Vad är Semax farmakokinetik?: halveringstid, biotillgänglighet och verkanstid

Farmakokinetik är ett vetenskapsområde som studerar vad som händer med ett ämne i kroppen – hur det tas upp, vart det tar vägen, hur det bryts ned och hur länge det förblir aktivt. För Semax är den bilden mer komplex än en enkel mätning av hur länge det stannar i blodet.

Semax är ett syntetiskt heptapeptid – en artificiellt framställd kedja av sju aminosyror. Dess struktur var avsiktligt utformad för att vara mer resistent mot nedbrytning än det naturliga hormonfragmentet som det baserades på. En kort, tre-aminosyror lång svans, kallad Pro-Gly-Pro, lades till i slutet av molekylen just för att förlänga peptidets biologiska aktivitetstid i kroppen.

För att fullt ut förstå Semax beteende över tid analyserade forskarna dess absorption, hur snabbt det nådde hjärnan, nedbrytningsmekanismer, metaboliters aktivitet och den faktiska varaktigheten av effekterna. Varje av dessa element utgör en farmakokinetisk profil som är betydligt mer komplex än vad en enskild siffra för halveringstid skulle antyda.

Det bör noteras att nästan all tillgänglig farmakokinetisk data kommer från djurstudier – främst på råttor – med användning av radioaktivt märkta versioner av peptiden för att spåra dess väg i kroppen. Direkta farmakokinetiska mätningar hos människor är mycket begränsade.

Hur Semax absorberas och hur snabbt det når hjärnan?

Semax når hjärnan extremt snabbt efter intranasal administrering. I studier på råttor med användning av en radioaktivt märkt version av peptiden kunde Semax påvisas i hjärnvävnaden redan efter 2 minuter vid en nasal dos på 50 mikrogram per kilogram kroppsvikt [1]. Cirka 80% av den substans som nådde hjärnan så tidigt utgjordes av oförändrat, ursprungligt Semax, och inte av dess metaboliska fragment [1]. Detta bekräftar att själva modermolekylen – och inte bara dess nedbrytningsprodukter – snabbt och i betydande mängder når hjärnan.

Att nå hjärnan så snabbt är möjligt eftersom näsan ger en direkt väg till hjärnan via den olfaktoriska banan – ett nervnätverk ansvarigt för luktsinnet. Denna bana kringgår helt blodcirkulationen och blod-hjärnbarriären, vilket gör att nässprayade peptider kan nå hjärnvävnaden betydligt mer effektivt än via andra administreringsvägar.

Semax biologiska effekter inträffar lika snabbt som dess omedelbara penetration av hjärnan. Förändringar i aktiviteten hos neurotrofiska gener – gener som ansvarar för produktionen av proteiner som stöder tillväxt och överlevnad av hjärnceller – kunde detekteras i råttans hippocampus och frontala cortex redan 20 minuter efter en enskild intranasal dos [2]. Hos friska frivilliga visade hjärnavbildningsstudier med vilande funktionell MR – en teknik som mäter hjärnaktivitet genom förändringar i blodflödet – mätbara förändringar i hjärnnätverkens aktivitet redan efter 5 och 20 minuter efter intranasal administrering av Semax [3]. Detta utgör direkta bevis från studier på människor att Semax engagerar centrala nervsystemet inom några minuter efter intranasal administrering.

Vad är halveringstiden för Semax?

Halveringstiden för Semax som en intakt molekyl i kroppsvätskor är relativt kort – som för de flesta peptider – men den totala biologiska aktiviteten sträcker sig långt bortom denna punkt. Halveringstid är den tid det tar för hälften av ett ämne att brytas ned eller elimineras från kroppen.

I laboratoriestudier som analyserade nedbrytningen av Semax i närvaro av rått hjärnans cellmembranmaterial hade den intakta molekylen en halveringstid på över en timme [4]. Detta är tydligt längre än för många naturliga hjärnsignalpeptider, som kan brytas ner inom sekunder till minuter.

