La síntesis de péptidos en fase sólida, más comúnmente conocida como SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida), es un método químico para construir péptidos a partir de aminoácidos uno tras otro, mientras que un extremo del enlace formado permanece químicamente unido al vehículo insoluble.
En lugar de aislar el péptido formado después de cada reacción, los químicos lo mantienen unido a la fase sólida, introduciendo y eliminando los reactivos líquidos y los disolventes que se utilizan. Los ciclos repetidos permiten descubrir la parte reactiva de la molécula, unir el siguiente aminoácido y eliminar los componentes solubles que ya no son necesarios. Una vez completada la secuencia de aminoácidos prevista, el péptido se puede separar del soporte y luego someter a un proceso adicional de análisis y caracterización.
Esta organización del proceso es uno de los principales motivos por los que la SPPS se ha convertido en una técnica tan importante en la química de los péptidos. La fase fija simplifica la realización de muchas operaciones químicas repetitivas y ha permitido la automatización de la síntesis.
La comodidad de la síntesis en fase fija no significa, sin embargo, una garantía química de la excelencia.
La unión del péptido en desarrollo con el vehículo no garantiza que cada cadena reciba todas las aminoácidos planificados. Tampoco significa que el material liberado al final del proceso sea químicamente puro ni que tenga una estructura correcta.
El plegado del alambre, la desconexión y la recuperación del producto, la purificación, la confirmación de la identidad y la caracterización estructural final son partes separadas del proceso completo.
Las publicaciones metodológicas actuales muestran tanto la utilidad del SPPS como la necesidad de modificar los métodos estándar en el caso de secuencias difíciles. En una de las metodologías publicadas que utilizan la estrategia Fmoc, se describe, por ejemplo, la síntesis rutinaria, pero también un enfoque modificado para secuencias peptídicas susceptibles a la agregación. [1]
Por lo tanto, para comprender el SPPS se requiere algo más que memorizar las etapas químicas siguientes. También es necesario saber cuál es el objetivo de cada etapa, qué puede salir mal durante ella y qué preguntas analíticas aún es necesario responder después de su finalización.
¿Qué es la síntesis de péptidos en fase sólida?
El péptido resultante permanece unido y los disolventes cambian.
En la SPPS convencional, el péptido se une químicamente a pequeñas partículas insolubles, normalmente llamadas partículas de resina, mediante un enlace químico adecuado.
Las partículas permanecen en el sistema de reacción mientras que los otros reactivos líquidos y los disolventes que se filtran son introducidos y eliminados.
Esto simplifica considerablemente la síntesis repetitiva.
En la síntesis clásica en fase continua, la separación y purificación del péptido en crecimiento después de cada adición de aminoácido puede ser un proceso engorroso. En SPPS, la cadena formada permanece unida a la fase insoluble. Esto permite eliminar los aditivos solubles en exceso y muchos productos secundarios mediante el lavado, mientras que el péptido unido a la fita permanece en su lugar.
Sin embargo, el término „fase estable” puede dar lugar a malentendidos.
Esto no significa que la formación de enlaces peptídicos ocurra sin la participación de un líquido o un disolvente.
La resina suele estar rodeada por un medio reactivo líquido y su interacción con el disolvente puede influir significativamente en el curso de la síntesis. Los reactivos aún deben desplazarse en el medio polimérico o alrededor de él y llegar a los sitios reactivos del péptido en crecimiento.
La unión del péptido al vehículo suele ser de tipo covalente. Esto significa que la molécula resultante se une al vehículo mediante un enlace químico.
El péptido, por lo tanto, no está simplemente atrapado entre las partículas, atrapado por un filtro o depositado de forma libre sobre la superficie.
Esta combinación química se diseña de forma deliberada para que el enlace formado permanezca unido durante las siguientes reacciones y etapas de lavado, y posteriormente pueda liberarse en las condiciones adecuadas.
La síntesis convencional se lleva a cabo desde el extremo C hacia el extremo N.
La estrategia lineal clásica de SPPS normalmente comienza con un aminoácido que, en el péptido final, constituirá su extremo C.
El resto se conecta al soporte.
Tras la adición de la correspondiente grupo amino reactivo, se introduce otro aminoácido protegido y se une químicamente al nuevo enlace formado. La repetición de este proceso prolonga gradualmente el péptido hacia el extremo N.
Es importante destacar este camino, ya que difiere de la síntesis biológica de proteínas por los ribosomas.
La síntesis ribosómica prolonga el polipéptido desde el extremo N hacia el extremo C. La SPPS convencional generalmente construye la secuencia en la dirección opuesta.
Sin embargo, la secuencia final de aminoácidos puede ser idéntica. Su construcción varía.
Es importante aquí la definición de „convencional”, ya que la química de los péptidos también incluye estrategias especializadas que utilizan sitios de unión alternativos, plegamiento de fragmentos, reacciones de ligación y otras soluciones no estándar.
La descripción del camino desde el extremo C hasta el extremo N se refiere a un proceso típico de SPPS, y no a todos los posibles métodos de química peptídica que utilizan una fase fija.
SPPS es solo uno de los componentes de la producción de péptidos
La síntesis en fase sólida no es la única forma de obtener péptidos.
Los péptidos también pueden obtenerse mediante síntesis química en disolución, sistemas de expresión biológicos, transformaciones enzimáticas, ligación de fragmentos o combinaciones de diferentes métodos.
