
Tämän työn merkitys ulottuu sen käytetyn analyyttisen menetelmän ulkopuolelle.
Se osoittaa, että stereokemiallinen laatu voi edellyttää valvontaa jo ennen toistuvien ketjun pidentymisjaksojen alkamista.
Myös sen määrä, joka aluksi liitettiin levylle, vaatii asianmukaista tulkintaa.
Väliaineen nimellinen kertyvyystaso, kokeellisesti mitattu latausmäärä, irtoaminen jälkeen palautettu raaka-aine sekä eristetyn ja puhdistetun peptidin lopullinen tuotanto ovat eri kokoluokissa.
Niitä ei pidä pitää korvaavina indikaattoreina synteesin onnistumisesta.
Pitkämmat ketjut voivat tulla vaikeammin saataville
Kun peptidiketju pidentyy, yksittäinen molekyyli alkaa vaikuttaa omalle kemialliselle ympäristölleen.
Naapuriketjut voivat vaikuttaa toisiinsa vetyvetyvyyden sitoumusten, hydrofobisten vuorovaikutusten ja muiden molekyylien välisen voimien kautta. Joillakin sekvensseillä voi olla erityisen voimakas taipumus tällaisiin vuorovaikutuksiin.
Tämä saattaa rajoittaa pääsyä reaktiivisiin ryhmiin.
Tällaisessa tilanteessa uuden aminohapon lisääminen voi olla vaikeampaa, vaikka liittimeen olisi myös tosiasiallisesti lisätty riittävä määrä sidontaa tuottavaa ainetta.
Vaikeiden, aggregaatiota vaativien sekvensien tutkimuksessa verrattiin erilaisia yhdistämismenetelmiä ja analysoitiin saatuja raaka-aineita. Tulokset tukevat näkemystä, että prosessia olisi mukautettava tiettyyn sekvenssiin sen sijaan, että oletettaisiin olemassa olevan yksi yhdistämistekniikka, joka olisi aina paras. [4]
Se myös selittää, miksi itse hartsin tiivistysasteen tai reagenssin määrän lisääminen ei automaattisesti ratkaise kaikkia ongelmia.
Jos pääongelmana on rajoitettu pääsy reaktiivisiin paikkoihin, kysymys lisätyn reagenssin määrästä muuttuu tärkeämmäksi kysymykseksi siitä, onko se todella päätynyt oikeisiin paikkoihin ja onko reaktio suoritettu tehokkaasti ilman, että syntyy sopimattomia sivutuotteita.
Suojauksen varmistaminen, suojausryhmien poistaminen ja yhdistäminen
Suojajoukot valvovat reaktion paikkaa
Aminohapot sisältävät kemiallisia ryhmiä, jotka pystyvät osallistumaan erilaisiin reaktioihin.
Kun peptiinin kontrolloidulla liuotuksessa käytetään kemikaaleja, halutaan yleensä, että tietty aminiryhmä reagoi tietyn karboksyyliryhmän sisältävän blokin kanssa, kun taas muut potentiaalisesti reaktiiviset paikat pysyvät väliaikaisesti epäaktiivisina.
Tämän tarkoituksessa toimivat vartijaryhmät.
Neuvotellaan tilapäisesti valitut reaktioalueet, jolloin toinen alue voi osallistua suunniteltuun reaktiotapaan.
FMOC-pohjaisessa yleisesti käytössä olevassa SPPS-strategiassa kasvavan ketjun loppuryhmä jää suojaamattomana seuraavien yhdistämisvaiheiden välillä. Kun seuraava aminohappo on määrä yhdistää, väliaikainen suoja poistetaan paljastaen aminoryhmän.
Reaktiiviset sivuketjut voivat sisältää erillisiä suojausryhmiä, jotka on suunniteltu pysymään ehjinä toistuvien pääketjun rakennusjaksojen aikana.
Tavoitteena on kontrolloitu selektiivisyys.
Korkiili-ryhmää sisältävä sopiva blokki pitäisi sitoutua sopivaan aminiryhmään sen sijaan, että se johtaisi valvottamattomaan jakautumiseen tai muihin kilpaileviin reaktioihin.
Ortogonalisuus tarkoittaa mahdollisuutta poistaa suojaustoimenpiteet valikoivasti.
Ortogonalinen suojausryhmästrategia mahdollistaa yhden suojausryhmän poistamisen sellaisissa olosuhteissa, joissa muut tarvittavat suojaustoimenpiteet pysyvät riittävän puhtaana.
Tämä antaa kemistiin mahdollisuuden kontrolloidusti paljastaa erilaisia reaktioalueita eri synteesivaiheissa.
Fmoc ja Boc ovat hyvin tunnettuja termejä peptidikemiassa, mutta ne eivät tarkoita eri peptidiyhdistelmien tyyppejä eivätkä eri peptidin päätyrakenteita.
Nämä ovat suojaavia ryhmiä, jotka liittyvät erilaisiin synteesi-strategioihin ja niiden poistamiseen käytettäviin eri menetelmiin.
Tämän vuoksi kehitettävän peptidin rakenteen aikaista kemiallista muotoa on erotettava sen lopullisesta rakenteesta.
Suojaukset eivät myöskään tarjoa täyttä suojaa kaikilta mahdollisilta sivuoireilta.
Tutkimukset aspartimidin syntymistä koskevien tekijöiden vaikutuksista osoittavat esimerkiksi, että suojausstrategia, lähistöllä olevat aminohappojen jäämät sekä suojausryhmien poistumisolosuhteet voivat vaikuttaa epäpuhtauksien syntymiseen jopa hyvin tunnetuissa SPPS-menetelmissä. [5] [6]
Suojaryhmästrategia siis rajoittaa tiettyjä ei-toivottuja reaktioita, mutta se ei poista prosessin valvontaa tai lopullista analyyttistä luonnetta.