I blodet och serumet från råttor har forskare identifierat enzymer som är ansvariga för nedbrytningen av Semax. De viktigaste av dessa är aminopeptidaser – särskilt känsliga för en förening som kallas bestatin – och ett enzym som kallas angiotensinkonverterande enzym (ACE). Dessa enzymer är ansvariga för större delen av den Semax-nedbrytande aktiviteten i blodet [5]. Processen börjar vid N-terminalen av molekylen – början av aminosyrakedjan – där de första två aminosyrorna, metionin och glutamat, avskiljs först och bildar mellanprodukter som i sig själva förblir biologiskt aktiva [5].

Det är värt att tydligt betona en avgörande faktor: ingen publicerad farmakokinetisk studie på människor har fastställt det exakta halveringstiden för Semax i humant plasma. De värden som anges i icke-specialiserade internetkällor kommer inte från granskade vetenskapliga studier och bör därför hanteras med försiktighet. Vad den publicerade vetenskapliga litteraturen bekräftar är att den oförstörda molekylen sönderfaller relativt snabbt i biologiska vätskor, att dess huvudnedbrytningsprodukter behåller sin egen biologiska aktivitet, och att den totala farmakologiska verkanstiden för Semax är betydligt längre än vad enbart elimineringen av modersubstansen skulle antyda.

Hur metaboliseras Semax?

Semax metaboliseras – bryts ned – främst genom en stegvis process där enzymer successivt klipper bort aminosyror från den N-terminala änden av kedjan. Viktigt är att denna nedbrytning inte bara innebär en inaktivering av Semax. Istället produceras en serie mindre fragment, som var och en bibehåller sin egen biologiska aktivitet.

Den huvudsakliga metaboliska vägen ser ut så här: enzymer som kallas dipeptidylaminopeptidaser och aminopeptidaser spjälkar först bort de två N-terminala aminosyrorna – metionin och glutamin – från Semax-molekylen. Detta ger ett femaminosyrafragment, HFPGP (His-Phe-Pro-Gly-Pro), som är en primär nedbrytningsintermediär. HFPGP spjälkas sedan vidare till ett trimer av aminosyror, PGP (Pro-Gly-Pro), som är den primära slutprodukten av metabolismen [4], [6].

Studier med radioaktivt märkt Semax har bekräftat att HFPGP och PGP är de huvudsakliga nedbrytningsprodukterna. Mönstret för metabolitbildning skiljde sig något mellan gliaceller – stödjeceller i hjärnan – och neuroner, vilket tyder på att olika celltyper bearbetar Semax på ett något annorlunda sätt [6].

Jämförande studier av nedbrytning i näsvävnad, hjärnmikrosomfraktioner och blod hos råttor visade att C-terminala PGP-fragmentet – molekylens svans – är betydligt mer resistent mot enzymatisk nedbrytning än det N-terminala fragmentet som härrör från ACTH. Detta innebär att enzymatiska attacker främst sker från molekylens framsida, medan dess bakre del förblir relativt stabil [7].

Forskare undersökte också modifierade versioner av Semax för att förstå vad som gör det känsligt för nedbrytning. Ersättning av N-terminal metionin med alanin, glycin eller treonin gav Semax-analoger som var mer resistenta mot enzymatisk nedbrytning än originalet [8]. Dessutom visade en Semax-version med en kemisk modifiering kallad acetylering vid N-terminaländen – känd som Ac-Semax – ett modifierat nedbrytningsmönster och andra biologiska egenskaper, även om den inte förbättrade cellskyddet mot kopparinducerad toxicitet [9].

Konceptet synakton är nödvändigt för att förstå varför Semax metabolism har farmakologisk betydelse. Den metabola kaskaden från Semax till HFPGP till PGP innebär inte enkel inaktivering – den genererar en sekvens av biologiskt aktiva molekyler. Var och en av dessa interagerar med överlappande men distinkta bindningsställen på nervcellernas yta [10]. Av alla undersökta nedbrytningsfragment visade HFPGP, den första och viktigaste nedbrytningsprodukten, den starkaste förmågan att konkurrera om samma bindningsställen som den ursprungliga Semax-molekylen [10]. Detta innebär att när Semax elimineras från systemet, tar dess första nedbrytningsprodukt effektivt över dess funktion, vilket förlänger den totala tiden för farmakologisk verkan.

Vad är biotillgängligheten av Semax vid olika administreringsvägar?

Biotillgänglighet definierar hur stor mängd av ett administrerat ämne som faktiskt når målet i aktiv form. För Semax är administrationsvägen av stor betydelse – inte bara för mängden som når hjärnan, utan också för vilka effekter som framkallas.