SPPS es especialmente útil cuando se necesita una síntesis controlada de secuencias y el uso de bloques de aminoácidos especializados, modificados o de otra manera.
Incluso dentro de un mismo proyecto relacionado con un péptido específico, no siempre se debe aplicar la misma metodología desde el principio hasta el final.
Los fragmentos individuales del péptido pueden, por ejemplo, ser sintetizados en una resina, purificados por separado y luego combinados mediante otro método químico. Otras moléculas pueden requerir plegamiento, oxidación, ciclación o transformaciones estructurales adicionales una vez que se haya obtenido una secuencia lineal inicial.
La elección de la vía adecuada depende, por lo tanto, de la molécula final, de su complejidad estructural y de los requisitos analíticos y cualitativos del proyecto.
El proceso vale la pena considerarlo como una serie de preguntas sucesivas.
La adición al soporte marca el punto de partida y afecta a la posterior química de liberación del producto. Sin embargo, todavía es necesario determinar si la adición se produjo correctamente y si se mantuvo la integridad estereoquímica.
El plegamiento de la cadena tiene como objetivo unir los aminoácidos en la secuencia prevista. Sin embargo, es necesario comprobar si todas las cadenas reaccionaron correctamente y si no se formaron secuencias con aminoácidos faltantes, productos acortados o modificados.
La despolimerización y la eliminación de los grupos protectores tienen como objetivo liberar el péptido y eliminar los protectores químicos específicos. Sin embargo, el propio efecto eficaz de la despolimerización no indica qué otras sustancias se encuentran en el material crudo.
El tratamiento de purificación sirve para separar el material deseado de los componentes no deseados, pero incluso la fracción purificada aún requiere la confirmación de la identidad y la evaluación de la calidad.
La caracterización estructural y analítica final, en cambio, tiene como objetivo responder a la pregunta de si el material aislado tiene las propiedades químicas esperadas para el péptido objetivo y si los métodos analíticos utilizados son adecuados para el uso previsto.
Estos son pasos conceptuales y no una instrucción de laboratorio. Los reactivos, la equipación y las condiciones de reacción dependen del péptido objetivo y requieren una metodología bien desarrollada y validada.
Unión con la resina y plegado del cordón
La resina, el adhesivo y el grado de adhesión cumplen funciones diferentes
En los debates sobre SPPS a menudo se mencionan tres términos: la resina, el ligante y el grado de adición, es decir, el loading.
Ellas describen propiedades relacionadas pero distintas.
La resina es un material insoluble que sirve de soporte.
El ligando proporciona una conexión química entre este portador y el péptido o la primera secuencia de aminoácidos. Su estructura química puede influir tanto en la forma en que se une el péptido como en su posterior liberación.
Mientras que la carga describe el número de puntos de conexión reactivos en relación con la cantidad de soporte.
Estos conceptos no son sinónimos.
Dos polímeros pueden parecer físicamente muy similares, pero al mismo tiempo tener grupos funcionales, enlaces o grados de polimerización diferentes. Estas diferencias pueden influir en la disponibilidad de sitios reactivos durante la formación de la cadena, en la reticulación del polímero y en la forma química del péptido final tras la despolimerización.
Otro elemento importante es el grupo previsto en el extremo C.
Pueden seleccionarse diferentes sistemas soporte-ligando, por ejemplo, de manera que se obtenga un péptido terminado con un grupo carboxílico o amido.
Esta es una diferencia química importante.
El cambio de grupo terminal implica un cambio en la propia molécula, y no solo en la forma en que se empaqueta o describe.
El encogimiento afecta el acceso a los cadenas conectadas
Muchas de las sustancias que se utilizan en SPPS absorben el disolvente y se inflan al entrar en contacto con el medio líquido adecuado.
Esto modifica el entorno polimérico y puede aumentar o reducir el espacio a través del cual los reactivos disueltos deben desplazarse para llegar a los cadenas peptídicas relacionadas con la proteína.
El alargamiento no es, pues, simplemente una curiosidad física.
Puede influir en la disponibilidad de grupos reactivos durante la síntesis.
Un estudio sistemático de los vehículos basados en poliestireno y PEG reveló que propiedades como el tipo de ligando y el grado de polimerización de la resina influyeron significativamente en la hinchazón en los disolventes más ecológicos estudiados. También se determinó que la hinchazón puede variar durante la eliminación de los grupos protectores y a medida que el enlace peptídico se alarga. [2]
Esto demuestra que las propiedades de la resina no siempre se pueden considerar como propiedades constantes de la misma.
En la práctica, depende de la interacción de la resina, el disolvente, el ligante, el péptido unido y el estado actual de la síntesis.
Un buen rendimiento o un buen curso de la reacción para una combinación específica de resina, disolvente y péptido no significa que otra combinación tenga un comportamiento idéntico.
El propio proceso de conexión también requiere control de calidad.
La primera etapa de la unión puede parecer simple, ya que el enlace peptídico solo está empezando a formarse.
Sin embargo, el error introducido en esta etapa puede permanecer presente durante toda la síntesis posterior.
Si la primera fracción se une incorrectamente o durante este proceso su configuración estereoquímica cambia, la adición correcta de todas las fracciones siguientes no necesariamente resolverá el problema inicial.
En un estudio realizado en 1992 se desarrolló un método analítico diseñado específicamente para medir la racemización que se produce durante la incorporación de aminoácidos protegidos a los vehículos estables. [3]
El significado de esta labor va más allá de la propia metodología analítica utilizada.