Ketterä muodostaa uuden amidiyhdisteisen sidoksen peptidin rakennekohtaan.
Sitoutumisreaktio johtaa peptidisäikeen kalvon sisällä uuden amidiyhdisteiden muodostumiseen.
Aminohappoblokki, joka sisältää karboksyyliryhmän, aktivoidaan yleensä kemiallisesti, jotta se voi reagoida tehokkaasti kasvavan proteiinin, joka on sidoksissa eläinproteiiniin, aminoryhmän kanssa.
Liukenemisen päätyttyä liuotettava ylimääräinen materiaali voidaan poistaa huuhtomalla.
Uusi yhdistetty aminohappo muuttuu sitten kasvavan ketjun viimeiseksi jäänteeksi. Sen jälkeen voidaan paljastaa sen aminogruppi ja aloittaa seuraava sitoutumisjakso.
Teoreettisesti tämän sekvenssin toistaminen mahdollistaa aminohappojen järjestyksen hallinnan valvomaan rakennusblokkien lisäämistä koskevien toimien järjestystä.
Käytännössä on kuitenkin erittäin tärkeä varoitus:
suunniteltu kemiallinen reaktio on todellakin onnistuttava oikein jokaisessa syklissä.
Jos yksi liitos on puutteellinen, osa ketjuista ei ehkä saa suunniteltua määrää.
Jos ne pysyvät kiinni kiinteässä yhdisteessä ja reagoivat oikein seuraavassa kierroksessa, syntyy delekyynisiä sekvenssejä eli peptideihin liittyviä hiukkasia, joissa puuttuu yksi tai useampi suunniteltu aminohappo.
Muut ketjut voivat jäädä lyhennettyinä.
Puristus poistaa liukenevat reagenssit ja sivutuotteet, mutta se ei poista valikoivasti kaikkia epätäydellisesti rakennettuja ketjuja, jotka ovat edelleen kovalentoisesti sidottuja kantaja-aineeseen.
Pieniä tappioita voi kertyä monissa sykleissä
SPPS:n toistuva luonne johtaa merkittävään matemaattiseen ongelmaan.
Yksittäisen vaiheen pieni epätarkkuus saattaa vaikuttaa merkityksettömältä, mutta monien toistojen jälkeen sen vaikutukset voivat kasvaa.
Katsotaanpa yksinkertaista matemaattista esimerkkiä.
Jos peptidiyhdisteessä tarvittaisiin 50 yhdistymisvaihetta, joista jokaisella olisi itsenäisesti 99% mahdollisuutta onnistuneesta päättymisestä, teoreettinen osuus molekyyleistä, jotka menestyivät läpi kaikki 50 vaihetta, olisi noin 60,5%.
Tämä on vain esimerkki.
Se olettaa, että kaikki vaiheet toimivat identtisesti ja riippumatta toisistaan. Se ei huomioi suojaavaan ryhmään kuulumisen poistamiseen liittyviä ongelmia, sivuoireita, irroittamis- ja puhdistustilojen häviöitä, aggregaatiota eikä monia muita todellisia tekijöitä.
Sen vuoksi tätä tulosta ei pidä tulkita todellisen tuotantotehon ennustamiseksi.
Esimerkki osoittaa vain, miksi jopa erittäin korkea tehokkuus yksittäisissä vaiheissa ei takaa kemiallisesti yksinkertaista raaka-ainetta useiden kymmenien toistojen jälkeen.
Siksi synteesin valvonta ja epäpuhtauksien valvonta ovat tärkeitä koko peptidin valmistusprosessin ajan, eikä vasta viimeisen aminohapon lisäämisen jälkeen.
Automaatio, lämmitys ja muut teknologiset ratkaisut voivat nopeuttaa synteesiä, mutta prosessin nopeus tulisi aina arvioida yhdessä tuotteen laadun kanssa.
Mikroaaltoavusteisen SPPS-tutkimus analysoi tyypin riippuvaa residuaation laskua ja aspartimidin syntyä osoittaen, miksi reaktiovaikutukset on edelleen mukautettava tietyn sekvenssin ominaisuuksiin. [7]
Rasvan erottaminen ja raaka-aineen palauttaminen
Poistaminen vapauttaa tuotteen kantamattomasta osasta
Kun suunniteltu peptidiketju on rakennettu, sitä tavallisesti erotetaan kemiallisesti kantamateriaalista.
Tätä vaihetta kutsutaan cleavageksi eli irtoamiseksi.
Poistaminen katkaisee tarkoituksella suunnitellun kemiallisen sidoksen peptidin ja kantajan välillä.
Käytettävästä strategisesta menetelmästä riippuen erotus voi tapahtua samanaikaisesti osien tai koko sivulankojen suojaavaan kerrokseen poistamisen kanssa. Muissa prosesseissa peptidi tai sen osa voidaan vapauttaa säilyttäen kuitenkin joitakin suojaavia ominaisuuksia, jos suunnitteilla on jatkot kemialliset muutokset.
Käytettävän vapautumiskemiallisen reaktion riippuu välittäjäaineesta ja kohdemolekyylistä.
Erilaisista peptideistä yksi vapautuu tehokkaasti, mutta se voi vahingoittaa kemiallisesti herkkiä ryhmiä toisessa.
Siksi deprotegointi kuvaa kemiallista päämäärää eikä yhtä yleistä reagenssivalikoimaa tai olosuhteita, jotka soveltuisivat kaikkiin peptideihin.
Samoin peptidi-rakenteen oikea rakenteen koostumus ei todista, että kaikki suoja-ryhmät poistettiin sitten tehokkaasti.
Kettikoneen käyttäminen ja turvajärjestelmien lopullinen poistaminen vastaavat erilaisia kemiallisia kysymyksiä ja vaativat erillisen arvioinnin.