Nasal administrering – tillförsel via näsan – är både kliniskt standardiserad och farmakokinetiskt det mest effektiva sättet att leverera Semax till hjärnan. Som beskrivs ovan, transporterar denna väg Semax direkt till hjärnan via de olfaktoriska banorna, och kringgår helt blodcirkulationen.

Direkta farmakokinetiska jämförelser mellan intranasal och subkutan administrering i kontrollerade studier är begränsade i litteraturen. Beteende- och farmakodynamiska studier – som mäter faktiska effekter snarare än blodnivåer – ger dock indirekt information. Studier som jämför intraperitoneal injektion med intranasal administrering har visat att den intranasala vägen var mer effektiv för att förbättra inlärning i minnesuppgifter, medan intraperitoneal injektion behövdes för att inducera smärtlindrande effekter som inte uppnåddes med intranasal administrering [11].

Den gestionsberoende skillnaden i effekter antyder att båda metoderna ger olika mönster av distribution i kroppen. Intranasal administrering tenderar till höga koncentrationer i hjärnan, medan injektion ger en bredare systemisk distribution, som även når perifera vävnader och receptorer utanför hjärnan [11]. De bättre kognitiva effekterna av intranasal Semax jämfört med injektion överensstämmer med data om snabb hjärnpenetration, vilka bekräftar detekterbara nivåer i hjärnan redan 2 minuter efter intranasal administrering [1].

När det gäller oral administrering – förtäring av Semax – finns det inga publicerade farmakokinetiska studier som har undersökt dess absorption från mag-tarmkanalen. Med tanke på att peptider generellt snabbt bryts ner av matsmältningsenzymer i magsäcken och tarmarna innan de hinner absorberas, är biotillgängligheten av en intakt Semax-molekyl efter oral administrering sannolikt försumbar utan specialiserade skyddande leveranssystem. C-terminala PGP-fragmentet kan uppvisa en viss förmåga att överleva matsmältningen på grund av den kända stabiliteten hos denna klass av peptider, men detta har inte direkt bekräftats i publicerade studier [12].

Hur länge varar effekterna av Semax?

Effekternas varaktighet av Semax varierar avsevärt beroende på den observerade effekten. Det sträcker sig från några timmar för akuta förändringar i neurotransmittoraktivitet, till flera dagar eller till och med veckor för effekter som medieras av neurotrofiskt signalering och förändringar i genuttryck.

När det gäller neurotransmittoreffekter förblev de extracellulära nivåerna av 5-HIAA – ett nedbrytningsprodukt av serotonin som återspeglar aktiviteten i serotoninsystemet – förblev förhöjda till cirka 180% av utgångsvärdet under 1–4 timmar efter en engångsinjektion av Semax hos råttor [13]. Detta tyder på en bestående neurokemisk effekt som kvarstår i flera timmar efter en engångsdos.

När det gäller neurotrofiska effekter – som rör BDNF och NGF, proteiner som stödjer tillväxt och överlevnad av hjärnceller – är bilden mer dynamisk. Förändringar i BDNF-genens aktivitet visade sig redan 20 minuter efter intranasal administrering hos råttor, nådde signifikanta nivåer efter 90 minuter och återgick till cirka baslinjenivåer cirka 8 timmar efter administrering i hippocampus. Hjärnbarken uppvisade ett något annorlunda tidsmässigt mönster [2].

Men BDNF:s effekter upphör inte när BDNF-nivåerna återgår till utgångsvärdena. BDNF fungerar genom att aktivera sin receptor – TrkB – som sedan initierar en kaskad av signalprocesser inuti cellen. Dessa processer för vidare signalering varar betydligt längre än själva perioden med förhöjda BDNF-nivåer.

Hos patienter efter ischemisk stroke som behandlades med Semax observerades förhöjda nivåer av BDNF i plasma under hela studieobservationstiden, vilket tyder på att upprepad dosering ger en ihållande neurotrofisk ökning, snarare än en serie kortvariga toppar [14]. Tidigare rysk klinisk litteratur har också rapporterat att Semax effekter på kognitiva funktioner och motståndskraft mot hypoxi hos människor kvarstod i 20–24 timmar efter en enskild intranasal dos på 0,015–0,050 mg/kg [15]. Denna verkningstid överskrider avsevärt vad som kan förväntas baserat på farmakokinetiken av den intakta molekylen i blodet, och återspeglar neurotrofiska och genetiska mekanismer som överlever de direkta receptorinteraktionerna med peptiden.