Esto demuestra que la calidad estereoquímica puede requerir controles incluso antes de que comience el proceso de alargamiento del bucle.
Además, la cantidad de material que inicialmente se adjuntó al soporte también requiere una interpretación adecuada.
El grado nominal de ligadura de la resina, el contenido de carga medido experimentalmente, la cantidad de material crudo recuperado tras la despolimerización y la productividad final del péptido aislado y purificado son magnitudes distintas.
No deben ser considerados indicadores alternativos del éxito de la síntesis.
Las cadenas más largas pueden volverse más difíciles de encontrar
A medida que el enlace peptídico se alarga, la propia molécula unida comienza a influir en su entorno químico.
Las cadenas adyacentes pueden interactuar entre sí mediante enlaces hidrófilos, interacciones hidrofóbicas y otras fuerzas intercáridicas. Algunas secuencias pueden mostrar una tendencia particularmente fuerte hacia tales interacciones.
Esto puede limitar el acceso a los grupos reactivos.
En tal situación, la incorporación de otro aminoácido puede resultar más difícil, incluso si se ha introducido en el sistema una cantidad aparentemente suficiente de reactivo de unión.
En un estudio sobre secuencias difíciles y susceptibles de agregación, se compararon diferentes métodos de agrupación y se analizaron los productos finales obtenidos. Los resultados apoyan la idea de que el proceso debe adaptarse a la secuencia específica, en lugar de asumir la existencia de una estrategia de agrupación que siempre sea la mejor. [4]
Esto también explica por qué el simple aumento del grado de aglutinación de la resina o la cantidad de reactivo no resuelve automáticamente todos los problemas.
Si el problema fundamental es el acceso limitado a los sitios reactivos, lo que se vuelve más importante que la pregunta sobre la cantidad de reactivo añadido se convierte en la cuestión de si realmente llegó a los sitios correctos y si la reacción tuvo lugar de manera eficiente sin la formación de cantidades indeseables de productos secundarios.
Protección, eliminación de grupos de protección y vinculación
Los grupos de protección controlan el lugar de la reacción
Las aminoácidos contienen grupos químicos capaces de participar en diversas reacciones.
Durante la formulación controlada del péptido, los químicos generalmente desean que un grupo amino específico reaccione con un bloque específico que contiene un grupo carboxilo, mientras que otros sitios potencialmente reactivos permanecen temporalmente inactivos.
Es precisamente para esto que sirven los grupos de protección.
Bloquean temporalmente los lugares de reacción seleccionados, permitiendo que otro lugar participe en la reacción planificada.
En la estrategia SPPS generalmente utilizada, basada en Fmoc, el grupo amino final de la cadena creciente permanece protegido entre las etapas siguientes de la unión. Cuando se debe unir el siguiente aminoácido, la protección temporal se elimina, dejando al descubierto el grupo amino.
Las cadenas laterales reactivas pueden tener grupos protectores separados, diseñados para permanecer intactos durante los ciclos de construcción repetidos del segmento principal.
El objetivo es la selectividad controlada.
Un bloque adecuado que contenga un grupo carboxílico debería unirse a un grupo amino adecuado, en lugar de conducir a una desalineación no controlada o a otras reacciones competitivas.
La ortogonalidad significa la posibilidad de eliminar de forma selectiva los mecanismos de protección.
La estrategia ortogonal de grupos de protección permite eliminar un grupo de protección en condiciones en las que los demás elementos de seguridad necesarios se mantienen suficientemente intactos.
Esto permite al químico descubrir de forma controlada los diferentes sitios reactivos en los distintos pasos de la síntesis.
El Fmoc y el Boc son términos bien conocidos en la química de los péptidos, pero no indican los diferentes tipos de enlaces peptídicos ni las diferentes estructuras finales del péptido.
Se trata de grupos protectores relacionados con diferentes estrategias de síntesis y diferentes métodos de su eliminación.
Por lo tanto, la ruta química temporal utilizada durante la construcción del péptido debe distinguirse de su estructura final.
Los medicamentos no proporcionan protección completa contra todas las reacciones adversas posibles.
Los estudios sobre la formación de aspartimidina, por ejemplo, muestran que la estrategia de protección, las cadenas de aminoácidos adyacentes y las condiciones de eliminación de los grupos protectores pueden influir en la formación de contaminantes incluso en métodos SPPS bien conocidos. [5] [6]
La estrategia de grupos de protección, por lo tanto, limita las reacciones indeseables específicas, pero no elimina la necesidad de controlar el proceso ni la caracterización analítica final.
La unión crea otra unión amidada del esqueleto peptídico.
La reacción de acoplamiento conduce a la formación de otra unión amidada en el esqueleto del péptido.
El bloque de aminoácidos que contiene un grupo carboxilo suele ser activado químicamente para que pueda reaccionar eficazmente con el grupo amino descubierto del péptido en crecimiento unido a la proteína huésped.
Tras completar el acoplamiento, el exceso de material disuelto se puede eliminar mediante un lavado.
El aminoácido recién añadido entonces se convierte en la última parte del cadena creciente. Luego se puede revelar su grupo amino y comenzar otro ciclo de unión.
Teóricamente, repetir esta secuencia permite controlar la secuencia de aminoácidos mediante el control de la secuencia de introducción de los bloques constructivos.
En la práctica, sin embargo, existe una advertencia muy importante:
La reacción química planificada debe realmente llevarse a cabo correctamente en cada ciclo.