Poistumista koskevat olosuhteet voivat vaikuttaa epäpuhtausprofiiliin
Poistaminen ei tarvitse olla kemiallisesti neutraali vaihe.
Suojarajapohjien poistaminen ja peptidin ja kantajan välisen sitoutumisen purkaminen voivat aiheuttaa reaktiivisia kemiallisia muotoja, jotka pystyvät muokkaamaan peptidia tai muiden seoksen ainesosia.
Siksi kehitettyjen menetelmien yhteydessä voidaan käyttää niin kutsuttuja scavengereitä, eli yhdisteitä, jotka erottavat tiettyjä ei-toivottuja reaktio-jälkiaineita ja vaikuttavat sivutuotteiden syntymiseen.
Vuoden 2019 tutkimuksessa analysoitiin erilaisia scavengereitä eksantadiinin erottamisen yhteydessä peptidiputkesta ja todettiin, että niiden valinta vaikutti raaka-aineen laatuun sekä havaittuun epäpuhtausprofiiliin. [8]
Tältä pohjalta ei pidä luoda yleistä puhdistusreseptuaa.
Tutkimus kuitenkin osoittaa, että tämän vaiheen olosuhteet voivat vaikuttaa tuotteen laatuun, ja siksi ne olisi arvioitava yksittäisen peptidin ja käytetyn suojausjärjestelmän perusteella.
Siksi oikea erotusprosessi on useilla tasoilla.
Peptidi on irrotettava asianmukaisesti, vaadittavat suoja-ryhmät on poistettava, kohdeaine on palautettava ja ei-toivottu kemiallinen muuntuminen on valvottava.
Rauhojen tuotteen palauttaminen ei ole lopullista puhdistusta
Po erotuksessa suoritetaan prosessi, jonka avulla peptidiä sisältävä materiaali erotetaan kiinteästä hartsista ja muista reaktiomäärän osista.
Tässä yhteydessä voidaan hyödyntää eroja liukoisuudessa, haihtuvaisuudessa tai muissa kemiallisissa ominaisuuksissa.
Näkyvän kiinteän aineen tai peptidejä sisältävän fraktion palautuminen ei kuitenkaan todista, että materiaali koostuu yksinomaan suunnitellusta tuotteesta.
Tässä vaiheessa käytetään yleensä termiä raaka-peptidi.
Se voi sisältää kohde-molekyylin sekä delekyloidut sekvenssit, lyhenneltyt ketjut, kemiallisesti muunnetut peptit, osittain puristamattomat rakenteet, reagensseista peräisin olevat materiaalit sekä muita epäpuhtauksia.
Yksittäisten epäpuhtauksien merkitys riippuu sekvenssistä, synteesin olosuhteista ja aiotusta käytöstä.
Yhdellä tutkimuksella yhdistettiin kromatografinen erotus ja massaspektrometriä tarkoituksena luokitella raaka-aineita SPPS:nä ja määrittää kunkin kromatografisen piksen tunnistamien peptideien perusteella. [9]
Se osoittaa, miksi erottelumenetelmiä ja rakenteellisia menetelmiä hyödyntäen saatavat tiedot täydentävät toinen toistaan.
Kromatografia voi osoittaa monien aineiden läsnäolon, mutta massaspektrometria voi tuottaa lisäselvityksiä, jotka auttavat määrittämään, mitä jotkut näistä aineista voivat olla.
Puhdistus ja henkilöllisyyden vahvistus vastaavat erilaisiin kysymyksiin
Puhdistus pyrkii rikastamaan tai eristämään kohde-koostumuksen muiden aineosien joukosta.
Identifiointi vastaa kuitenkin kysymykseen siitä, onko eristetty materiaali todella ominaisuuksiltaan sellainen kuin odotetaan.
Nämä kysymykset ovat osittain samat, mutta ne eivät ole sama asia.
Hyvin jaettu kromatografinen pikseli ei automaattisesti muodosta täyttä todistetta molekyylin rakenteesta.
Samanaikaisesti odotettu hiukkaskoko ei itsessään ole täydellinen arviointi puhtaudesta eikä rakenteellisesta oikeellisuudesta.
Lähes samankaltaiset sekvenssivaihtoehdot, stereoizomerit tai kemiallisesti muunnetut muodot voivat olla vaikeasti erotettavissa tai erotettavissa toisistaan.
Puhdistusmenetelmää olisi sen vuoksi arvioitava kyseisen synteesin aikaan syntyneen todellisen seoksen perusteella eikä sitä pitäisi hyväksyä riittäväksi vain siksi, että se on toiminut toisen peptidin kohdalla.
Jos lopullisella molekyyliyksiköllä myös vaaditaan disyarykkimolekyylien muodostamista, kypsyttämistä tai muuta muuntamista ketjun kokoamisen päätyttyä, syntyy lisää analyyttisiä kysymyksiä yhdistelmien oikeellisuudesta, rakenteellisesta yhdenmukaisuudesta sekä siitä, onko tarkoitettu kypsä molekyylimuoto todella saatu aikaiseksi.
Hyödyt, rajoitukset ja saasteiden alkuperä
Miksi SPPS on niin laajalti käytetty?
SPPS:n tärkeimmistä eduista yksi on mahdollisuus säilyttää syntyvä peptidei liitteenä useiden kerran käytettäessä nestemäisiä reagensseja.
Tämä yksinkertaistaa toistuvia kemiallisia toimintoja ja mahdollistaa automatisoinnin.
Kemistit voivat ottaa käyttöön suunnitellun aminohappoblockkien sekvenssin ja jos prosessikemia sen sallii, myös eräitä ei-standardeja aminohappoja ja muita muunnelmia.