Ackumuleras Semax i kroppen vid regelbunden användning?

Inga publicerade studier har direkt undersökt huruvida Semax ackumuleras i vävnader, eller om dess receptorer blir okänsliga – det vill säga mindre responsiva med tiden – vid regelbunden användning. Baserat på tillgängliga bevis verkar Semax dock inte orsaka den progressiva ackumulering som observeras med många småmolekylära läkemedel som långsamt elimineras.

Som en peptid genomgår Semax snabb enzymatisk nedbrytning i biologiska vätskor. Denna nedbrytningsprofil gör det farmakokinetiskt osannolikt att den ackumuleras i märkbara mängder i vävnader vid regelbunden administrering. Vid studier av kronisk administrering till råttor under 10–14 dagar observerades ihållande och progressiva beteendeeffekter – inklusive minskad ångest och antidepressiva effekter – utan tecken på tolerans eller avtagande respons över tid. Författarna tillskrev dessa kvarstående effekter ökade serotonerga signaler och ihållande ökningar av BDNF [16].

I kliniska studier av stroke bibehöll upprepad administrering av Semax under två tio dagar långa behandlingsperioder förhöjda plasmanivåer av BDNF under hela observationsperioden, vilket överensstämmer med ett ihållande farmakologiskt engagemang snarare än receptor-desensitisering eller trofisk utarmning [14].

Man har också undersökt en formulering av Semax baserad på fosfolipidnanopartiklar – ett leveranssystem som omsluter peptiden med små fettmolekyler och skyddar den från nedbrytning – som en strategi för att ytterligare förlänga resistensen mot enzymatisk nedbrytning [17]. Detta tillvägagångssätt skulle teoretiskt kunna förändra den farmakokinetiska profilen genom att sakta ner nedbrytningen och behålla aktivt Semax i vävnader under en längre tid. Inga kliniska farmakokinetiska data för denna formulering har dock publicerats hittills.

Sammantaget, även om bristen på formella studier av ackumulering är en erkänd begränsning, tyder tillgängliga funktionella data inte på progressiv ackumulering eller utveckling av tolerans vid kortvarig regelbunden administrering.

Semax farmakokinetiska studiers avgörande begränsningar

Vid tolkning av tillgängliga farmakokinetiska data för Semax är det viktigt att beakta flera betydande begränsningar.

För det första kommer så gott som alla direkta farmakokinetiska mätningar – inklusive hastighet för hjärnpenetration, uppskattade halveringstider och identifiering av metaboliter – från råttstudier med radioaktivt märkta peptider. Direkta överföringar av dessa resultat till human farmakokinetik är förenade med betydande osäkerhet, eftersom människor och råttor kan metabolisera föreningar på olika sätt.

För det andra har inga publicerade farmakokinetiska studier på människor mätt Semax-koncentrationer i blodet över tid under kontrollerade förhållanden. Detta innebär att de exakta värdena för halveringstid hos människor, procentuell biotillgänglighet och distributionsvolym – ett mått på hur brett en substans sprids i kroppens vävnader – förblir okända.

För det tredje, eftersom Semax nedbrytningsprodukter – HFPGP och PGP – behåller sin egen biologiska aktivitet, underskattar konventionella farmakokinetiska bedömningar baserade enbart på modermolekylkoncentrationer avsevärt den faktiska biologiska verkanstiden. Att enbart mäta Semax i blodet ger en ofullständig bild av den faktiska varaktigheten av de farmakologiska effekterna.

För det fjärde tyder skillnader i semaxets effekter, beroende på administrationsväg, på att dess farmakokinetiska beteende skiljer sig signifikant mellan intranasal, intraperitoneal och subkutan administrering. Dessa skillnader har ännu inte fullständigt karakteriserats i publicerad litteratur.

Framtida forskning med användning av moderna analytiska tekniker – som LC-MS/MS, en mycket känslig metod för att mäta specifika molekyler i biologiska vätskor – utförd på människor med olika administreringsvägar skulle avsevärt utöka den vetenskapliga förståelsen av Semax farmakokinetik.