Si una conexión es incompleta, parte de los hilos no recibirá el resto previsto.
Si permanecen unidos a la resina y reaccionan correctamente en el siguiente ciclo, pueden producirse secuencias delecionales, es decir, moléculas de péptido que carecen de uno o varios aminoácidos planificados.
Otros cadenas pueden permanecer cortas.
El lavado elimina los reactivos solubles y los productos secundarios, pero no elimina selectivamente todos los cadenas incorrectamente formadas que siguen estando covalentemente unidas al vehículo.
Las pequeñas pérdidas pueden acumularse en muchos ciclos.
El carácter repetitivo del SPPS conduce a un problema matemático importante.
Una pequeña imperfección en un solo paso puede parecer insignificante, pero tras muchas repeticiones sus efectos pueden acumularse.
Consideremos un ejemplo matemático simple.
Si la síntesis de un péptido requiriera 50 etapas de unión y cada una de ellas tuviera por sí misma una probabilidad de éxito del 99%, el porcentaje teórico de moléculas que pasarían con éxito por todas las 50 etapas sería de aproximadamente el 60,5%.
Esto es solo una ilustración.
Supone que todas las etapas se comportan de manera idéntica e independiente. No tiene en cuenta los problemas de eliminación de los grupos protectores, las reacciones adversas, las pérdidas durante la desincrustación y la purificación, la agregación ni muchos otros factores reales.
Por lo tanto, no se debe interpretar este resultado como una predicción de la verdadera productividad de la producción.
El ejemplo muestra simplemente por qué incluso una productividad muy alta de los pasos individuales no garantiza un producto bruto químicamente simple tras varias decenas de repeticiones.
Por eso, el monitoreo de la síntesis y el control de las contaminaciones son importantes durante todo el proceso de síntesis de un péptido, y no solo después de la adición del último aminoácido.
La automatización, el calentamiento y otras soluciones tecnológicas pueden acelerar la síntesis, pero la velocidad del proceso siempre debe ser evaluada junto con la calidad del producto.
El estudio sobre la SPPS con microondas analizó la retención de residuos dependiente del tipo y la formación de aspartimidina, demostrando por qué las condiciones de la reacción aún deben adaptarse a las propiedades de la secuencia específica. [7]
Desprendimiento y recuperación del producto crudo
La desprendimiento libera el producto del soporte
Después de construir la secuencia peptídica planificada, normalmente se debe separar químicamente del vehículo.
Este paso se denomina escisión, es decir, desprendimiento.
La escisión interrumpe la conexión química deliberadamente diseñada entre el péptido y el vehículo.
Dependiendo de la estrategia utilizada, la desacetilación puede ocurrir simultáneamente con la eliminación de partes o todas las cadenas protectivas laterales. En otros procesos, el péptido o su fragmento puede liberarse manteniendo algunas de las protecciones, si se planifican transformaciones químicas posteriores.
La química de liberación adecuada depende del ligando y de la molécula objetivo.
Las condiciones que liberan efectivamente un péptido pueden dañar la molécula química de otro con la misma eficacia.
Por eso, la desacetilación describe un objetivo químico, y no un conjunto universal de reactivos o condiciones adecuadas para todos los péptidos.
De la misma manera, la construcción correcta del esqueleto del péptido no prueba que todos los grupos protectores hayan sido posteriormente eliminados de manera efectiva.
El plegado del cordón y la eliminación final de los dispositivos de seguridad responden a diferentes preguntas químicas y requieren una evaluación específica.
Las condiciones de desinfección pueden influir en el perfil de contaminación
La desacetilación no tiene que ser un proceso químicamente neutro.
La eliminación de los grupos protectores y la ruptura del enlace peptídico con el soporte pueden provocar la formación de formas químicas reactivas capaces de modificar el péptido o otros componentes de la mezcla.
Por eso, en los métodos desarrollados pueden utilizarse los llamados scavengers, es decir, compuestos que captan los productos reactivos no deseados específicos e influyen en la formación de productos secundarios.
En un estudio de 2019 se analizaron varios scavengers durante la extracción de exenatida de la resina peptídica y se demostró que su selección influyó en la calidad del producto bruto y en el perfil de contaminantes observado. [8]
No hay que basar esta receta en una receta universal para la desintoxicación.
Sin embargo, el estudio muestra que las condiciones de este paso pueden influir en la calidad del producto y, por lo tanto, deben evaluarse para cada péptido y el sistema de grupos protectores utilizado.
El proceso de desprendimiento adecuado tiene, por lo tanto, varios aspectos.
El péptido debe ser separado de manera adecuada, los grupos protectores requeridos deben eliminarse, el material objetivo debe recuperarse y las transformaciones químicas indeseables deben controlarse.
La recuperación del producto crudo no es un proceso de purificación final
Después de la despolimerización, se lleva a cabo un proceso que permite separar el material que contiene el péptido de la resina fija y de las demás partes de la mezcla reactiva.
Al hacerlo, se pueden aprovechar las diferencias en la solubilidad, volatilidad u otras propiedades químicas.
Sin embargo, el retorno de una sedimentación visible o de una fracción que contiene péptido no prueba que el material esté compuesto exclusivamente por el producto deseado.
En esta etapa, generalmente se habla de un péptido crudo.
Puede contener la molécula diana junto con secuencias de deleción, cadenas acortadas, péptidos químicamente modificados, estructuras parcialmente desprotegidas, materiales procedentes de reactivos y otras impurezas.