Nykyiset automaattiset järjestelmät osoittavat, kuinka pitkälle tätä konseptia voidaan kehittää.
Vuoden 2020 automatisoidusta virtausyhteensyntyä koskevassa tutkimuksessa kuvailtiin proteiiniketjujen saattamista saataville, joissa oli jopa 164 aminohappoa. Myöhemmässä puhdistuksessa ja foldauksessa saatiin toimivia materiaaleja. [10]
Tämä on vaikuttava esimerkki teknisistä mahdollisuuksista.
Tämä ei kuitenkaan tarkoita, että jokainen 164 aminohapposäkeinen sekvenssi – eikä mikään pitkä peptideiksi tai proteiineiksi muuttuva proteiini – voitaisi saada yhtä helposti.
Se ei myöskään tarkoita, että puhdistus ja rakenteellinen karakterisointi tulisi tarpeettomiksi.
Tutkimus osoittaa pikemminkin, mitä tuloksia voidaan saavuttaa huolellisesti kehitetyn järjestelmän avulla sopivasti valittujen molekyyleiden avulla.
Automaatio valvoo prosessin suorittamista.
Se ei kuitenkaan pysty muuttamaan sopimattoman kemian sopivaksi.
Siksi laitteen tehokkuutta, peptidi-sekvenssia ja itse molekyylin säilyvyyttä on analysoitava yhdessä.
Miten tyypilliset epäpuhtaudet syntyvät?
SPPS:ssä voi olla useita erilaisia reittejä, jotka johtavat saasteiden syntymiseen. Sen ymmärtäminen auttaa selittämään, miksi lopulliset analyysit ovat edelleen tarpeen.
Delekyylisykli tai lyhennetty tuote voi syntyä, jos suunniteltu aminohappojen yhdistäminen ei onnistu tai jos ketjun kasvu keskeytyy. Koska virheellinen ketju voi silti pysyä sidoksissa kuituun, myöhempi huuhtelu ei välttämättä poista sitä.
Epimeraatio tarkoittaa asianomaisen keskuksen stereokemiallista rakennetta muuttavaa muutosta. Tämä on analyyttisesti erityisen tärkeää, koska epimerillä voi olla sama nimellinen molekyylipaino kuin sopiva peptidimolekyyli, mutta samalla se voi poiketa tilavuudellisesta rakenteesta.
Aspartimiinirekisteröidyt tuotteet voivat syntyä asparagiinian restien sisältävien sivutuote-reaktioiden sekvensistä riippuvien reaktioiden kautta. Kemiallisesta etenemisestä riippuen voi syntyä useampia kuin yksi tällainen tuote.
Puutteellinen poistaminen suojaavista ryhmistä tapahtuu silloin, kun poistettava ryhmä pysyy sidoksissa molekyyliin. Peptidi voi siis olla nimellisesti odotettu ketjun pituus, mutta sillä on silti virheellinen kemiallinen rakenne.
Poistamiseen liittyvät muutokset voivat tapahtua peptidin lopullisen vapautumisen tai suoja-ryhmien poistamisen yhteydessä. Tästä syystä oikea ketjunrakennus ei takaa, että peptidi käy erottamisen vaiheen läpi muutoksitta.
Yhdistymiseen liittyvät epätäydelliset reaktiot voivat kuitenkin esiintyä silloin, kun syntyvät ketjut vaikuttavat toisiinsa siten, että reaktiotilojen käyttöä rajoitetaan. Reaktiolaitteeseen riittävän reagenssin lisääminen ei kuitenkaan takaa, että jokainen reaktiotila on fyysisesti käytettävissä ja reagoituu asianmukaisesti.
Nämä ovat mahdollisia epäpuhtauksien syntymämuotoja.
Tämä ei tarkoita, että jokaisella SPPS-menetelmällä toimitettavalla puolueella on oltava kaikki mainitut epäkohtien tyypit.
Heidän merkitystään tietyssä synteesiä koskevassa tiedossa, analyyttisessä tutkimuksessa ja asianmukaisessa laadunvalvonnassa määräytyy.
Luonnollisesti muodostuneet peptidit vaativat enemmän kuin sekvenssin jäljentämistä
Joillakin peptideillä on rakenteellisesti paljon monimutkaisemmat rakenteet kuin pelkän aminohapposyklin perusteella voisi odottaa.
Hyvä esimerkki on epidermina.
Epidermyn rakenteellinen analyysi osoitti esiintymisen monissa rikkiä sisältävissä renkaissa sekä epätavanomaisissa jäämissä. [11]
Itse asiassa pelkkä aminohappojen lineaarisen järjestyksen jäljentäminen ei olisi riittävä todiste siitä, että saatiin aito kypsä epidermi.
Tämä erottelu on tärkeää epidermyn synteesiä koskevien julkaisujen tai hakujen tulkinnassa staattisessa vaiheessa.
Julkaisu voi kuvata lineaarista prekursoria, fragmenttia, analogia tai muuta sukua olevaa rakennetta, eikä sitä voi tarkistaa täydellisen kypsän molekyylin kokonaissynteesinä.
Tässä [11] mainittu rakenteellinen julkaisu kuvailee sameen epidermis ominaisuuksia; se ei ole raportti sen kokonaisesta synteesistä SPPS-menetelmällä.
Kokonaissynteesiä koskevia väitteitä on siis arvioitava hiukkasen todellisesta tavoitetusta rakenteesta eikä pelkästään sen lineaarista aminohapposykliä.
Tuotanto, puhtaus ja identiteetti on esitettävä erikseen
Kolme käsitteitä, jotka usein sekoitetaan väärin peptideiden synteesiä koskevissa keskusteluissa, ovat tehokkuus, puhtaus ja identiteetti.