Varning

Denna artikel är endast avsedd för utbildnings- och informationssyften och ska inte tolkas som medicinsk rådgivning, diagnos, behandlingsrekommendation eller påstående om Semax effektivitet för att behandla något medicinskt tillstånd. Semax är fortfarande en experimentell förening i de flesta länder, inklusive USA och de flesta europeiska länder, och är inte godkänd av Food and Drug Administration (FDA) eller European Medicines Agency (EMA) för behandling av något medicinskt tillstånd. Det är godkänt och används kliniskt i Ryssland och vissa länder i Östeuropa. Majoriteten av bevisen som presenteras i denna artikel kommer från prekliniska djurstudier och ett begränsat antal kliniska studier på människor. Ytterligare, väl utformade kliniska studier behövs för att mer exakt fastställa säkerheten, effektiviteten, verkningsmekanismerna och långtidseffekterna av Semax hos människor. Alla som överväger att använda experimentella peptider bör rådgöra med en kvalificerad vårdpersonal.

Referenser

1. Shevchenko, K. V., Nagaev, I. Yu., Alfeeva, L. Yu., Andreeva, L. A., Kamenskiĭ, A. A., Levitskaia, N. G., Shevchenko, V. P., Grivennikov, I. A., & Miasoedov, N. F. (2006). Semax penetration i hjärnan och blodet hos råttor efter intranasal administrering. Bioorganisk kemi, 32(1), 64–70. https://doi.org/10.1134/s1068162006010055
2. Shadrina, M., Kolomin, T., Agapova, T., Agniullin, Y., Shram, S., Slominsky, P., Lymborska, S., & Myasoedov, N. (2010). Jämförelse av den temporala dynamiken av genuttryck för NGF och BDNF i råtthippocampus, frontala cortex och retina under Semax verkan. Journal of Molecular Neuroscience, 41(1), 30–35. https://doi.org/10.1007/s12031-009-9270-z
3. Lebedeva, I. S., Panikratova, Ya. R., Sokolov, O. Yu., Kupriyanov, D. A., Rumshiskaya, A. D., Kost, N. V., & Myasoedov, N. F. (2018). Effekter av Semax på hjärnans standardnätverk. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 165(5), 653–656. https://doi.org/10.1007/s10517-018-4234-3
4. Dolotov, O. V., Zolotarev, Yu. A., Dorokhova, E. M., Andreeva, L. A., Alfeeva, L. Yu., Grivennikov, I. A., & Miasoedov, N. F. (2004). Bindningen av Semax, ACTH 4-10 heptapeptid, till plasmamembran i basala kärnor i råttans förhjärna och dess nedbrytning. Bioorganisk kemi, 30(3), 241–246. https://doi.org/10.1023/b:rubi.0000030127.46845.f0
5. Potaman, V. N., Alfeeva, L. Y., Kamensky, A. A., Levitzkaya, N. G., & Nezavibatko, V. N. (1991). N-terminal nedbrytning av ACTH(4-10) och dess syntetiska analog semax av enzyminaktion i råttblod. Biochemical and Biophysical Research Communications, 176(2), 741–746. https://doi.org/10.1016/s0006-291x(05)80247-5
6. Zolotarev, Yu. A., Dadaian, A. K., Dolotov, O. V., Kozik, V. S., Kost, N. V., Sokolov, O. Yu., Dorokhova, E. M., Meshavkin, V. K., Inozemtseva, L. S., Gabaeva, M. V., Andreeva, L. A., Alfeeva, L. Yu., Pavlov, T. S., Badmaeva, K. E., Badmaeva, S. E., Bakaeva, Z. V., Kopylova, G. N., Samonina, G. E., Vas’kovskiĭ, B. V., Grivennikov, I. A., Zozulia, A. A., & Miasoedov, N. F. (2006). Jämnt tritiummärkt peptider och deras in vivo och in vitro nedbrytning. Bioorganisk kemi, 32(2), 183–191. PMID: 16637290 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16637290/