La importancia de las distintas contaminantes depende de la secuencia, las condiciones de síntesis y el uso previsto.
En uno de los estudios, se combinó el análisis cromatográfico con la espectrometría de masas para caracterizar los productos SPPS crudos y asignar los distintos puntos cromatográficos a los péptidos específicos. [9]
Esto demuestra por qué la información obtenida mediante los métodos de separación y estructurales se complementa mutuamente.
La cromatografía puede revelar la presencia de muchos componentes, mientras que la espectrometría de masas puede proporcionar información adicional que ayuda a determinar qué pueden ser algunos de ellos.
La verificación y el reconocimiento de la identidad responden a diferentes preguntas.
El purificación tiene como objetivo enriquecer o aislar la molécula objetivo de entre otros componentes.
La identificación, por su parte, responde a la pregunta de si el material aislado realmente tiene las propiedades químicas esperadas.
Estas preguntas se complementan parcialmente, pero no son la misma cosa.
Un pico cromatográfico bien definido no constituye automáticamente una prueba completa de la estructura de la molécula.
De la misma manera, obtener la masa molecular esperada por sí sola no es una evaluación completa de la pureza ni de la corrección estructural.
Las variantes de la secuencia, las estereoisómeras o las formas químicamente modificadas que están estrechamente relacionadas pueden ser difíciles de distinguir o de separar.
La metodología de purificación debe, por lo tanto, ser evaluada en función de la mezcla real formada durante la síntesis en cuestión, y no debe considerarse suficiente simplemente porque haya funcionado en el caso de otro péptido.
Si la molécula final también requiere la formación de puentes disiarcicos, ciclicaciones u otras transformaciones después de la formación del enlace, surgen nuevas preguntas analíticas sobre la corrección de los enlaces, la homogeneidad estructural y si se obtuvo realmente la forma madura deseada de la molécula.
Ventajas, limitaciones y fuentes de contaminación
¿Por qué la SPPS está tan ampliamente utilizada?
Una de las ventajas más importantes del SPPS es la posibilidad de mantener el péptido formado en un soporte durante la repetición de la sustitución de los reactivos líquidos.
Esto simplifica las operaciones químicas repetitivas y permite la automatización.
Los químicos pueden introducir una secuencia planificada de bloques constructivos de aminoácidos, y si la química del proceso lo permite, también algunos aminoácidos no estándar y otras modificaciones.
Los sistemas automatizados actuales muestran hasta dónde se puede desarrollar esta idea.
En un estudio sobre la síntesis de flujo automatizada de 2020 se describió la obtención de cadenas proteicas que contenían hasta 164 restos de aminoácidos. Después del posterior purificación y plegamiento, se obtuvieron materiales funcionales. [10]
Es una impresionante demostración de las posibilidades técnicas.
Sin embargo, esto no significa que cualquier secuencia de 164 residuos —ni siquiera un péptido o proteína de larga longitud— pueda ser obtenida con la misma facilidad.
Esto tampoco significa que la purificación y la caracterización estructural sean innecesarias.
El estudio muestra más bien qué resultados se pueden lograr gracias a un sistema cuidadosamente diseñado para moléculas seleccionadas adecuadamente.
La automatización controla la ejecución del proceso.
Sin embargo, no es capaz de convertir la química inadecuada en la adecuada.
Por eso, la eficiencia de la maquinaria, la secuencia del péptido y el comportamiento de la propia molécula deben analizarse conjuntamente.
¿Cómo se forman los contaminantes típicos?
Durante el SPPS pueden existir varias vías diferentes que conducen a la formación de contaminantes. La comprensión de estas vías ayuda a explicar por qué los análisis finales siguen siendo necesarios.
Una secuencia de deleción o un producto abreviado puede producirse cuando la unión prevista del aminoácido no tenga éxito o cuando el crecimiento de la cadena se detenga. Debido a que la cadena incorrecta puede seguir unida a la resina, el lavado posterior no tiene que eliminarla.
La epimerización implica un cambio en la configuración estereoquímica del centro correspondiente. Esto tiene una importancia analítica particular, ya que un epímero puede tener la misma masa molecular nominal que el péptido propio, pero al mismo tiempo presentar una configuración espacial diferente.
Los productos relacionados con el aspartimid pueden formarse como resultado de reacciones secundarias dependientes de la secuencia, que incluyen los residuos de aspartina. Dependiendo del curso químico, puede producirse más de un tipo de este producto.
La eliminación incompleta de los grupos protectores ocurre cuando el grupo que debe eliminarse permanece unido a la molécula. El péptido puede, por tanto, tener la longitud de cadena nominalmente esperada, pero aún así presentar una estructura química incorrecta.
Las modificaciones relacionadas con la desacetilación pueden ocurrir durante la liberación final del péptido o durante la eliminación de los grupos protectores. Por lo tanto, la formación correcta de la cadena no garantiza que el péptido pase por el proceso de desacetilación sin cambios.
Las reacciones incompletas relacionadas con la agregación pueden, sin embargo, ocurrir cuando los cadenas formadas interactúan entre sí de manera que limite el acceso a los sitios reactivos. Introducir una cantidad suficiente de reactivo en el recipiente de reacción no garantiza que cada sitio reactivo esté físicamente accesible y que se produzca la reacción correspondiente.
Son posibles vías de formación de contaminantes.