Palautetun tuotteen suuri massa ei kuitenkaan tarkoita, että suurin osa siitä on tarkoituksellisesti valmistettu peptidiksi. Raaka-aine voi sisältää merkittäviä määriä epäpuhtauksia.
Myös korkea kromatografinen puhtaus ei automaattisesti vahvista kaikkia rakenteellisen identiteetin näkökohtia.
Vaikka peptidi, jonka kemiallinen rakenne on tarkasti määritelty, ei automaattisesti saa vahvistettua biologista, terapeuttista tai kliinistä käyttöä.
Nämä ovat erillisiä aiheita.
Luotettava synteesi-kuvaus pitäisi siis osoittaa, mikä oli tavoitteena oleva molekyyli, missä vaiheessa tuotantoa mitattiin, oliko analysoitu aineisto raaka vai puhdistettu ja mitä analyysitietoja käytettiin todisteiden vahvistamiseen rakenteesta.
Näin synteesiä koskevia tuloksia voidaan tulkita ja vertailla luotettavammin.
Yksittäistä prosenttiosuutta tai massa-arvoa ei pidä muuttaa yleiseksi väitteeksi siitä, että peptidi on „laadukas”, ilman tietoa siitä, mitä todellisuudessa mitattiin.
Usein kysytyt kysymykset
1. Miksi SPPS:ssä käytetään staattista vaihetta?
Kiinteä fasa säilyttää syntyvän peptidin kantaja-aineen sisällä, kun taas liukenevat reagenssit, reaktiomuutokset ja poistuvat liuokset voidaan toistuvasti lisätä ja poistaa. Tämä yksinkertaistaa merkittävästi ketjun toistuvaa kokoamista ja mahdollistaa peptidin synteesin automatisoinnin, kuten nykyaikaiset automaattiset flow-synteesimenetelmät osoittavat esimerkkinä. [10] Kantaja-aine ei kuitenkaan takaa, että jokainen reaktio sujuu täydellisesti, eikä se erota virheellisesti rakennetun peptideihin sidotun proteiinin ketjun virheellisesti rakennetusta ketjusta oikeaan. Sen pääasiallinen etu on prosessin tehostaminen. Kemiallinen selektiivisyys, reaktiotulosten täydellisyys, puhtaus ja rakenteellinen identiteetti edellyttävät edelleen erillistä arviointia.
2. Poistaako staattisessa synteesi vaiheessa puhdistuksen tarve?
Ei. Epätäydelliset peptidiperheet voivat jäädä sidottuina hartsuihin synteesin aikana ja vapautua sitten yhdessä suunnitellun tuotteen kanssa. Tutkimukset, joissa SPPS-tuotteita analysoidaan kromatografian ja massaspektrometrin avulla, osoittavat, että prosessin aikana tapahtuva puhdistus ja lopullinen puhdistus hoitavat erilaisia tehtäviä. [9] Prosessin aikana tapahtuva puhdistus poistaa ennen kaikkea liuenneet hartsin ympäröivät aineet, kun taas jälkikäsittelyssä tapahtuva puhdistus pyrkii erottamaan haluttu peptidiproteiini epätoivottavista peptidi- ja ei-peptidiaineista. SPPS yksinkertaistaa välivaiheita, mutta se ei takaa lopullista puhtautta.
3. Ovatko „staattinen fasaatio” -menetelmä ja liuotin poistaminen käytössä?
Ei. Perinteisessä SPPS:ssä liukenematon väline on yleensä ympäröity nestemäisillä reagensseilla ja liuottimilla. Liuottimet vaikuttavat hartsin fysikaaliseen ympäristöön, muun muassa sen puristuvuuden asteeseen ja siihen, miten reagenssit voivat päästä liitoksissa oleviin ketjuihin. Kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että liuottimesta riippuvaa puristuvuutta on havaittu hartsissa sekä liitoksen kemiallisiin muutoksiin, kiinnittymisasteeseen ja ketjun pidentymiseen liittyviä muutoksia. [2] Hartsia ja liuottimia siten yhdessä muodostavat reaktiomaiseman.
4. Mihin suuntaan peptidi kasvaa SPPS:n aikana?
Perinteinen vaiheittainen SPPS rakentaa tyypillisesti peptiidiä sen C-päätästä N-päätä kohti. Ensimmäinen aminohappo, joka muodostaa valmiin molekyylin C-päätä, liitetään kantajaaineeseen, ja seuraavat aminohappoerät pidentävät paljastunutta aminohappoketjun päätä. Julkaistut Fmoc-pohjaiset menetelmät osoittavat tämän tyypillisen mallin. [1] On kuitenkin erityisillä staattisen tilan menetelmillä varustetut strategiat, jotka voivat toimia eri tavoin.
5. Ovatko hartsia ja liitintä sama asia?
Ei. Hartsina on kiinteä liitosaine, kun taas liitosaine on kemiallinen yhdiste hartsin ja kasvavan peptidin välillä. Liitosaineen toiminnallisuus voi riippumatta polymeeristä vaikuttaa liitokseen, peptidin säilyvyyteen ja myöhempään peptidin vapautumiseen. Tutkimukset peptidien synteesissä käytetyistä liitosaineista osoittavat, miksi pelkän hartsityypin määrittely ei ehkä riitä koko järjestelmän toiminnan kuvaamiseen. [2]
6. Parantaako suurempi vahatason korkeus aina tuotantoa?
Ei. Korkeampi loading tarkoittaa enemmän mahdollisia yhdistymismahdollisuuksia tietylle määrälle sideainetta, mutta se ei välttämättä johda suurempaan määrään oikein rakennettuja ja hyödynnettäviä peptidejä. Yhdistymisaste voi muuttaa paikallista molekyylitilannetta ja on kokeellisesti todettu yhdeksi tekijöistä, jotka vaikuttavat hartsin kiertymiseen. [2] Jos yhdistetyt ketjut ovat liian tiivistyneitä tai voimakkaasti vuorovaikutteisia, reaktiivisten yhdistymismahdollisuudet voivat heiketä. Loading-arvoa on siksi analysoitava yhdessä hartsin ominaisuuksien, sekvenssin säilymisen, reaktiokyvyn ja lopputuotteen laadun kanssa.