7. Shevchenko, K. V., V’iunova, T. V., Nagaev, I. Yu., Andreeva, L. A., & Miasoedov, N. F. (2013). Proteolys av enkla glyproliner med leucinaminopeptidas och enzymer från nossekret, hjärnhinnor och råttblod. Bioorganicheskaya Khimiya, 39(3), 320–325. https://doi.org/10.1134/s1068162013030151
8. Shevchenko, K. V., V’iunova, T. V., Nagaev, I. Yu., Andreeva, L. A., Alfeeva, L. Yu., & Miasoedov, N. F. (2011). Proteolys av semaxanaloger med olika N-terminala aminosyror av aminopeptidaser. Biologisk organisk kemi, 37(4), 475–482. https://doi.org/10.1134/s1068162011040133
9. Magrì, A., Tabbì, G., Giuffrida, A., Pappalardo, G., Satriano, C., Naletova, I., Nicoletti, V. G., & Attanasio, F. (2016). Inverkan av N-terminal acetylering av Semax, en syntetisk analog av ACTH(4-10), på koordinationen och de biologiska egenskaperna hos koppar(II) och zink(II). Journal of Inorganic Biochemistry, 164, 59–69. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2016.08.013
10. Vyunova, T. V., Andreeva, L. A., Shevchenko, K. V., & Myasoedov, N. F. (2017). Synacton och individuell aktivitet hos syntetiska och naturliga kortikotropiner. Journal of Molecular Recognition, 30(5). https://doi.org/10.1002/jmr.2597
11. Manchenko, D. M., Glazova, N. Yu., Levitskaia, N. G., Andreeva, L. A., Kamenskiĭ, A. A., & Miasoedov, N. F. (2010). Nootropa och analgetiska effekter av Semax efter olika administreringsvägar. Rossiyskiy Fiziologicheskiy Zhurnal imeni I.M. Sechenova, 96(10), 1014–1023. PMID: 21268834
12. Ashmarin, I. P., Samonina, G. E., Lyapina, L. A., Kamenskii, A. A., Levitskaya, N. G., Grivennikov, I. A., Dolotov, O. V., Andreeva, L. A., & Myasoedov, N. F. (2005). Naturliga och hybrida („kimära”) stabila regulatoriska glyprolinpeptider. Patofysiologi, 11(4), 179–185. https://doi.org/10.1016/j.pathophys.2004.10.001
13. Eremin, K. O., Kudrin, V. S., Saransaari, P., Oja, S. S., Grivennikov, I. A., Myasoedov, N. F., & Rayevsky, K. S. (2005). Semax, ett ACTH(4-10)-analog med nootropiska egenskaper, aktiverar dopaminerga och serotonerga hjärnsystem hos gnagare. Neurochemical Research, 30(12), 1493–1500. https://doi.org/10.1007/s11064-005-8826-8
14. Gusev, E. I., Martynov, M. Yu., Kostenko, E. V., Petrova, L. V., & Bobyreva, S. N. (2018). Effekten av semax vid behandling av patienter i olika stadier av ischemisk stroke. Journal of Neurology and Psychiatry named after S.S. Korsakov, 118(3), 61–68. https://doi.org/10.17116/jnevro20181183261-68
15. Ashmarin, I. P., Nezavibat’ko, V. N., Miasoedov, N. F., Kamenskiĭ, A. A., Grivennikov, I. A., Ponomareva-Stepnaia, M. A., Andreeva, L. A., Kaplan, A. Ia., Koshelev, V. B., & Riasina, T. V. (1997). En nootrop analog av adrenokortikotropin, 4-10-semax (15 års erfarenhet av dess design och studie). Journal of Higher Nervous Activity named after I. P. Pavlov, 47(2), 420–430. PMID: 9173745
16. Vilenskiĭ, D. A., Levitskaia, N. G., Andreeva, L. A., Alfeeva, L. Yu., Kamenskiĭ, A. A., & Miasoedov, N. F. (2007). Effekter av kronisk Semax-administrering på utforskande aktivitet och emotionell reaktion hos vita råttor. Rossiyskiy Fiziologicheskiy Zhurnal imeni I.M. Sechenova, 93(6), 661–669. PMID: 17850024
17. Shevchenko, K. V., Khrapko, A. P., Schwets, V. I., & Myasoyedov, N. F. (2009). Användning av fosfolipidnanopartiklar för att öka Semax-resistens i olika proteolytiska biologiska medier. Doklady Biologických Věd, 429, 505–507. https://doi.org/10.1134/s0012496609060076