Esto no significa que cada partido que se reciba mediante la metodología SPPS debe contener todos los tipos de irregularidades mencionados.
Su importancia en una síntesis específica se determina basándose en el conocimiento del proceso, en los análisis analíticos y en un control de calidad adecuado.
Los péptidos naturales compuestos requieren algo más que la reconstrucción de una secuencia.
Algunos péptidos son estructuralmente mucho más complejos de lo que resultaría de la propia secuencia lineal de aminoácidos.
Un buen ejemplo es la epidermina.
La caracterización estructural de la epidermis reveló la presencia de muchos anillos que contienen azufre y de restos poco habituales. [11]
Solo la reconstrucción de la secuencia lineal de aminoácidos no sería, por sí mismo, una prueba suficiente de que se haya obtenido una epidermina madura auténtica.
Esta distinción es importante durante la interpretación de publicaciones o búsquedas relativas a la síntesis de la epidermis en fase estable.
La publicación puede describir un precursor lineal, un fragmento, un análogo o otra estructura relacionada, en lugar de la síntesis completa verificada de una molécula madura completa.
La publicación estructural citada aquí como [11] describe la caracterización de la propia epidermis; no es un informe sobre su síntesis total mediante el método SPPS.
Por lo tanto, los argumentos sobre la síntesis total deben ser evaluados en relación con la estructura final real de la molécula, y no únicamente con su secuencia lineal de aminoácidos.
La productividad, la pureza y la identidad deben presentarse por separado.
Tres conceptos que a menudo se confunden en los debates sobre la síntesis de péptidos son la eficiencia, la pureza y la identidad.
La gran cantidad de producto recuperado no significa necesariamente que la mayoría de este material sea el péptido deseado. El material crudo puede contener cantidades significativas de contaminantes.
Una pureza cromatográfica tan alta no confirma automáticamente todos los aspectos de la identidad estructural.
Incluso un péptido cuya estructura química se ha caracterizado con precisión no obtiene automáticamente una aplicación biológica, terapéutica o clínica confirmada.
Son cuestiones distintas.
Un relato preciso de la síntesis debería indicar qué era la molécula objetivo, en qué etapa se midió la eficiencia, si el material analizado era crudo o purificado y qué datos analíticos se utilizaron para confirmar las afirmaciones sobre la estructura.
Gracias a esto, los resultados de la síntesis pueden interpretarse y compararse de una manera más confiable.
No se debe convertir un valor porcentual o una cantidad en masa en una declaración general de que el péptido es de „alta calidad” sin conocer lo que realmente se ha medido.
Preguntas más frecuentes
1. ¿Por qué se utiliza la fase constante en SPPS?
La fase fija retiene el péptido en el soporte, mientras que los reactivos solubles, los productos secundarios de la reacción y los disolventes de lavado pueden ser introducidos y eliminados repetidamente. Esto simplifica significativamente la formación repetida de la cadena y permite la automatización de la síntesis de péptidos, como lo demuestran las modernas metodologías de síntesis automatizada de flujo continuo. [10] Sin embargo, el soporte no garantiza que cada reacción se lleve a cabo de forma perfecta ni separa el enlace incorrectamente formado con la resina del correcto. Su principal ventaja es la mejora en la gestión del proceso. La selectividad química, la integridad de la reacción, la pureza y la identidad estructural siguen siendo objeto de una evaluación independiente.
2. ¿La síntesis en fase sólida elimina la necesidad de purificación?
No. Las cadenas peptídicas incorrectas pueden permanecer unidas a la resina durante la síntesis y luego ser liberadas junto con el producto deseado. Estudios que analizaron el SPPS crudo utilizando cromatografía y espectrometría de masas muestran que el lavado durante la síntesis y la purificación final cumplen funciones diferentes. [9] El lavado elimina principalmente los componentes solubles que rodean la resina, mientras que la purificación después de la separación tiene como objetivo separar el péptido deseado del péptido no deseado y los componentes no peptídicos. El SPPS simplifica las operaciones intermedias pero no garantiza la pureza final.
3. ¿Significa la „fase fija” que no se utiliza ningún disolvente?
No. En un SPPS convencional, el vehículo insoluble suele estar rodeado por reactivos y disolventes líquidos. Los disolventes afectan al entorno físico de la resina, incluyendo el grado de hinchamiento y la facilidad con la que los reactivos pueden llegar a las cadenas unidas. Estudios experimentales han demostrado que el hinchamiento de las resinas depende del solvente y que estos cambios están relacionados con la química del ligante, el grado de reticulación y el alargamiento de las cadenas.[2] Por lo tanto, la resina y el disolvente juntos forman un entorno de reacción.
4. ¿En qué dirección crece el péptido durante la SPPS?
La SPPS convencional generalmente construye un péptido a partir de su resto C terminal hacia el extremo N. El primer aminoácido que debe formar el extremo C de la molécula final se une al soporte, mientras que las siguientes unidades prolongan el extremo amino terminal expuesto. Los métodos publicados basados en Fmoc muestran este patrón típico. [1] Sin embargo, existen estrategias especializadas que utilizan una fase fija y que pueden funcionar de manera diferente.
5. ¿Significan la resina y el adhesivo lo mismo?