7. Miksi aminohapot suojataan peptidin esittämisen aikana?
Suojaryhmät estävät tilapäisesti valittuja reaktioita osallistumasta reaktioihin, kunnes konkreettinen sidonta on syntynyt. Tämä mahdollistaa kontrolloidun, vaiheittaisen ketjunrakennuksen. Suojaryhmä ei kuitenkaan poista kaikkia sivuriskejä. Mallisysteemeissä tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet esimerkiksi, että suojaryhmästrategia ja ympäröivä sekvenssi voivat vaikuttaa aspartimidin syntyyn. [5] Suojaryhmät takaavat siis kemiallisen selektiivisuuden, mutta koko suojaus- ja irtoaminenstrategia edellyttää edelleen huolellista suunnittelua ja arviointia.
8. Mitä funktioalueiden ortogonalinen suoja tarkoittaa?
Ortogonalisuus tarkoittaa mahdollisuutta poistaa yksi suojausryhmä olosuhteissa, jotka jättävät muut tarvittavat suojaustoimet riittävän määrin ennallaan. Tämä mahdollistaa tiettyjen reaktioalueiden paljastamisen suunnitelluissa synteesivaiheissa. Vahvistetut SPPS-menetelmät perustuvat valvottuun suojaamiseen ja irrottamiseen, sen sijaan että kaikki reaktiiviset ryhmät paljastettaisiin samanaikaisesti. [1] Todellinen yhdenmukaisuus käytettyjen suojaustoimien kanssa riippuu kuitenkin jatkossakin kohdemolekyylistä ja reaktiovaatimuksista.
9. Ovatko Fmoc ja Boc eri peptidi-tyyppejä?
Ei. Fmoc ja Boc ovat suojausryhmiä ja niiden synteettiset strategiat eivät ole erilaisia peptidi-rakenteita. Eroja niiden poistamisessa koskee synteesin suuntaa, mutta tilapäistä suojauskemikaalia ei pidä sekoittaa lopulliseen kohteena olevaan peptidille. Julkaistut Fmoc-pohjaiset menetelmät osoittavat yhden yleisimmin käytetyistä SPPS-vaihtoehdoista, mutta se ei tarkoita, että jokainen peptidi täytyy saada tällä menetelmällä. [1]
10. Voiko ensimmäinen liittämisvaihe jo aiheuttaa saastumista?
Kyllä. Liitostaso voi vaikuttaa stereokemialliseen laatuaan jo ennen moninkertaista ketjun pidentämistä. Erityisesti suojaisten aminohappojen liittämisen aikaan syntyvän racemisaation määrittämiseen tarkoitettuja analyysimenetelmiä on kehitetty. [3] Tämä ei kuitenkaan tarkoita, että jokainen liitos aiheuttaa merkittävää racemisaatiota. Se osoittaa kuitenkin, että itse liitos on kemiallisesti tärkeä vaihe, jossa voi tapahtua mitattavissa olevia muutoksia, jotka on otettava huomioon yleisessä laadunarvioinnissa.
11. Miksi jotkut peptidikohdat kutsutaan vaikeiksi?
Joissakin kasvavat peptidiaketit vaikuttavat toisiinsa tai naapuriaketteihin siten, että ne rajoittavat reaktioalueen pääsyä. Vetysidoksia, hydrofobisia vuorovaikutuksia ja aggregaatiomaisia käyttäytymisiä voi vaikeuttaa myöhempää sitoutumista. Tutkimukset aggregaatiyhtymille alttiiden sekvenssien havainnoinnissa osoittavat, että sitoutumismenetelmän muuttuminen voi vaikuttaa raaka-aineen koostumukseen. [4] Syntesisvaikeus riippuu siis molekyylin ominaisuuksista ja reaktiokäytännöistä eikä pelkästään peptidin pituudesta.
12. Eikö nopeampi synteesi aina tarkoita parempaa tuotetta?
Ei. Synteettisyyden nopeus ja tuotteen laatu ovat erillisiä parametreja. Lämmitys, mikroaaltouudistus ja automaatio voivat lyhentää prosessiaikaa, mutta reaktion nopeutuminen voi myös muuttaa toivottujen ja sivutuotteiden reaktioiden välistä tasapainoa. Mikroaaltosyntetisaation tutkimukset ovat osoittaneet, että reaktiot muuttuvat muun muassa residuen määrän ja aspartimidin syntymisen mukaan, mikä viittaa siihen, että olosuhteita on valvottava asianmukaisesti. [7] Lyhyempi synteettisyyden kesto on hyödyllistä vain silloin, kun saatu materiaali täyttää myös vaaditut kemialliset ja analyyttiset kriteerit.