No. La resina es un vehículo insoluble, mientras que el ligando es una unión química entre el vehículo y el péptido en crecimiento. La funcionalidad del ligando puede, independientemente del propio polímero, influir en la unión, el comportamiento de la resina y la posterior liberación del péptido. Los estudios sobre los vehículos utilizados en la síntesis de péptidos muestran que el propio término para describir el tipo de resina puede no ser suficiente para describir el comportamiento de todo el sistema. [2]
6. ¿Aumenta siempre el grado de reticulación de la resina la producción?
No. Una carga más alta significa un mayor número de sitios de unión potenciales para una determinada cantidad de soporte, pero no tiene por qué conducir a una mayor cantidad de péptido bien formado y recuperable. El grado de ligación puede alterar el entorno molecular local y se ha indicado experimentalmente como uno de los factores que afectan a la reticulación de la resina. [2] Si los cadenas unidas están demasiado juntas o interactúan fuertemente entre sí, la disponibilidad de sitios reactivos puede deteriorarse. Por lo tanto, la carga debe analizarse junto con las propiedades de la resina, el comportamiento de la secuencia, la eficiencia de la reacción y la calidad del producto final.
7. ¿Por qué los aminoácidos se protegen durante la formación del péptido?
Los grupos protectores impiden temporalmente que los grupos reactivos elegidos participen en las reacciones mientras se forma un enlace específico. Esto permite una formación de cadena controlada y gradual. Sin embargo, la protección no elimina todas las reacciones secundarias. Los estudios en sistemas modelares han demostrado, por ejemplo, que la estrategia de los grupos protectores y la secuencia circundante pueden influir en la formación de aspartimidina. [5] Los grupos protectores proporcionan así selectividad química, pero toda la estrategia de protección y desprotección sigue requiriendo un plan cuidadoso y una evaluación.
8. ¿Qué significa la protección ortogonal de grupos funcionales?
La ortogonalidad implica la posibilidad de eliminar un grupo protector en condiciones que dejan otros mecanismos de protección necesarios suficientemente intactos. Esto permite revelar ciertos sitios reactivos en los pasos de síntesis planificados. Las metodologías SPPS consolidadas se basan en la protección y desprotección controladas, en lugar de revelar simultáneamente todos los grupos reactivos. [1] Sin embargo, la verdadera conformidad de los mecanismos de protección utilizados sigue dependiendo de la molécula objetivo y de las condiciones de reacción.
9. ¿Significan Fmoc y Boc diferentes tipos de péptidos?
No. Fmoc y Boc son grupos protectores y las estrategias sintéticas asociadas con ellos, no son distintos tipos de estructura peptídica. Las diferencias en la química de su eliminación afectan el modo en que se lleva a cabo la síntesis, pero la química protectora temporal no debe confundirse con la estructura final del péptido objetivo. Los métodos publicados basados en Fmoc muestran uno de los variantes más ampliamente utilizados de SPPS, pero esto no significa que todo péptido debe ser obtenido mediante esta metodología. [1]
10. ¿Puede ya el primer paso del proceso de conexión provocar contaminación?
Sí. La etapa de adición puede afectar la calidad estereoquímica incluso antes de que comience la prolongación múltiple del enlace. Se han desarrollado métodos analíticos diseñados específicamente para la detección de la racemización durante la adición de aminoácidos protegidos a las resinas. [3] Esto no significa que cada adición produzca una racemización significativa. Sin embargo, indica que el propio enlace es un paso químico importante durante el cual pueden producirse cambios cuantificables que deben tenerse en cuenta en la evaluación general de la calidad.
11. ¿Por qué algunas secuencias peptídicas se consideran difíciles de analizar?
Algunos cadenas peptídicas en crecimiento interactúan entre sí o con cadenas adyacentes de manera que restringen el acceso a los sitios reactivos. Las uniones hidrófobas, los efectos hidrofóbicos y los comportamientos que recuerdan la agregación pueden dificultar la posterior unión. Los estudios de secuencias susceptibles a la agregación muestran que el cambio en la forma de la unión puede influir en la composición del producto final. [4] La dificultad de la síntesis depende por tanto de las propiedades de la molécula y de los parámetros de la reacción, y no solo de la longitud del péptido.
12. ¿La síntesis más rápida siempre significa un producto mejor?
No. La velocidad de síntesis y la calidad del producto son parámetros separados. El calentamiento, la asistencia con microondas y la automatización pueden acortar el tiempo de proceso, pero acelerar la reacción también puede alterar el equilibrio entre las reacciones deseadas y las reacciones secundarias. Los estudios sobre la síntesis asistida por microondas han demostrado una dependencia del tipo de racemate residual y de la formación de aspartimida, lo que indica la necesidad de un control adecuado de las condiciones. [7] Un tiempo de síntesis más corto es beneficioso solo cuando el material obtenido cumple también los criterios químicos y analíticos requeridos.
13. ¿Significa la desincrustación simplemente eliminar las partículas de la resina?
No. La depéptilización es un proceso químico que conduce a la ruptura del enlace diseñado entre el péptido y el vehículo. La eliminación de los gránulos de resina mediante filtración, por otra parte, es una operación que los separa físicamente y en sí misma no confirma el curso correcto de la química de la depéptilización. La liberación del péptido puede ocurrir simultáneamente con la eliminación de grupos protectores y otras reacciones. Los estudios de los agentes de eliminación utilizados durante la depéptilización muestran que esta etapa puede influir en el perfil de contaminantes.[8]
14. ¿Significa la alta eficiencia del producto bruto una alta pureza del péptido?
No. La pureza describe la cantidad de material recuperado antes de la eliminación de todos los componentes no deseados. Este material puede contener el péptido objetivo junto con secuencias de deleción, estructuras modificadas, grupos protectores remanentes y otras impurezas. Los estudios de las mezclas de SPPS crudas utilizando cromatografía y espectrometría de masas muestran por qué la masa recuperada, la pureza y la identidad molecular requieren una interpretación independiente.[9] Por lo tanto, una pureza reportada fielmente debería indicar el paso en el que se midió y si el material ya había sido purificado.
15. ¿El SPPS permite obtener cadenas peptídicas largas?
Sí. Los métodos SPPS cuidadosamente desarrollados pueden permitir obtener cadenas muy largas. En los estudios de síntesis automatizada por flujo, se obtuvieron cadenas que contenían hasta 164 restos, que luego se purificaron y plegaron antes de la evaluación funcional. [10] Esto muestra las posibilidades de la síntesis peptídica moderna, pero no significa que cualquier secuencia de longitud similar pueda obtenerse con la misma eficiencia. La longitud es solo uno de los factores; también influyen la agregación dependiente de la secuencia, las reacciones secundarias, los requisitos de plegado y la dificultad de la purificación.
16. ¿Significa la construcción de una secuencia epidérmica llevar a cabo su síntesis completa?
No. La epidermis madura contiene elementos estructurales atípicos, incluidos anillos de azufre que se extienden más allá de la secuencia lineal de aminoácidos. Esto se ha demostrado en estudios estructurales.[11] Por lo tanto, obtener una secuencia lineal, precursor o fragmento no implica automáticamente la síntesis de una molécula madura completa. La afirmación de una síntesis completa requiere datos analíticos que confirmen la replicación de los enlaces deseados y otros elementos estructurales esenciales.
17. ¿La masa molecular esperada confirma la estructura en su totalidad?
No. Obtener la masa molecular esperada proporciona información valiosa, pero la masa por sí sola no confirma todos los aspectos de la estructura del péptido ni elimina todas las impurezas relevantes. Dos moléculas pueden tener la misma masa nominal aunque tengan diferentes estereoquímica o una disposición estructural específica. Los estudios que involucran la separación de péptidos epímeros muestran por qué las diferencias estereoquímicas pueden requerir métodos analíticos capaces de distinguir estructuras que no pueden ser distinguidas únicamente por la medición de la masa.[12] Por lo tanto, la caracterización final debe diseñarse teniendo en cuenta las impurezas reales y las estructuras alternativas que puedan surgir durante una determinada síntesis.
Resumen
La síntesis de péptidos en fase sólida modificó la química de los péptidos, permitiendo mantener la cadena en crecimiento en un soporte insoluble durante la introducción repetida, la reacción y la eliminación de los reactivos solubles. Esto facilita la construcción gradual de las secuencias y constituye una base práctica para la síntesis automática.
La aparente simplicidad de esta metodología no debería, sin embargo, ocultar la complejidad que se produce en cada etapa.
La resina, el ligando y el grado de polimerización influyen en las propiedades ambientales de la síntesis. El encolado dependiente del disolvente afecta al acceso a las cadenas relacionadas con la resina. Los grupos protectores controlan qué grupos funcionales pueden reaccionar, mientras que las reacciones de unión construyen el esqueleto peptídico de la molécula. [1] [2]
Cada uno de estos pasos también tiene sus limitaciones.
La adición inicial puede influir en la calidad estereoquímica. [3] Las secuencias difíciles pueden agrupar y restringir el acceso a los reactivos. [4] La química de protección y eliminación de grupos protectores puede favorecer las reacciones secundarias, como la formación de aspartimidina. [5] [6] Las condiciones aceleradas de síntesis pueden alterar el grado de racemización o el perfil de contaminantes. [7] Las condiciones de desacetilación pueden influir adicionalmente en la composición del producto bruto. [8]
Por lo tanto, la construcción correcta del enlace no es equivalente a obtener un péptido puro y correctamente identificado.
La recuperación del producto bruto, la purificación y la caracterización estructural siguen siendo etapas independientes. La cromatografía puede proporcionar información sobre la composición de la mezcla y la pureza, mientras que la espectrometría de masas y otros métodos analíticos proporcionan información sobre la identidad. Ninguno de los resultados analíticos individuales tiene que confirmar todos los aspectos de la estructura del péptido. [9] [12]
La síntesis de flujo automatizada moderna muestra que con condiciones adecuadamente diseñadas, el SPPS se puede utilizar incluso para cadenas muy largas. [10] Al mismo tiempo, los péptidos estructuralmente complejos, como la epidermina, muestran por qué la propia replicación de una secuencia de aminoácidos lineal puede no ser suficiente si la molécula madura contiene anillos adicionales, restos inusuales o un cierto patrón de enlaces. [11]
Es mejor entender la SPPS no como una sola reacción, sino como una secuencia de etapas químicas y analíticas distintas.
La unión marca el punto de partida. Los ciclos repetidos de protección, desprotección y unión construyen un anillo planificado. La desprotección libera el producto. La purificación separa la molécula objetivo de los componentes no deseados. La caracterización final permite determinar si el material aislado realmente tiene la estructura y la calidad que se le atribuye.
La separación de estos pasos permite evitar varias confusiones comunes: la síntesis exitosa no confirma automáticamente la pureza, la alta rendimiento no confirma automáticamente la identidad, y la masa molecular esperada por sí sola no prueba la integridad estructural completa.
Referencias
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