13. Ovatko poistaminen tarkoitus vain hartsijyvien poistaminen?
Ei. Liimojen irrottaminen on kemiallinen prosessi, joka johtaa peptidin ja kantajan välisen suunnitellun liitoksen katkeamiseen. Hartsirakenteiden suodattamisen avulla tapahtuva hartsien poisto on kuitenkin fyysisen erottelun operaatio eikä se itsessään ole todiste siitä, että irrottamisprosessi olisi suoritettu oikein. Peptidin vapautuminen voi tapahtua samanaikaisesti suoja-ryhmien poistamisen ja muiden reaktioiden kanssa. Tutkimukset, joissa on käytetty scavengerteja irrottamisprosessissa, osoittavat, että tämä vaihe voi vaikuttaa epäpuhtausprofiiliin. [8]
14. Eikö tuotteen korkea tehokkuus tarkoita peptidin korkeaa puhdistustasoa?
Ei. Teho kuvailee palautettavan materiaalin määrää ennen kaikkien ei-toivottujen komponenttien poistamista. Tämä materiaali voi sisältää kohdepeptidiä sekä delekyloidut sekvenssit, muunnostyypit, muut suoja-ryhmät ja muut epäpuhtaudet. SPPS-sekoitusten kuorimisen tutkimukset, jotka tehdään käyttämällä kromatografiaa ja massaspektrometriä, osoittavat, miksi palautettu massa, puhtaus ja molekyylitason identiteetti edellyttävät erillistä tulkintaa. [9] Tästä syystä luotettavasti esitetty teho olisi oltava ilmoitus vaiheesta, jossa se mitattiin, sekä siitä, onko materiaali jo puhdistettu.
15. Mahdollistaako SPPS pituisten peptidi-ketjujen tuottamisen?
Kyllä. Huolellisesti suunnitellut SPPS-menetelmät voivat mahdollistaa erittäin pitkien ketjujen saattamisen saataville. Automatisoidussa virtaussynteesissä tutkituissa tutkimuksissa saatiin ketjuja, jotka sisälsivät jopa 164 jäämistä, jotka sitten puhdistettiin ja taittivat ennen funktionaalista arviointia. [10] Tämä osoittaa nykyaikaisen peptidiyhdisteiden synteesin mahdollisuuksia, mutta se ei tarkoita, että jokainen vastaavan pituinen sekvenssi voidaan saada yhtä tehokkaasti. Pituus on vain yksi tekijä; myös sekvenssiin riippuva aggregaatio, sivutuotteet, taittamiseen liittyvät vaatimukset ja puhdistuksen vaikeus vaikuttavat.
16. Eikö epidermyksen sekvenssin rakentaminen tarkoita sen kokonaisvaltaisen synteesin toteuttamista?
Ei. Kypsä epidermi sisältää epätavanomaisia rakenteellisia elementtejä, mukaan lukien rikkiä sisältävät renkaat, jotka poikkeavat itse aminohappojen lineaarista järjestystä. Tämä on todistettu rakenteellisissa tutkimuksissa. [11] Lineaarisen sekvenssin, prekursorin tai fragmentin saaminen ei siis automaattisesti tarkoita täydellisen kypsän molekyylin syntyä. Täydellisen molekyylin syntyä koskevan väitteen tueksi tarvitaan analyyttisiä tietoja, jotka vahvistavat aiotun yhdistelmien ja muiden olennaisten rakenteellisten elementtien toistamista.
17. Varmistaako odotettu hiukkasmassa rakenteen täydellisen oikeellisuuden?
Ei. Odotettu hiukkaskoko on arvokasta tietoa, mutta se itsessään ei vahvista kaikkia peptidin rakenteen näkökohtia eikä poista kaikkia merkityksellisiä epäpuhtauksia. Kaksi molekyyliä voi olla saman nimellisen massan omaavia, mutta niiden stereokemian tai tietyn rakenteen vuoksi eroavaiset. Tutkimukset epimeryyppien peptideistä osoittavat, miksi stereokemialliset erot voivat edellyttää analyysimenetelmiä, jotka pystyvät erottamaan rakenteita, joita ei voida erottaa pelkän massan mittauksen perusteella. [12] Lopputulosta on siksi suunniteltava realististen epäpuhtauksien ja vaihtoehtoisien rakenteiden huomioon ottamiseen, jotka voivat syntyä tietyn synteesin aikana.
Yhteenveto
Peptidien synteesi staattisessa tilassa muutti peptideja koskevaa kemiikkaa, mahdollistaen kasvavan ketjun säilyttämisen likoavassa kannessa moninkertaisissa liuottamisten, reaktioiden ja liuotavien reagenssien poistamisen yhteydessä. Tämä helpottaa sekvenssin vaiheittaista rakentamista ja on käytännön perusta automaattiselle synteesille.
Tämän menetelmän ilmeinen yksinkertaisuus ei kuitenkaan saisi vääristellä sitä kemiologiaa, joka tapahtuu jokaisessa vaiheessa.
Hartsiesteri, liitosaine ja kiinnitysaste vaikuttavat synteesin keskeisiin ominaisuuksiin. Liuotinta riippuvainen kiinteytyminen vaikuttaa hartsireleihin liittyvien ketjujen saatavuuteen. Suojarajat säätävät, mitkä funktionaalit voivat reagoida, kun taas sidontarutkit rakentavat peptidi-rakenteen jäljelle jääneiden osien välille. [1] [2]
Jokaisella näistä vaiheista on myös omat rajoituksensa.
Alkuvaiheen yhdistäminen voi vaikuttaa stereokemialliseen laatuun. [3] Vaikeat sekvenssit voivat lisätä reagenssien saatavuutta ja rajoittaa niiden käyttöä. [4] Suojainryhmien suojaamiseen ja poistamiseen käytettävä kemikaaliaineisto voi edistää sivutuotteiden syntyä, kuten aspartimidin syntyä. [5] [6] Nopeammat synteesin edellytykset voivat muuttaa racemisaation asteita tai epäpuhtausprofiilia. [7] Kierrätysohjelmat voivat lisäksi vaikuttaa raaka-aineen koostumukseen. [8]
Siksi ketjun oikea rakentaminen ei kuitenkaan tarkoita puhdasta ja oikein tunnistettua peptidejä.
Rauhojen tuotteen talteenotto, puhdistus ja rakenteellinen karakterisointi ovat erillisiä vaiheita. Kromatografia voi tuottaa tietoa sekoituksen koostumuksesta ja puhtaudesta, kun taas massaspektrometria ja muut analyysimenetelmät tuottavat tietoa identiteetistä. Mikään yksittäinen analyysitulos ei välttämättä täytä kaikkia peptidin rakenteen näkökohtia. [9] [12]
Nykyajan automatisoitu virtuaalisyntesis osoittaa, että sopivasti kehitettyjen olosuhteiden ollessa käytettävissä SPPS:ää voidaan käyttää jopa erittäin pitkissä ketjuissa. [10] Samalla strukturoidut peptitit, kuten epidermiini, osoittavat, miksi lineaarisen aminohapposyklin itsensä syntymä voi olla riittämätön, jos kypsä molekyyli sisältää lisäkiertoja, epätavanomaisia jäämiä tai tiettyä yhdistelmästä koostuvaa rakennetta. [11]
SPPS:tä on parasta ymmärtää ei yksittäisenä reaktionäytelmänä vaan erillisten kemiallisten ja analyyttisten vaiheiden sarjana.
Liittäminen määrittää lähtöpisteen. Toistuvat suojaus-, irrottaminen- ja yhdistämisjaksojen avulla luodaan suunniteltu ketju. Irrottaminen vapauttaa tuotteen. Puhdistus erottaa tavoitekomponentin ei-toivotuista aineosista. Lopputuloksen avulla voidaan määrittää, onko eristetty materiaali todella samanlainen kuin sen oletetaan olevan ja onko se laadukasta.
Näiden vaiheiden erottaminen auttaa välttämään useita yleisiä väärinkäsityksiä: onnistunut synteesi ei automaattisesti vahvista puhtautta, korkea tuotanto ei automaattisesti vahvista identiteettiä, eikä odotettu hiukkaskoko itsessään todista rakenteellisen oikeellisuuden täyttymistä.
Viitteet
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Kiinteä-faseen peptidi-synteesi: standardeista menetelmistä vaikeiden sekvenssien synteesiin. Nature Protocols, 2(12), 3247–3256. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.454
- Amadi-Kamalu, C., Clarke, H., McRobie, M., Mortimer, J., North, M., Ran, Y., Routledge, A., Sibbald, D., Tickias, M., Tse, K. & Willway, H. (2020). Vihreissä liuottimissa olevien hartsien liukenemiseen vaikuttavien parametrien tutkimus. ChemistryOpen, 9(4), 431–441. https://doi.org/10.1002/open.202000030
- Adamson, J. G., Hoang, T., Crivici, A., & Lajoie, G. A. (1992). Marfeyn reagenssin käyttö määrittämään racemisoitumista aminohappojen kiinnittämisen jälkeen kiinteisiin tukipohjiin peptidisynteesin aikaan. Analyyttinen biokemia, 202(1), 210–214. https://doi.org/10.1016/0003-2697%2892%2990229-z
- Caporale, A., Doti, N., Sandomenico, A., & Ruvo, M. (2017). Oxyma- ja HATU-lääkkeen yhdistetyn käytön arviointi peptidi-sekvenssien yhdistämisessä. Journal of Peptide Science, 23(4), 272–281. https://doi.org/10.1002/psc.2977
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Weiler, P., & Vorherr, T. (2003). Asparmiinipolymeerien ongelma Fmoc-pohjaisessa SPPS-menetelmässä. Toinen osa. Journal of Peptide Science, 9(1), 36–46. https://doi.org/10.1002/psc.430
- Mergler, M., Dick, F., Sax, B., Stähelin, C., & Vorherr, T. (2003). Asparimidi-ongelma Fmoc-pohjaisessa SPPS-menetelmässä. Toinen osa. Journal of Peptide Science, 9(8), 518–526. https://doi.org/10.1002/psc.473
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., & Collins, J. M. (2007). Racemisoitumisen ja aspartimidin muodostumisen rajoittaminen mikroaaltotehostetussa Fmoc-kiinteävaihepeptidisynteesissä. Journal of Peptide Science, 13(3), 143–148. https://doi.org/10.1002/psc.804
- Pawlas, J., Svensson, T., & Rasmussen, J. H. (2019). 1,4-benzenedimetanoli (1,4-BDMT) vihreämpien peptiiriresinien erottelussa hajoittavana aineena. RSC Advances, 9(67), 38928–38934. https://doi.org/10.1039/c9ra08553j
- McKellop, K., Davidson, W., Hansen, G., Freeman, D. & Pallai, P. (1991). Kovan tuotteen luokittelu kiinteä-fase-peptidisynteesistä mu-HPLC/nopea atomiammuntamassa-spektrometrin avulla. Peptide Research, 4(1), 40–46. PubMed
- Hartrampf, N., Saebi, A., Poskus, M., Gates, Z. P., Callahan, A. J., Cowfer, A. E., Hanna, S., Antilla, S., Schissel, C. K., Quartararo, A. J., Ye, X., Mijalis, A. J., Simon, M. D., Loas, A., Liu, S., Jessen, C., Nielsen, T. E. & Pentelute, B. L. (2020). Proteiinien synteesi automaattisella virtuaalikemian menetelmällä. Tiede, 368(6494), 980–987. https://doi.org/10.1126/science.abb2491
- Allgaier, H., Jung, G., Werner, R. G., Schneider, U., & Zähner, H. (1986). Epidermin: heterodiregisen tetracykliininen 21-peptidiamiidiantibiootin sekvensointi. European Journal of Biochemistry, 160(1), 9–22. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1986.tb09933.x
- Miyazawa, T., Otomatsu, T., Yamada, T., & Kuwata, S. (1992). Raseerausopinnot peptidiyhdisteiden synteesissä suojaamattomien epimeristen peptideiden erotuksella käänteisvaiheisen korkean suorituskyvyn nestekromatografian avulla. International Journal of Peptide and Protein Research, 39(3), 229–236. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00794.x